血管內(nèi)皮生長因子與腫瘤負(fù)荷相關(guān)性研究

賈曉輝 郝麗麗

(吉林市第二人民醫(yī)院，吉林 130000)

腫瘤是指機(jī)體在各種致瘤因子作用下，局部組織細(xì)胞增生所形成的新生物，多呈占位性塊狀突起，且轉(zhuǎn)移和侵襲是惡性腫瘤的重要特征。惡性腫瘤已經(jīng)成為世界性的公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重危及人類的健康和生命安全。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球每年新發(fā)1 500萬惡性腫瘤病例，每年死于惡性腫瘤的患者約有900萬，其中2/3的病例發(fā)生在發(fā)展中國家[1]。我國流行病學(xué)資料顯示[2]，惡性腫瘤發(fā)病率為344.89/10萬，男性發(fā)病率高于女性，且城市發(fā)病率遠(yuǎn)高于農(nóng)村，年齡越高其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也越高，但是包括乳腺癌、宮頸癌和胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤近年來均呈現(xiàn)出年輕化趨勢。有研究顯示，惡性腫瘤發(fā)生的生理學(xué)基礎(chǔ)是新血管生成，而血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性肝素結(jié)合因子，在體內(nèi)大量合成和分泌能夠誘導(dǎo)血管新生，故推測在腫瘤患者中血清VEGF水平異常升高[3,4]。為了探討血清VEGF的表達(dá)情況與腫瘤負(fù)荷的相關(guān)性，并挖掘其可能的作用途徑，本研究特選取健康人、高危者、手術(shù)切除后無病灶者、經(jīng)治療病情穩(wěn)定者和初診患者對血清VEGF進(jìn)行定性和定量對比，并對比各組CD4+/CD8+差異，分析初診組中血清VEGF與CD4+/CD8+的相關(guān)性，詳情報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 自醫(yī)院體檢中心和腫瘤科2014年6月～2015年6月收治的健康志愿者、惡性腫瘤高危者(有惡性腫瘤家族史)、惡性腫瘤手術(shù)后無原位病灶患者、經(jīng)治療后病情穩(wěn)定的惡性腫瘤患者、初診惡性腫瘤患者各100例，分別記為對照組、高危組、手術(shù)組、穩(wěn)定組和初診組。

納入及排除標(biāo)準(zhǔn)：對照組確定為健康志愿者，高危者均具有惡性腫瘤家族史但是本人并未發(fā)現(xiàn)有惡性腫瘤，手術(shù)組均經(jīng)病理檢查證實(shí)為惡性腫瘤，且均未發(fā)現(xiàn)原位病灶，穩(wěn)定組均經(jīng)對癥支持治療后病情穩(wěn)定，維持時(shí)間≥4周，且原位病灶長徑無明顯變化，初診組均確診為惡性腫瘤，但是未接受任何抗腫瘤措施治療；排除預(yù)期生存時(shí)間<6個月者，年齡<18或>85歲者，良性腫瘤者，有藥物濫用史、吸毒史者，拒絕簽署同意書者。

1.1.2主要設(shè)備和試劑 生化管(嘉興華越醫(yī)療器械有限公司)；VEGF標(biāo)準(zhǔn)品(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；蒸餾水、洗滌液、顯色劑A和B(深證晶美生物科技有限公司)；恒溫箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(深圳市盛信康科技有限公司)；流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)。

1.2方法

1.2.1抽血送檢 用生化管抽取血液3 ml送至化驗(yàn)室，從2～8℃取出試劑盒，室溫放置(22℃)20～30 min使其回到室溫再開始檢測。

1.2.2VEGF檢測方法 ①復(fù)溫：室溫(22℃)放置20～30 min使其恢復(fù)室溫；②稀釋：先將凍干粉(VEGF標(biāo)準(zhǔn)品)用1 ml樣品溶解，調(diào)整母液濃度至800 pg/ml，再進(jìn)行倍比稀釋。倍比稀釋從高濃度到低濃度時(shí)注意要更換槍頭；③配液和加樣：將濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋；分別在孔中加入相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，滴加劑量為200 μl/孔，待檢孔先加入樣品稀釋液100 μl再加入血清樣品100 μl，混勻，蓋膜，放置于37℃溫育60 min；④洗滌和加酶溫育：扣去孔內(nèi)液體，加入稀釋洗滌液，380 μl/孔，15 s后棄去液體并在濾紙上扣干，共重復(fù)5次；加入200 μl酶標(biāo)抗體工作液，37℃避光溫育60 min；⑤洗滌和顯色：洗滌和加酶溫育：扣去孔內(nèi)液體，加入稀釋洗滌液，380 μl/孔，1 min后棄去液體并在濾紙上扣干，共重復(fù)5次。依次加入顯色劑A、B液各100 μl，混勻，37℃避光顯色10 min；⑥測定：50 μl/孔加終止液，混勻，放入酶標(biāo)儀，測定各孔OD值，波長為450/630 nm，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的吸光值在坐標(biāo)上找出對應(yīng)的濃度。按照如下公式計(jì)算血清VEGF水平：血清VEGF濃度=2×求算各孔VEGF濃度值。

1.2.3CD4+和CD8+檢測方法 采用流式細(xì)胞儀對外周血兩因子水平進(jìn)行檢測，并計(jì)算CD4+/CD8+。

1.2.4觀察指標(biāo) 對比各組血清VEGF增高率和分級情況，其中血清VEGF<142.2 pg/ml者為正常(血清VEGF<80 pg/ml者為無風(fēng)險(xiǎn)，血清VEGF≥80 pg/ml且<142.2 pg/ml者記為需復(fù)查)；血清≥142.2 pg/ml且<284 pg/ml者記為輕度升高；血清≥284 pg/ml者記為較高，其中需復(fù)查、輕度升高和較高者構(gòu)成比記為增高率。

對比各組血清VEGF水平、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平。

分析初診組血清VEGF水平與CD4+/CD8+的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1各組基線資料情況 各組性別、平均年齡以及手術(shù)組、穩(wěn)定組和初診組腫瘤類型分布基線資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。

2.2各組血清VEGF增高率和分級情況 各組血清VEGF分級比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且高危組、手術(shù)組、穩(wěn)定組、初診組血清VEGF增高率均遠(yuǎn)高于對照組(χ2=2.743、33.147、126.081、148.053，P=0.048、0.000、0.000、0.000)，手術(shù)組、穩(wěn)定組和初診組血清VEGF增高率均遠(yuǎn)高于高危組(χ2=22.427、109.974、131.273，P=0.000、0.000、0.000)，穩(wěn)定組和初診組血清VEGF增高率均遠(yuǎn)高于手術(shù)組(χ2=41.301、57.955，P=0.000、0.000)，初診組血清VEGF增高率遠(yuǎn)高于穩(wěn)定組(χ2=2.986，P=0.047)，詳見表2。

2.3各組血清VEGF、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+各組血清VEGF、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且高危組、手術(shù)組、穩(wěn)定組、初診組血清VEGF水平均遠(yuǎn)高于對照組(t=17.448、80.118、50.108、54.696，P=0.000、0.000、0.000、0.000)，而CD4+均遠(yuǎn)低于對照組(t=5.173、6.286、8.462、10.170，P=0.024、0.019、0.013、0.000)，CD4+/CD8+均遠(yuǎn)低于對照組(t=13.479、20.178、32.543、51.702，P=0.000、0.000、0.000、0.000)，手術(shù)組、穩(wěn)定組和初診組血清VEGF水平均遠(yuǎn)高于高危組(t=63.066、43.879、49.567，P=0.000、0.000、0.000)，而CD4+均遠(yuǎn)低于高危組(t=6.170、7.402、8.970，P=0.020、0.015、0.012)，CD4+/CD8+均遠(yuǎn)低于高危組(t=52.010、40.706、41.214，P=0.000、0.000、0.000)，穩(wěn)定組和初診組血清VEGF水平均遠(yuǎn)高于手術(shù)組(t=13.432、23.956，P=0.000、0.000)，而CD4+均遠(yuǎn)低于穩(wěn)定組(t=5.113、6.108，P=0.024、0.017)，CD4+/CD8+均遠(yuǎn)低于手術(shù)組(t=11.783、19.805，P=0.000、0.000)，初診組血清VEGF水平遠(yuǎn)高于穩(wěn)定組(t=10.286，P=0.000)，而CD4+均遠(yuǎn)低于穩(wěn)定組(t=6.133，P=0.021)，CD4+/CD8+均遠(yuǎn)低于穩(wěn)定組(t=9.817，P=0.000)；穩(wěn)定組和初診組CD8+水平均遠(yuǎn)高于對照組、高危組和手術(shù)組(t=7.143、6.097、5.187，P=0.009、0.011、0.020；t=8.761、6.297、5.375，P=0.007、0.009、0.012)，詳見表3。

2.4初診組血清VEGF與CD4+/CD8+相關(guān)性 經(jīng)Pearson分析可知，初診組血清VEGF與CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)(r=-0.578，P<0.05)。

表1各組基線資料

Tab.1Baselinedataofeverygroup

GroupsnGenderMaleFemaleAverageyears oldTumor typesLung cancerGastric cancerLiver cancerColorectal cancerOthersControl group10056(56.00)44(44.00)54.81±5.20-----High-risk group10053(53.00)47(47.00)53.97±5.37-----Operation group10058(58.00)42(42.00)54.20±5.6318(18.00)12(12.00)10(10.00)16(16.00)44(44.00)Stable group10055(55.00)45(45.00)54.39±5.4220(20.00)13(13.00)12(12.00)15(15.00)40(40.00)Newly diagnosed group10054(54.00)46(46.00)54.61±5.2519(19.00)14(14.00)13(13.00)14(14.00)40(40.00)

表2各組血清VEGF水平分布及增高率對比

Tab.2ComparisonofserumVEGFgradingandincreasingratesineverygroup

GroupsnNormalMildly elevatedHigherIncreasing ratesControl group10095(95.00)5(5.00)0(0.00)5(5.00)High-risk group10090(90.00)6(6.00)4(4.00)10(10.00)1)Operation group10060(60.00)25(25.00)15(15.00)40(40.00)1)2)Stable group10050(50.00)25(25.00)25(25.00)50(50.00)1)2)3)Newly diagnosed group1008(8.00)3(3.00)89(89.00)92(92.00)1)2)3)4)Z12.30810.129P0.0000.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the high-risk group,2)P<0.05;compared with the operation group,3)P<0.05;compared with the stable group,4)P<0.05.

表3各組血清VEGF、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+對比

Tab.3ComparisonofserumVEGF,CD4+,CD8+andCD4+/CD8+ineverygroup

GroupsnVEGF(pg/ml)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+Control group10052.43±7.46 33.41±2.1417.13±1.091.95±0.14High-risk group10074.38±10.131)30.26±2.051)17.29±1.121.75±0.131)Operation group100193.65±15.971)2)27.18±2.111)2)17.88±1.101.52±0.111)2)Stable group100249.87±38.691)2)3)25.40±2.071)2)3)19.69±1.031)2)3)1.29±0.101)2)3)Newly diagnosed group100312.45±46.951)2)3)4)23.11±1.781)2)3)4)21.40±1.061)2)3)4)1.08±0.121)2)3)4)F26.743396.606286.81421.454P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05；compared with the high-risk group,2)P<0.05；compared with the operation group,3)P<0.05；compared with the stable group,4)P<0.05.

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)水平下，人們對惡性腫瘤的發(fā)生機(jī)制認(rèn)識尚淺，遺傳易感性是該病發(fā)生的根本原因，物理因素、化學(xué)因素、生物因素等均可通過遺傳易感性發(fā)揮作用，引起機(jī)體免疫狀態(tài)紊亂和脫氧核糖核苷酸(DNA)損傷，可導(dǎo)致基因突變，久而久之，正常細(xì)胞便轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒赞D(zhuǎn)化細(xì)胞，最終發(fā)生癌變[5-7]。研究證實(shí)[8]，惡性腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)因素主要有致癌物質(zhì)接觸或吞入機(jī)體、不良生活習(xí)慣、不健康飲食習(xí)慣、吸煙、酗酒、不良性生活習(xí)慣等，且隨著現(xiàn)代診斷技術(shù)的不斷發(fā)展和設(shè)備的不斷更新，惡性腫瘤的檢出率越來越高。盡管部分惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率有所控制，但形勢仍然很嚴(yán)峻。目前惡性腫瘤患者的臨床治療方式主要有手術(shù)、放療、化療和中醫(yī)藥治療等，盡管均有一定的抗腫瘤效果，但是仍缺乏高效的治療方案，死亡率仍較高[9]。究其原因，除了與惡性程度較高有關(guān)外，對惡性腫瘤發(fā)生機(jī)制了解尚淺也會影響預(yù)后[10]。鑒于此，對惡性腫瘤發(fā)生的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行深入探討能夠?yàn)榕R床治療的探索提供全新的思路。

本研究中高危組、手術(shù)組、穩(wěn)定組、初診組血清VEGF增高率、血清VEGF水平均遠(yuǎn)高于對照組(P<0.05)，且手術(shù)組、穩(wěn)定組和初診組血清VEGF增高率、血清VEGF水平均遠(yuǎn)高于高危組(P<0.05)，可知血清VEGF增高率和血清VEGF水平與惡性腫瘤的發(fā)生均存在緊密關(guān)聯(lián)。腫瘤的生長依賴于新血管的生成，而VEGF作為一種重要的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移刺激因子，在新血管生成中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[11]。據(jù)毛琳研究顯示[12]，新生的腫瘤血管是腫瘤細(xì)胞增殖的必要條件，同時(shí)也是腫瘤轉(zhuǎn)移的第一路徑，能夠?yàn)槟[瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和浸潤奠定基礎(chǔ)。此研究結(jié)果在另外一項(xiàng)荷瘤小鼠的實(shí)驗(yàn)研究中也得到證實(shí)[13]，且此研究還發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤組織中VEGF蛋白相對表達(dá)量明顯高于癌旁組織和正常組織，而癌旁組織的VEGF蛋白相對表達(dá)量也顯著高于正常組織，證實(shí)VEGF表達(dá)異常升高的確與惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)。由此可以推測，腫瘤負(fù)荷很可能與VEGF存在正向相關(guān)性。

本研究結(jié)果中，各組血清VEGF分級比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，穩(wěn)定組和初診組血清VEGF增高率、血清VEGF水平均遠(yuǎn)高于手術(shù)組(P<0.05)，初診組血清VEGF增高率、血清VEGF水平均遠(yuǎn)高于穩(wěn)定組(P<0.05)，可知血清VEGF增高率和血清VEGF水平與惡性腫瘤的病情嚴(yán)重程度均存在緊密關(guān)聯(lián)。血清VEGF增高率和血清VEGF水平越高，表明機(jī)體新血管生成的病理生理活動越激烈，也就意味著惡性腫瘤患者病情越嚴(yán)重，發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲的風(fēng)險(xiǎn)越高[14]。有研究表明，血清VEGF水平會隨著惡性腫瘤的生長表現(xiàn)出明顯的變化，并不會由于原位病灶穩(wěn)定或消失靜止不變，而是能夠反映惡性腫瘤患者身體里面是否有轉(zhuǎn)移灶，是否轉(zhuǎn)移灶有加重趨勢等，證實(shí)該因子具有較高的靈敏度和特異度，能夠準(zhǔn)確反映惡性腫瘤患者的嚴(yán)重程度[15]。由此可知，血清VEGF表達(dá)情況很可能與惡性腫瘤的嚴(yán)重程度存在緊密關(guān)聯(lián)。

此外，本研究中CD4+和CD4+/CD8+水平在對照組、高危組、手術(shù)組、穩(wěn)定組和初診組中均逐漸升高，且每兩組之間的水平對比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且穩(wěn)定組和初診組CD8+水平均遠(yuǎn)高于對照組、高危組和手術(shù)組(P<0.05)，可知在健康人群和不同腫瘤負(fù)荷狀態(tài)人群中機(jī)體細(xì)胞免疫功能存在明顯的差異；初診組血清VEGF與的CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)(r=-0.578，P<0.05)，血清VEGF水平越高，CD4+/CD8+越低，反之亦然。CD4+為分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞，在免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮重要作用；CD8+與CD4+可相互調(diào)控，可分泌抑制因子，相互拮抗，并據(jù)此對免疫應(yīng)答產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，以維持免疫功能平衡[16]。在惡性腫瘤患者中惡性腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)與細(xì)胞免疫功能異常存在密切的關(guān)系。另有研究報(bào)道[17]，VEGF不僅能夠影響惡性腫瘤患者樹突狀細(xì)胞的分化與成熟，還可阻礙樹突狀細(xì)胞的抗原遞呈功能，進(jìn)而會對細(xì)胞毒性T細(xì)胞的擴(kuò)增和活化產(chǎn)生影響，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對放化療殺傷作用的敏感性下降。結(jié)合上述研究，推測在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，血清VEGF異常升高，細(xì)胞免疫功能異常減弱，可作為臨床治療的新靶點(diǎn)。

綜上所述，血清VEGF異常升高很可能意味著惡性腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加，且惡性腫瘤患者病情越嚴(yán)重，病灶越多，轉(zhuǎn)移和侵襲的風(fēng)險(xiǎn)越高，血清VEGF水平也越高，而CD4+/CD8+越低。本研究為惡性腫瘤的臨床診治提供了一個新的指標(biāo)，而是否能夠?qū)⑵渥鳛閻盒阅[瘤治療的新靶點(diǎn)應(yīng)當(dāng)作為下一步的研究方向。

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