氯喹對(duì)正常胃上皮細(xì)胞GES-1和胃癌細(xì)胞HGC-27凋亡的不同影響①

曹 麗 蘇 強(qiáng) 張亞萍 張?chǎng)纹G 程 凱 張曉延

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院,汾陽(yáng) 032200)

近年來(lái)，胃癌的發(fā)病率顯著上升，在我國(guó)惡性腫瘤中占比較大，因在早期不易被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)就醫(yī)診斷時(shí)往往處于中晚期，而目前對(duì)于胃癌的診斷和治療仍依賴于傳統(tǒng)手段，存在治療效果不佳、副作用大等問(wèn)題。因此目前迫切需要深入研究，尋找更加科學(xué)合理的早期診斷和預(yù)防治療的方案。

氯喹(Chloroquine，CQ)屬于4-氨基喹諾酮類藥，由兩個(gè)芳香環(huán)組成，是一種古老而應(yīng)用廣泛的治療瘧疾的藥物。在自噬研究中，氯喹作為一種經(jīng)典的溶酶體抑制劑，抑制自噬體與溶酶體的融合，起到抑制自噬流的作用。近年有研究發(fā)現(xiàn)，氯喹可發(fā)揮抗腫瘤作用，有應(yīng)用于腫瘤治療的前景[1]。已有研究表明氯喹能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[2]，因此我們想到如果氯喹也能誘導(dǎo)正常細(xì)胞發(fā)生凋亡，將會(huì)在臨床應(yīng)用中發(fā)生較嚴(yán)重的毒副作用。本研究中我們以正常胃上皮細(xì)胞為對(duì)照，觀察了氯喹是否對(duì)人胃癌HGC-27 細(xì)胞有特異性的促凋亡作用，以期待為胃癌的臨床治療提供新的參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人胃癌HGC-27 細(xì)胞和人正常胃上皮GES-1細(xì)胞由山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院張笑添老師饋贈(zèng)，我課題組凍存培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:含10%胎牛血清的MEM和DMEM 培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱。

1.1.2主要試劑 MEM 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、無(wú)支原體胎牛血清(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)；CCK-8試劑(博士德生物科技有限公司)；氯喹(上海中西制藥有限公司)；細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；PAGE凝膠配制試劑(賽默飛公司)；NC膜(PALL公司)；Caspase-3抗體、PARP抗體、LC3A/B抗體(CST公司)；GAPDH抗體(萬(wàn)類生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 兩種細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)分組各為加溶劑對(duì)照組和用氯喹、雷帕霉素(Rapamycin，RAP)作用后的實(shí)驗(yàn)組。細(xì)胞密度接近95%時(shí)將兩種細(xì)胞傳代至6孔板，每孔50萬(wàn)個(gè)，12 h后細(xì)胞密度約90%時(shí)分別換成含1%血清的MEM維持液和DMEM 維持液培養(yǎng)，設(shè)對(duì)照組和處理組。

確定藥物處理方案：結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)以及我們前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，觀察到用10 μmol/L的CQ和100 nmol/L的RAP藥物處理細(xì)胞72 h，細(xì)胞在形態(tài)以及生理指標(biāo)上的變化差異最明顯，故選取此方案進(jìn)行處理。

1.2.2使用倒置顯微鏡觀察CQ 處理后這兩種細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 細(xì)胞處理方法同1.2.1，設(shè)對(duì)照組和氯喹處理組。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.3采用DAPI核染色檢測(cè)CQ 對(duì)HGC-27 細(xì)胞凋亡的作用 細(xì)胞處理方法同1.2.1，設(shè)對(duì)照組和氯喹處理組，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，DAPI染核5 min，用PBS洗3遍后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性 選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且活性大于95%的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104ml-1，每孔100 μl加入96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后換成含1%血清的維持液。實(shí)驗(yàn)分為3組，氯喹組：用10 μmol/L的CQ干預(yù)；RAP組：用100 nmol/L的RAP干預(yù)；對(duì)照組：不加藥物的溶劑作為對(duì)照。每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，作用72 h，在終止培養(yǎng)的前2 h，每孔加入10 μl的CCK-8試劑[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽]，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度值，計(jì)算各孔平均OD 值，以對(duì)照組細(xì)胞活性為100%，計(jì)算各孔的細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率/%=(實(shí)驗(yàn)組A 值-陰性對(duì)照組A 值)/(空白對(duì)照組A值-陰性對(duì)照組A值)×100%。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5JC-1檢測(cè)CQ處理后細(xì)胞線粒體膜電位的變化 細(xì)胞處理方法同上。在氯喹作用細(xì)胞72 h后，吸除培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞1 次，加入0.5 ml細(xì)胞培養(yǎng)液，再加入0.5 ml JC-1 染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1 染色緩沖液洗滌2 次，加入1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下通過(guò)熒光通道檢測(cè)，分別拍照。

1.2.6Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白 分別收集兩種細(xì)胞的對(duì)照組和處理組，加入60 μl RIPA 裂解液冰浴15 min，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；樣品通過(guò)SDS-PAGE電泳分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC)上；膜用5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，然后分別孵育凋亡蛋白Caspase-3抗體，PARP抗體和GAPDH抗體以及LC3抗體，4℃過(guò)夜；清洗后，用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗在室溫下孵育2 h；最后使用化學(xué)發(fā)光法顯影。

2 結(jié)果

2.1氯喹處理對(duì)GES-1細(xì)胞和HGC-27細(xì)胞形態(tài)的影響 10 μmol/L的CQ 分別作用于GES-1細(xì)胞和HGC-27細(xì)胞72 h后，鏡下可見(jiàn)：GES-1細(xì)胞氯喹組和對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況較一致，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞呈多角形，胞膜清晰，胞質(zhì)飽滿，說(shuō)明氯喹干預(yù)未明顯改變正常胃上皮細(xì)胞形態(tài)；而HGC-27氯喹組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比較，間隙增寬，懸浮細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，細(xì)胞密度明顯減少，細(xì)胞逐漸萎縮變圓，胞質(zhì)減少，失去正常細(xì)胞形態(tài)，顯示氯喹干預(yù)后胃癌細(xì)胞發(fā)生了較為明顯的形態(tài)改變(圖1)。

2.2核染色檢測(cè)CQ誘導(dǎo)的HGC-27細(xì)胞凋亡 10 μmol/L的CQ分別作用于GES-1細(xì)胞和HGC-27細(xì)胞72 h后，用DAPI熒光染色法檢測(cè)氯喹處理細(xì)胞后細(xì)胞核的變化。如圖2所示，與同種細(xì)胞對(duì)照組相比，氯喹組GES-1細(xì)胞核淺染、核大小形態(tài)均未發(fā)生變化；而氯喹組HGC-27細(xì)胞細(xì)胞核呈濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光，且細(xì)胞數(shù)目也減少。

2.3氯喹和雷帕霉素對(duì)GES-1和HGC-27細(xì)胞增殖活性的影響 分別用10 μmol/L CQ和100 nmol/L RAP處理GES-1和HGC-27細(xì)胞72 h，CCK-8試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示：CQ能抑制HGC-27細(xì)胞增殖(P<0.05)，對(duì)GES-1細(xì)胞的增殖活性無(wú)明顯抑制作用(P>0.05)。本研究將自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素作為氯喹干預(yù)的對(duì)照藥物，結(jié)果顯示雷帕霉素可明顯增加正常胃上皮細(xì)胞GES-1增殖活性(P<0.05)，而對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞的促增殖活性不明顯(P>0.05)(圖3)。結(jié)果提示氯喹對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖活性抑制作用可能與抑制細(xì)胞自噬有關(guān)。

2.4JC-1檢測(cè)CQ處理后兩種細(xì)胞線粒體膜電位的變化 JC-1是檢測(cè)細(xì)胞膜電位變化的理想指示劑。JC-1在細(xì)胞內(nèi)有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)，當(dāng)以低濃度的單體形式存在時(shí)會(huì)聚集于胞內(nèi)發(fā)射綠色熒光，當(dāng)進(jìn)入線粒體以高濃度的多聚體形式存在時(shí)會(huì)發(fā)射紅色熒光，當(dāng)發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞線粒體膜電位會(huì)下降，就會(huì)由紅色熒光向綠色熒光發(fā)生轉(zhuǎn)變[3]。10 μmol/L CQ作用GES-1細(xì)胞和HGC-27細(xì)胞72 h后，熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)，GES-1細(xì)胞中的紅色熒光和綠色熒光無(wú)明顯變化，而HGC-27細(xì)胞中的JC-1 出現(xiàn)從紅色熒光向綠色熒光轉(zhuǎn)變，說(shuō)明CQ處理后HGC-27細(xì)胞發(fā)生了線粒體膜電位的下降(圖4)。

圖1 兩種細(xì)胞氯喹處理后的形態(tài)學(xué)變化(×20)Fig.1 Morphological changes of two cells after treated by CQ(×20)

2.5氯喹對(duì)胃癌細(xì)胞HGC-27凋亡相關(guān)蛋白水平的影響 由于氯喹和雷帕霉素是自噬相關(guān)藥物，為驗(yàn)證這兩種藥物作用于兩種細(xì)胞后自噬發(fā)生情況，我們用10 μmol/L CQ和100 nmol/L RAP藥物作用于兩種細(xì)胞72 h后觀測(cè)自噬標(biāo)記蛋白LC3的水平。與各自的對(duì)照組比較，氯喹組LC3Ⅰ型和Ⅱ型出現(xiàn)增多，表明自噬流被抑制，而雷帕霉素組出現(xiàn)了LC3Ⅰ型向Ⅱ型的轉(zhuǎn)變，表明細(xì)胞自噬的發(fā)生(圖5A)。隨后，研究了這兩種藥物作用于兩種細(xì)胞后凋亡蛋白的水平改變。藥物處理72 h后，CQ處理組和雷帕霉素處理組的GES-1細(xì)胞Caspase-3和PARP表達(dá)較對(duì)照組無(wú)明顯差異(P>0.05)；CQ處理組HGC-27細(xì)胞中凋亡蛋白Caspase-3和PARP表達(dá)較相同細(xì)胞對(duì)照組和雷帕霉素處理組均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5B、C。

圖2 兩種細(xì)胞氯喹處理后的細(xì)胞核染色變化(×20)Fig.2 Nuclear staining changes in two kinds of cells after treated with CQ(×20)

圖3 兩種藥物對(duì)GES-1和HGC-27細(xì)胞的細(xì)胞增殖活性的影響Fig.3 Proliferative activity of GES-1 and HGC-27 cells after 72 hNote: *.P<0.05.

圖4CQ處理后兩種細(xì)胞線粒體膜電位的變化(×20)

Fig.4EffectsofchloroquineonmitochondrialmembranepotentialofGES-1andHGC-27cells(×20)

Note: Counting certain cells randomly and calculating the ratio of red fluorescence to green fluorescent,*.P<0.05.

圖5 Western blot檢測(cè)兩種藥物處理GES-1細(xì)胞和胃癌細(xì)胞HGC-27細(xì)胞后凋亡蛋白的表達(dá)Fig.5 Expression of proteins in GES-1 and HGC-27 cells by Western blotNote:*.P<0.05.

3 討論

胃癌是威脅人類的十大癌癥之一，每年全球有近80萬(wàn)例患者死于胃癌，這其中約有一半患者來(lái)自中國(guó)[4]。所以，找到一種新的有效治療方法是眾多科研工作者和臨床醫(yī)師一直努力的方向。CQ長(zhǎng)期以來(lái)被用作抗瘧疾藥物,近年來(lái)又發(fā)現(xiàn)其可靶向溶酶體,通過(guò)改變?nèi)苊阁w內(nèi)pH值從而阻斷自噬溶酶體的形成和自噬體內(nèi)容物的降解,可抑制自噬的晚期效應(yīng)階段[5，7]。值得一提的是，已有研究表明氯喹已作為一種新的抗腫瘤藥物被應(yīng)用于臨床試驗(yàn)[8-10]。Zhang等[2]發(fā)現(xiàn)氯喹通過(guò)Toll樣受體9/NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制MGC803胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移，并具有抗腫瘤活性；Zhu等[5]發(fā)現(xiàn)氯喹促進(jìn)順鉑發(fā)揮抑制卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移的作用,通過(guò)氯喹抑制自噬從而增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤效應(yīng)。也有相同的研究報(bào)道見(jiàn)于其他腫瘤[11，12]，但均未觀察藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用?？紤]到作為一種抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性作用越強(qiáng)，其應(yīng)用價(jià)值才越高，故本研究以正常胃上皮細(xì)胞作為對(duì)照來(lái)進(jìn)行研究。與預(yù)期相符，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯喹能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞HGC-27發(fā)生凋亡，這與Zhang等[2]、Ye等[3]研究結(jié)果相同。除此之外，更有意義的是本研究發(fā)現(xiàn)與氯喹對(duì)胃癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡和抑制增殖的作用不同的是，氯喹對(duì)正常胃上皮細(xì)胞無(wú)明顯地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞毒作用。這種對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性的作用就為氯喹應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療提供了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

細(xì)胞自噬和凋亡是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制，干擾細(xì)胞自噬或凋亡會(huì)使細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝發(fā)生紊亂。通過(guò)擾亂腫瘤細(xì)胞自噬和凋亡的聯(lián)系，在一定程度上抑制腫瘤的生長(zhǎng)，成為治療腫瘤的一種策略。氯喹和雷帕霉素是一對(duì)經(jīng)典的自噬抑制劑和自噬誘導(dǎo)劑，本研究以雷帕霉素為對(duì)照，探究了這兩種藥物對(duì)兩種細(xì)胞的不同作用。我們認(rèn)為自噬的發(fā)生保護(hù)腫瘤細(xì)胞，阻止其發(fā)生凋亡。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)小劑量的CQ通過(guò)抑制自噬可增強(qiáng)苦參堿誘導(dǎo)的凋亡[13]。他們的研究中使用小劑量的氯喹與其他抗腫瘤藥物連用也可以起到誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果。因此，我們推測(cè)低劑量的氯喹可以部分抑制自噬體內(nèi)容物的降解，但還不足以直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，而我們實(shí)驗(yàn)中使用的中等劑量的氯喹可較強(qiáng)的阻斷自噬溶酶體的形成和自噬體內(nèi)容物的降解，使之積聚在胞內(nèi)，直接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡。

Caspase-3和PARP 都是細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要標(biāo)志。PARP，即聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(Poly ADP-ribose polymerase)，是細(xì)胞凋亡核心成員胱天蛋白酶(Caspase)的切割底物。本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)氯喹作用于兩種細(xì)胞72 h后，胃癌細(xì)胞HGC-27中凋亡相關(guān)蛋白酶Caspase-3和凋亡底物PARP發(fā)生降解，提示氯喹誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡與Caspase途徑有關(guān)聯(lián)。有研究表示許多抗腫瘤藥物作用于腫瘤細(xì)胞后能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS，ROS會(huì)使線粒體功能喪失如線粒體跨膜電位的變化，細(xì)胞色素C從線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)，然后這種釋放會(huì)引發(fā)Caspase活化、DNA的斷裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[14，15]。因此接下來(lái)我們進(jìn)一步探究了氯喹作用于胃癌細(xì)胞HGC-27后是否通過(guò)這一機(jī)制來(lái)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞HGC-27凋亡。

我們以正常胃上皮細(xì)胞GES-1作為對(duì)照細(xì)胞，運(yùn)用DAPI染色、CCK-8試驗(yàn)以及JC-1膜電位變化、蛋白印跡Western blot等試驗(yàn)方法驗(yàn)證了氯喹可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡并抑制其細(xì)胞活力，而對(duì)正常胃上皮細(xì)胞無(wú)明顯作用。這種差異提示在兩種細(xì)胞中自噬溶酶體受抑制后的活動(dòng)不同，但具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索。氯喹能抑制胃癌細(xì)胞的自噬溶酶體形成階段誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，提示自噬溶酶體在自噬和凋亡調(diào)控之間發(fā)揮著重要的作用，我們接下來(lái)將對(duì)這種調(diào)控的機(jī)制做進(jìn)一步的研究探索，以從自噬和凋亡調(diào)控的角度為癌癥的臨床治療提供更多的參考。

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