Gli2對高糖條件下腎小管上皮細胞凋亡及ROS水平影響

張靈靈 郭利芹 徐 可

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院腎內科,新鄉(xiāng) 453000)

糖尿病是一種嚴重危害人類生命健康的疾病，在世界范圍內的發(fā)病率極高，糖尿病引起的并發(fā)癥是導致其死亡的重要原因，糖尿病腎病是最為常見的糖尿病并發(fā)癥之一，其主要病理變化為腎小管萎縮和間質纖維化，而腎小管上皮細胞異常凋亡是造成腎小管萎縮和間質纖維化的重要原因[1,2]。大量的研究顯示，糖尿病患者腎臟組織中常常存在大量的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)，影響組織內的氧化平衡，造成氧化損傷，進一步損害腎組織，研究高糖環(huán)境下的腎小管上皮細胞凋亡和氧化損傷是探討糖尿病腎病發(fā)病機制的重要部分[3,4]。

膠質瘤相關癌基因2(Glioma associated oncog-ene homolog 2,Gli2)是Sonic hedgehog(Shh)信號通路的關鍵基因，能夠調控下游靶基因的激活和轉錄過程，在細胞凋亡過程中具有重要作用[5]。研究表明，Shh信號通路與糖尿病的發(fā)生有關，其在糖尿病腎病組織中表達下調，Gli2作為Shh信號通路的關鍵調控基因，在高糖作用后的腎小管上皮細胞中的表達水平也下降[6]。為了明確Gli2在糖尿病腎病發(fā)病中的作用，本研究通過細胞轉染的方法過表達腎小管上皮細胞中的Gli2水平，探討Gli2在腎小管上皮細胞凋亡和氧化損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 腎小管上皮細胞NRK-52E購自上海研域生物科技有限公司；Lipofectamine2000購自美國Thermo公司；Gli2過表達載體(pcDNA3-Gli2)由新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗室構建保存；兔抗Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)一抗、兔抗Gli2一抗、兔抗活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3)一抗、兔抗Ptch相關跨膜蛋白Smoothened(Smo)一抗、兔抗β 肌動蛋白(β-actin)一抗均購自美國Santa公司；Gli2、β-actin引物購自南京金斯瑞；反轉錄試劑盒、 Real-time RT-PCR試劑盒均購自大連TaKaRa公司；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自美國pierce公司；ROS含量檢測試劑盒購自上海前塵生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)含量檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及轉染 腎小管上皮細胞NRK-52E在含有10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)，當細胞密度達到60%時，用Lipofectamine2000把pcDNA3-Gli2和對照pcDNA3空載體轉染到NRK-52E細胞中，并且依次命名為pcDNA3-Gli2組和pcDNA3組，以不做轉染的細胞為對照組。轉染后48 h后，收集各組細胞，用RT-PCR和Western blot檢測轉染后細胞中Gli2水平。

1.2.2Real-time RT-PCR檢測Gli2水平 取1.2.1中的各組細胞，提取細胞中的RNA，用紫外分光光度計測定OD260/OD280≥1.8。用反轉錄試劑盒合成cDNA后，進行Real-time RT-PCR檢測。擴增程序為：95℃ 30 s、95℃ 5 s、58℃ 40 s，共40個循環(huán)，65℃到95℃溶解曲線，以β-actin為內參，2-ΔΔCt法統(tǒng)計分析基因水平。Gli2上游引物為5′-GTGGGTTAGGGATGGACTGAGG-3′，下游引物5′-GTTTTTGGTGGTAAAGTGGGTGG-3′。β-actin上游引物為5′-GTTGCGTTACACCCTTTCTTGAC-3′，下游引物5′-CTCGGCCACATTGTGAACTTTG-3′。

1.2.3Western blot檢測Gli2水平 取1.2.1中的各組細胞，提取細胞總蛋白，用BCA定量檢測試劑盒檢測蛋白濃度，蛋白變性后，用60 V的初始電壓電泳后，觀察溴酚藍進入到濃縮膠的底部后，把電壓加大為100 V繼續(xù)電泳。1.5 mA/cm2轉膜90 min。5%脫脂奶粉封閉，加入1∶1 000稀釋的一抗在4℃過夜反應，與1∶2 000稀釋后的二抗在室溫孵育90 min，顯色后，凝膠成像系統(tǒng)拍照，用Image-pro-plus 5處理圖片，以β-actin為內參，分析目的蛋白水平。

1.2.4細胞處理 取腎小管上皮細胞NRK-52E，按照1.2.1中進行轉染后，在實驗0 h時把對照組細胞分別用高糖培養(yǎng)液(含有30 mmol/L的葡萄糖、不含血清的DMEM)和低糖培養(yǎng)液(含有5.6 mmol/L的葡萄糖、不含血清的DMEM)培養(yǎng)，將pcDNA3-Gli2組細胞用高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，48 h后用于后續(xù)實驗檢測。將轉染pcDNA3-Gli2后的細胞用高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)記為pcDNA3-Gli2+高糖，將不做轉染的細胞用高糖和低糖培養(yǎng)液分別記為對照+高糖和對照+低糖。

1.2.5流式細胞術檢測凋亡 取1.2.4中處理的各組細胞，收集含有106個細胞，用500 μl的結合緩沖液懸浮細胞，加入5 μl的碘化丙啶(Propidium iodide，PI)和10 μl的膜聯蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)，室溫，避光反應10 min。在1 h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

1.2.6ROS、SOD含量檢測 取1.2.4中處理的各組細胞，收集細胞。用二氯二氫熒光素二乙酸酯(Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)探針法檢測細胞中的ROS水平，步驟參照試劑盒，用熒光強度表示ROS水平。同時收集細胞，用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD含量，步驟參照試劑盒。

1.2.7Western blot檢測細胞中Bax、Cleaved Caspase-3、Smo水平 取1.2.4中處理的各組細胞，收集細胞，提取細胞總蛋白，按照1.2.3中檢測各組細胞中Bax、Cleaved Caspase-3、Smo水平。

2 結果

2.1細胞轉染后Gli2表達水平 如圖1和表1所示，對照、pcDNA3、pcDNA3-Gli2細胞中Gli2 mRNA水平為：0.85±0.07、0.82±0.11、3.26±0.24，蛋白水平為：0.16±0.04、0.18±0.01、0.82±0.09。pcDNA3-Gli2細胞中Gli2 mRNA和蛋白水平明顯高于對照細胞，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。pcDNA3細胞中Gli2 mRNA和蛋白水平與對照細胞相比差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。pcDNA3-Gli2轉染后可以明顯提高腎小管上皮細胞中Gli2基因和蛋白水平。

2.2細胞凋亡檢測 如圖2和表2所示，對照+低糖、對照+高糖、pcDNA3-Gli2+高糖細胞凋亡率依次為：(9.26±0.95)%、(23.54±3.26)%、(18.05±1.36)%。對照+高糖細胞凋亡率明顯高于對照+低糖細胞，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。pcDNA3-Gli2+高糖細胞凋亡率明顯低于對照+高糖細胞，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高糖誘導腎小管上皮細胞凋亡，而Gli2可以減少高糖對腎小管上皮細胞凋亡的誘導作用。

圖1 Western blot檢測細胞中Gli2蛋白水平Fig.1 Gli2 protein level in cells detected by Western blot

GroupsGli2 mRNAGli2 proteinControl 0.85±0.070.16±0.04pcDNA30.82±0.111)0.18±0.011)pcDNA3-Gli23.26±0.242)0.82±0.092)F236.513129.429P<0.01<0.01

Note：Compared with the control,1)P>0.05;compared with the control,tmRNA=16.697,tprotein=11.607,2)P<0.01.

2.3細胞中ROS、SOD水平檢測結果 如表3所示，以熒光強度表示ROS水平，對照+低糖、對照+高糖、pcDNA3-Gli2+高糖細胞熒光強度依次為：(5.36±0.58)×103AU、(10.69±1.63)×103AU、(7.50±0.95)×103AU，SOD水平為：(16.39±1.41)×103U/L、(7.85±0.83)×103U/L、(12.69±1.14)×103 U/L。對照+高糖細胞ROS水平明顯高于對照+低糖細胞，而SOD水平明顯低于對照+低糖細胞，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。pcDNA3-Gli2+高糖細胞ROS水平明顯低于對照+高糖細胞， 而SOD水平明顯高于對照+高糖細胞，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高糖誘導腎小管上皮細胞氧化損傷，而Gli2可以減少高糖對腎小管上皮細胞的氧化損傷。

2.4細胞中Bax、Cleaved Caspase-3、Smo水平檢測 如圖3和表4所示，對照+低糖、對照+高糖、pcDNA3-Gli2+高糖細胞Bax水平依次為：0.32±0.04、1.14±0.12、0.58±0.08，Smo水平為：0.48±0.06、0.19±0.03、0.34±0.02，Cleaved Caspase-3水平為：0.15±0.02、1.03±0.09、0.64±0.07。對照+高糖細胞Bax、Cleaved Caspase-3水平明顯高于對照+低糖細胞，而Smo水平明顯低于對照+低糖細胞，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。pcDNA3-Gli2+高糖細胞Bax、Cleaved Caspase-3水平明顯低于對照+高糖細胞，而Smo水平明顯高于對照+高糖細胞，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。高糖作用后能夠降低腎小管上皮細胞Smo水平，升高Bax、Cleaved Caspase-3水平，而Gli2可以部分拮抗高糖對Bax、Cleaved Caspase-3、Smo水平的影響。

圖2 流式細胞術檢測細胞凋亡Fig.2 Apoptosis was detected by flow cytometry

GroupsApoptosis rate(%)Control+low glucose9.26±0.95Control +high glucose23.54±3.261)pcDNA3-Gli2+high glucose17.85±1.262)F35.458P<0.01

Note：Compared with the control+low glucose,t=7.284,1)P<0.01;compared with control +high glucose,t=2.820,2)P<0.05.

GroupsROS(×103 AU)SOD(×103 U/L)Control+low glucose5.36±0.5816.39±1.41Control +high glucose10.69±1.631)7.85±0.831)pcDNA3-Gli2+high glucose7.50±0.952)12.69±1.142)F16.62041.511P<0.01<0.01

Note：Compared with the control+low glucose,tROS=5.336,tSOD=9.041,1)P<0.01;compared with control+high glucose,tROS=2.929,tSOD=5.945,2)P<0.05.

圖3 Western blot檢測Bax、Cleaved Caspase-3、Smo水平Fig.3 Level of Bax,Cleaved Caspase-3,Smo detected by Western blot

GroupsBaxSmoCleavedCaspase-3Control+low glucose0.32±0.040.48±0.060.15±0.02Control +high glucose1.14±0.121)0.19±0.031)1.03±0.091)pcDNA3-Gli2+high glucose0.58±0.082)0.34±0.022)0.64±0.072)F70.55438.633130.590P<0.01<0.01<0.01

Note：Compared with the control+low glucose,tBax=11.228,tSmo=7.488,tCaspase-3=16.532,1)P<0.01;compared with control+high glucose,tBax=6.725,tSmo=7.206,tCaspase-3=5.925,2)P<0.01.

3 討論

Shh信號通路在腦組織、胃腸道、皮膚、肺組織等器官中均有表達，并且參與胚胎發(fā)育和組織器官生成，Shh信號通路是存在于脊椎動物中的Hedgehog的同源基因，Shh信號通路是進化較為保守，在早期的毛囊發(fā)育、牙齒形態(tài)發(fā)生、肢體發(fā)育、器官發(fā)育等均有重要作用，Shh信號通路由轉錄因子Gli、Ptch相關跨膜蛋白Smoothened(Smo)、Shh蛋白配體、靶基因、跨膜蛋白受體Patch(Ptch)等組成，當細胞中的Shh和Ptch相結合后，使Ptch對Smo的抑制作用被解除，Smo受到甾醇類的影響持續(xù)活化，影響Gli2的轉錄，從而影響下游靶基因的轉錄，調控細胞的生長、凋亡等一系列過程，而Gli2反過來又可以影響Smo的表達水平[7-12]。糖尿病腎病作為一種慢性病已經嚴重影響了人類的生命健康，而腎小管上皮細胞受損是糖尿病腎病發(fā)生的重要原因[13]。Shh作為調控細胞生物學特性的信號通路，不僅參與腫瘤、糖尿病心肌病、腦缺血再灌注等疾病的發(fā)生，還與糖尿病腎病的發(fā)生有關[14,15]。研究顯示，Gli2在糖尿病腎病腎組織中表達水平減弱，并且在腎小管上皮細胞中也有表達，下調Shh表達可以抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡[16]。

糖尿病腎病發(fā)病機制除了與腎小管上皮細胞凋亡有關以外，氧化應激也參與其中，高血糖環(huán)境下，腎小管上皮細胞的糖負荷加重，導致腎小管對氧的消耗能力加快，這就容易引起腎小管缺氧，進而導致腎組織發(fā)生氧化應激，損傷腎小管上皮細胞[17]。ROS水平與組織內的氧化平衡有關，在正常情況下，適量的ROS在細胞內信號轉導過程中發(fā)揮作用，而當細胞內的ROS水平異常升高時，氧自由基的清除劑SOD不能及時將過量的ROS清除，導致細胞膜上的脂質發(fā)生過氧化，引起細胞膜通透性的改變，進而引起氧化損傷，誘導細胞凋亡發(fā)生；另外，細胞內適量的ROS可以發(fā)揮信號傳導的作用，當細胞內ROS水平過量升高后，引起細胞內信號傳遞發(fā)生紊亂，促進細胞凋亡發(fā)生[18,19]。

本研究結果顯示，高糖作用后的腎小管上皮細胞凋亡增加，細胞中ROS水平升高，SOD水平下降，細胞中Smo水平也下降，而Gli2過表達后的腎小管上皮細胞經高糖培養(yǎng)后，凋亡減少，ROS水平也降低，Smo水平升高，Gli2可以降低高糖對腎小管上皮細胞氧化損傷，減少細胞凋亡。Gli2作為Shh信號通路的關鍵基因，與Shh同樣可以影響糖尿病腎病腎組織損傷，減少腎小管上皮細胞凋亡。

細胞凋亡是一個復雜的過程，是一系列基因共同調控的作用，也是凋亡蛋白和抗凋亡蛋白共同作用的結果，是細胞主動發(fā)生的程序性死亡，是機體維持內環(huán)境穩(wěn)定的重要組成部分[20]。Caspase蛋白家族和Bcl-2蛋白家族是目前研究的與細胞凋亡關系最為密切的兩大蛋白家族，其中Caspase級聯反應能夠誘導細胞凋亡的發(fā)生，Caspase-3作為凋亡執(zhí)行因子，其活化后成為Cleaved Caspase-3是細胞凋亡不可逆的標志，Bax是Bcl-2蛋白家族的成員之一，是一種促凋亡蛋白，其表達水平升高后發(fā)揮促進細胞凋亡的作用[21]。研究顯示，Cleaved Caspase-3、Bax在糖尿病腎病大鼠模型腎組織中水平均升高，并且二者在腎小管上皮細胞凋亡過程中發(fā)揮促進作用[22]。本研究結果顯示，高糖誘導腎小管上皮細胞Cleaved Caspase-3、Bax水平升高，而Gli2可以降低細胞中Cleaved Caspase-3、Bax水平，說明Gli2作用機制與Cleaved Caspase-3、Bax有關。

總之，Gli2能夠降低高糖誘導的腎小管上皮細胞氧化損傷和細胞凋亡，降低細胞中Cleaved Caspase-3、Bax水平，在糖尿病腎病腎組織損傷中發(fā)揮保護作用。本研究明確了Gli2在高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞凋亡中的作用，其作用機制仍需要在后續(xù)研究中繼續(xù)探討，由于本實驗只選用了一種腎小管上皮細胞，后續(xù)會在多株細胞中進行相關驗證。

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