補(bǔ)腎益氣方通過上調(diào)滋養(yǎng)細(xì)胞IDO的表達(dá)促進(jìn)母胎界面NK細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化①

楊少良 牛甜甜 李明清 王海燕

(復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合婦科,上海 200011)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Recurrent spontaneous abortion,RSA)是指連續(xù)3次或3次以上于妊娠20周以前發(fā)生流產(chǎn)，在育齡期婦女中發(fā)病率約5%[1]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因包括多個(gè)方面，除常見的父母染色體異常、抗磷脂抗體綜合征、宮腔異常等原因外，另外還有同種免疫、內(nèi)分泌及環(huán)境等因素。目前關(guān)于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的研究眾多，但是仍有約50%以上的病例病因不明，而免疫因素可能是不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的重要原因[2]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的治療主要針對危險(xiǎn)因素展開，包括胚胎植入前基因診斷、抗凝治療、內(nèi)分泌治療和免疫治療等，傳統(tǒng)的中藥治療也是不明原因流產(chǎn)患者治療的一個(gè)重要方法。

傳統(tǒng)的中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，胎兒能在母體內(nèi)正常生長發(fā)育和成熟，關(guān)鍵在于胎兒和母體相互適應(yīng)。一方面需要母體腎氣充沛、氣血充實(shí)，另外一方面需要胎兒健康，能從母體獲得足夠的能量。補(bǔ)腎益氣方由菟絲子、桑寄生、杜仲、黨參、 白芍、白術(shù)、條黃芩、蘇梗共8味藥組成，具有補(bǔ)腎健脾、益氣養(yǎng)血、固胎元的作用。在既往的研究中，補(bǔ)腎益氣方對不明原因的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者具有良好的治療作用，但具體機(jī)制仍不清楚[3,4]。本文對補(bǔ)腎益氣方治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的機(jī)制進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 免疫組織化學(xué)IDO抗體購自美國R&D公司；免疫組織化學(xué)試劑盒購自上海威奧生物科技有限公司；細(xì)胞流式抗體CD56、CD16、IDO購自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；1-甲基色氨酸(1-MT)購自Sigma-Aldrich；NK細(xì)胞分選試劑盒購自美天旎公司。顯微鏡購自日本Olympus公司;流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter公司；滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞系HTR-8/SVneo由復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖免疫研究所提供。

1.2方法

1.2.1絨毛組織收集 該項(xiàng)研究已獲復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)和認(rèn)可。所有絨毛組織標(biāo)本均獲取于2015年9月至2016年11月在復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院行人工流產(chǎn)或流產(chǎn)后刮宮的患者。經(jīng)患者知情同意后，將絨毛組織在無菌條件下置入裝有無血清高糖培養(yǎng)基的離心管中，放置于冰盒內(nèi)，并于1 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。絨毛組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋切片。外周血液樣本取自健康志愿者，用帶有肝素的針管抽取靜脈血約10 ml，用于分離NK細(xì)胞。

1.2.2外周NK細(xì)胞的分離 將外周血加入裝有淋巴細(xì)胞分離液的無菌長玻管中，外周血與淋巴細(xì)胞分離液的比例為1∶1。2 000 r/min離心20 min，吸取白膜層細(xì)胞即為外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。按照NK細(xì)胞分選試劑盒說明書的步驟分選NK細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀鑒定所得細(xì)胞的純度。

1.2.3免疫組織化學(xué) 將石蠟切片烤片，脫蠟，復(fù)水后，95℃抗原修復(fù)25 min。3%的過氧化氫孵育10 min后于4℃一抗孵育過夜。經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育后，DAB染色，結(jié)晶紫復(fù)染、返藍(lán)后與顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4含藥血清制取 將黨參12 g、菟絲子15 g、白術(shù)6 g、白芍12 g、杜仲12 g、桑寄生12 g、蘇梗 6 g、條黃芪15 g煎煮后過濾，真空抽干制成粉劑，用蒸餾水重懸后灌喂大鼠。將大鼠分為兩組，一組灌喂中藥復(fù)方，一組灌喂生理鹽水，灌喂劑量為 16 g/kg。每天灌喂1次，灌喂5 d后處死大鼠，腹主動(dòng)脈采血，分離血清，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5共培養(yǎng)體系建立 HTR-8/SVneo按5×104每孔種于24孔板中，過夜貼壁后加入不同處理因素，包括1-MT,含10%對照血清的培養(yǎng)液，含10%中藥血清培養(yǎng)液，10%中藥血清培養(yǎng)液聯(lián)合1-MT等。處理48 h后，棄去培養(yǎng)液，更換新鮮培養(yǎng)液并按1∶1細(xì)胞比例加入外周NK細(xì)胞，共培養(yǎng)48 h。

1.2.6NK細(xì)胞表面分子的檢測 收取不同處理組的NK細(xì)胞，PBS洗滌，離心，棄上清。每管加入100 μl buffer重懸，根據(jù)細(xì)胞量加入相應(yīng)量細(xì)胞流式抗體，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌后上機(jī)檢測。

2 結(jié)果

2.1復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者與正常人工流產(chǎn)孕婦絨毛組織IDO的表達(dá) 對正常人工流產(chǎn)孕婦與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示絨毛組織高表達(dá)IDO，且在胞核與胞漿中均有IDO的表達(dá)。與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者相比，正常人工流產(chǎn)孕婦絨毛組織中的IDO表達(dá)明顯較高，差異具有顯著性(圖1)。這一結(jié)果表明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中的IDO表達(dá)較正常孕婦低。

2.2含藥血清對滋養(yǎng)細(xì)胞IDO表達(dá)的影響 HTR-8/SVneo經(jīng)對照血清培養(yǎng)液和含藥血清培養(yǎng)液處理48 h后，用流式細(xì)胞儀檢測IDO的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，含藥血清培養(yǎng)的滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)較高水平的IDO。與對照組相比，中藥可以有效提高IDO陽性的滋養(yǎng)細(xì)胞比例(圖2)。

圖1 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者與正常人工流產(chǎn)孕婦絨毛組織IDO的表達(dá)Fig.1 IDO expression in recurrent spontaneous abortion patients and normal pregnant womenNote: A,D.Incubated with PBS;B,E.Incubated with mouse anti-human IDO antibody;C,F.Magnified picture of typical positive position.

圖3 滋養(yǎng)細(xì)胞對外周NK細(xì)胞表型的影響及補(bǔ)腎益氣方的調(diào)節(jié)作用Fig.3 Influence of trophoblast in phenotype of peripheral NK cells and role of Kidney-replenishing herb in this processNote: HTR-8-,1-MT- means peripheral NK cells cultured alone,HTR-8+,1-MT- means peripheral NK cells cultured with HTR-8 without 1-MT,HTR-8+,1-MT+ means peripheral NK cells cultured with HTR-8,which has been treated with 1-MT for 48 hours.Ctrl.Control serum medium;Herb.Herb serum medium;H+1-MT.Herb medium supplemented with 1-MT.NS.P>0.05;*.P<0.01；**.P<0.001;***.P<0.000 1.

圖2 含藥血清對滋養(yǎng)細(xì)胞IDO表達(dá)的影響Fig.2 Effect of Kidney-replenishing herb on expression of IDO in trophoblastsNote: A.Control serum group,IDO expression;B.Herb serum treated group,IDO expression;C.Statistical results from A and B,**.P<0.001.

2.3滋養(yǎng)細(xì)胞對外周NK細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)作用及補(bǔ)腎益氣方的調(diào)節(jié)機(jī)制 約90%外周NK細(xì)胞表達(dá)CD16,經(jīng)與HTR-8/SVneo共培養(yǎng)后，CD16的表達(dá)水平顯著下降。當(dāng)滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的IDO活性被1-MT阻斷后，NK細(xì)胞表達(dá)CD16的比例上升。提示滋養(yǎng)細(xì)胞具有誘導(dǎo)外周NK細(xì)胞向蛻膜NK細(xì)胞轉(zhuǎn)變的功能，且IDO在其中發(fā)揮了一定的作用。此外，外周NK細(xì)胞與滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)后，CD56的平均熒光密度增強(qiáng)，但1-MT對該過程無明顯影響，提示滋養(yǎng)細(xì)胞對外周NK細(xì)胞CD56的調(diào)節(jié)作用不依賴于IDO(圖3A、B)。

與對照血清組相比，中藥血清處理后的滋養(yǎng)細(xì)胞具有更強(qiáng)的抑制外周NK細(xì)胞表達(dá)CD16的功能，且這種抑制作用可以被1-MT逆轉(zhuǎn)，提示含藥血清可以通過影響滋養(yǎng)細(xì)胞IDO的表達(dá)調(diào)節(jié)外周NK細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化。同時(shí)，含藥血清組NK細(xì)胞表達(dá)的CD56較對照組高，1-MT也不能逆轉(zhuǎn)這一改變(圖3C、D)。這些結(jié)果表明滋養(yǎng)細(xì)胞以IDO依賴的機(jī)制誘導(dǎo)外周NK細(xì)胞CD16的降低，以IDO非依賴的方式誘導(dǎo)外周NK細(xì)胞CD56的升高，補(bǔ)腎益氣方可以對這一過程發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

3 討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是婦產(chǎn)科的常見疾病，因其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，且有很大一部分目前尚不能找到明確原因，治療效果仍很有限。其中，中醫(yī)藥在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的治療中起到了一定的作用。在既往的研究中，學(xué)者們對補(bǔ)腎益氣方在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)治療中的應(yīng)用進(jìn)行了探討。盧穎瑩等[5]利用溴隱亭誘導(dǎo)的流產(chǎn)大鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了補(bǔ)腎益氣方可以明顯減少黃體的退化性病理改變、降低大鼠的流產(chǎn)率、增加胚胎數(shù)。孫艷玲等[4]的研究結(jié)果表明補(bǔ)腎益氣方聯(lián)合黃體酮可以改善復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的預(yù)后，提高足月分娩率。補(bǔ)腎益氣方治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的機(jī)制還有待研究，以目前的研究結(jié)果看，一方面可能是由于補(bǔ)腎益氣方具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，可以改善機(jī)體整體及蛻膜局部的免疫狀態(tài)，另一方面可能是補(bǔ)腎益氣方對機(jī)體的內(nèi)分泌平衡有一定的幫助，可以調(diào)節(jié)女性下丘腦-垂體-卵巢軸的功能。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，補(bǔ)腎益氣方對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者蛻膜局部及外周血中Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞的平衡有調(diào)節(jié)作用，可以上調(diào)Treg的比例，增加抗炎性細(xì)胞因子IL-10、IL-4的表達(dá)，而降低TNF-α、IFN-γ、IL-17的表達(dá)，促進(jìn)形成耐受型的免疫微環(huán)境[6-10]。

IDO在正常妊娠的過程中具有重要意義。蛻膜局部的IDO可以誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化，抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖和活化，并對多種免疫細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、DC細(xì)胞等都具有一定的調(diào)節(jié)功能，有利于維持母胎界面的耐受狀態(tài)[9,10]。Zong等[11]的研究表明，IDO可以促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和侵襲，而不明原因流產(chǎn)患者絨毛組織中IDO表達(dá)降低可能是導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的原因。Obayashi等[9]認(rèn)為絨毛組織中IDO的表達(dá)量和活性可能在不明原因流產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用。而IDO對NK細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，可能是由于IDO催化色氨酸代謝為犬尿氨酸及下游代謝產(chǎn)物所引起的局部微環(huán)境改變造成的。色氨酸缺乏導(dǎo)致的空載tRNA增多，可以激活細(xì)胞內(nèi)的GCN2激酶，特異性地磷酸化eIF2，降低胞內(nèi)的蛋白合成水平，抑制免疫細(xì)胞的效應(yīng)[12,13]。犬尿氨酸及下游代謝產(chǎn)物可以通過配體受體結(jié)合的方式，向胞內(nèi)傳遞信號，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的狀態(tài)[14,15]。

NK細(xì)胞是蛻膜局部比例最高的一種免疫細(xì)胞，在母胎免疫耐受中發(fā)揮了重要的作用。妊娠期間NK細(xì)胞在母胎界面大量聚集，主要依賴兩種方式：一種是外周NK細(xì)胞在蛻膜局部趨化因子的作用下向母胎界面移動(dòng)，一種是蛻膜局部的造血干細(xì)胞在局部微環(huán)境的調(diào)控下分化而成。外周NK細(xì)胞的表型主要為CD56+CD16+,而蛻膜NK細(xì)胞主要表現(xiàn)為CD56brightCD16dim，并表達(dá)殺傷細(xì)胞抑制性受體KIR，在滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)的非經(jīng)典的MHCⅠ類分子的啟動(dòng)下，向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制性信號，保護(hù)胚胎來源的細(xì)胞不被殺傷[16,17]。除此之外，蛻膜NK細(xì)胞還表現(xiàn)出與外周NK細(xì)胞不一樣的功能，它可以分泌多種細(xì)胞因子，如IL-4、IL-10等，調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲，促進(jìn)胎盤血管形成[18]。蛻膜局部的NK細(xì)胞有很大一部分來自于外周，經(jīng)誘導(dǎo)教育之后其表型發(fā)生轉(zhuǎn)化而表現(xiàn)為耐受表型，但具體的機(jī)制目前仍有很多沒有明確。在本篇文章中，我們驗(yàn)證了滋養(yǎng)細(xì)胞可以誘導(dǎo)外周NK細(xì)胞的表型向蛻膜表型的改變，并且CD16的轉(zhuǎn)變依賴于滋養(yǎng)細(xì)胞IDO，CD56的轉(zhuǎn)變不依賴于IDO。而補(bǔ)腎益氣方可以增加滋養(yǎng)細(xì)胞IDO的表達(dá)，并能通過上調(diào)滋養(yǎng)細(xì)胞IDO的水平來增強(qiáng)其調(diào)節(jié)能力。與之相類似的是，補(bǔ)腎益氣方可以通過上調(diào)滋養(yǎng)細(xì)胞IDO的表達(dá)抑制外周NK細(xì)胞CD16的表達(dá)，而補(bǔ)腎益氣方對CD56的調(diào)節(jié)作用則不依賴于滋養(yǎng)細(xì)胞IDO的表達(dá)。

本文從補(bǔ)腎益氣方具有免疫調(diào)節(jié)作用的角度出發(fā)，驗(yàn)證了補(bǔ)腎益氣方通過上調(diào)滋養(yǎng)細(xì)胞IDO的表達(dá)，影響了滋養(yǎng)細(xì)胞對NK細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)了外周NK細(xì)胞進(jìn)入蛻膜局部之后的表型轉(zhuǎn)化，有利于維持蛻膜局部的免疫耐受狀態(tài)，為補(bǔ)腎益氣方治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Pandey MK,Rani R,Agrawal S.An update in recurrent spontaneous abortion [J].Arch Gynecol Obstet,2005,272(2):95-108.

[2] Nakashima A,Shima T,Inada K,etal.The balance of the immune system between T cells and NK cells in miscarriage [J].Am J Reprod Immunol,2012,67(4):304-310.

[3] 許 帥.中西藥結(jié)合治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的臨床觀察 [J].吉林醫(yī)學(xué),2011,32(15):3018.

Xu S.Clinical observation of recurrent abortion patients treated by integrated Chinese and Western medicine[J].Jilin Med,2011,32(15):3018.

[4] 孫艷玲,張 宇,李松穎,等.中西醫(yī)結(jié)合治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)療效觀察[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2015,24(20):2207-2209.

Sun YL，Zhang Y，Li SY，etal.Effect of combination of traditional Chinese and Western medicine in the treatment of recurrent abortion[J].Modern J Integrated Traditional Chinese Western Med,2015,24(20):2207-2209.

[5] 盧穎瑩,謝淑武,歸綏琪,等.補(bǔ)腎益氣方對改良溴隱亭致大鼠流產(chǎn)模型黃體功能的影響[J].生殖與避孕,2009,29(2):65-69.

Lu YY，Xie SW，Gui SQ，etal.Effect of kidney-replenishing herbs on the morphous of corepus luteum in the improved sd rats model of bromocriptine-induced abortion[J].Reprod Contracep，2009,29(2):65-69.

[6] 王海燕,呂蓓麗,黃書慧,等.補(bǔ)腎益氣方對不明原因反復(fù)自然流產(chǎn)患者外周血Foxp3+Treg/Th1/Th17 細(xì)胞的影響[J].現(xiàn)代免疫學(xué),2012,32(3):243-247.

Wang HY，Lv BL，Huang SH，etal.Effect of Bushen Yiqi formula of traditional Chinese medicine on Foxp3+Treg/Th1/Th17 cells in patients suffered from recurrent spontaneous abortion[J].Curr Immunol，2012,32(3):243-247.

[7] 呂蓓麗,歸綏琪,王海燕.補(bǔ)腎益氣方對反復(fù)自然流產(chǎn)患者外周血調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的影響[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2015,42(3):344-348.

Lv BL，Gui SQ，Wang HY.Effect of Bushen Yiqi formula on regulatory T cells in patients suffered from recurrent spontaneous abortion[J].Fudan Univ J Med Sci,2015,42(3):344-348.

[8] 牛甜甜,陳元平,歸綏琪,等.補(bǔ)腎益氣方調(diào)控TGF-β1 對反復(fù)自然流產(chǎn)患者外周血Treg/Th17 細(xì)胞平衡的影響[J].現(xiàn)代免疫學(xué),2016,36(5):364-368.

Niu TT，Chen YP，Gui SQ,etal.Effect of Bushen Yiqi formula on Treg/Th17 balance in women with recurrent spontaneous abortion by through regulating TGF-β1 expression[J].Curr Immunol，2016,36(5):364-368.

[9] Obayashi Y,Ozaki Y,Goto S,etal.Role of indoleamine 2,3-dioxygenase and tryptophan 2,3-dioxygenase in patients with recurrent miscarriage [J].Am J Reprod Immunol,2016,75(1):69-77.

[10] Grohmann U,Fallarino F,Puccetti P.Tolerance,DCs and tryptophan:much ado about IDO [J].Trends Immunol,2003,24(5):242-248.

[11] Zong S,Li C,Luo C,etal.Dysregulated expression of IDO may cause unexplained recurrent spontaneous abortion through suppression of trophoblast cell proliferation and migration [J].Sci Rep,2016,6:19916.

[12] Fallarino F,Grohmann U,You S,etal.The combined effects of tryptophan starvation and tryptophan catabolites down-regulate T cell receptor zeta-chain and induce a regulatory phenotype in naive T cells [J].J Immunol,2006,176(11):6752-6761.

[13] Fougeray S,Mami I,Bertho G,etal.Tryptophan depletion and the kinase GCN2 mediate IFN-gamma-induced autophagy [J].J Immunol,2012,189(6):2954-2964.

[14] Della CM,Carlomagno S,Frumento G,etal.The tryptophan catabolite L-kynurenine inhibits the surface expression of NKp46-and NKG2D-activating receptors and regulates NK-cell function [J].Blood,2006,108(13):4118-4125.

[15] Song H,Park H,Kim YS,etal.l-Kynurenine-induced apoptosis in human NK cells is mediated by reactive oxygen species [J].International Immunopharmacology,2011,11(8):932-938.

[16] Chazara O,Xiong S,Moffett A.Maternal KIR and fetal HLA-C:a fine balance [J].J Leukoc Biol,2011,90(4):703-716.

[17] Chen SJ,Liu YL,Sytwu HK.Immunologic regulation in pregnancy:from mechanism to therapeutic strategy for immunomodulation [J].Clin Dev Immunol,2012,2012：258391.

[18] Sotnikova N,Voronin D,Antsiferova Y,etal.Interaction of decidual CD56+NK with trophoblast cells during normal pregnancy and recurrent spontaneous abortion at early term of gestation [J].Scand J Immunol,2014,80(3):198-208.