奧利亞羅非魚（WZ♀）×尼羅羅非魚（XY♂、YY♂）雜交子代的性比分析

萬松良 ，筴金華 ，任炳琛 ，魏志宇 ，張艷紅 ，萬珊

（1.湖北省水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430071；2.河北中捷國(guó)家級(jí)羅非魚良種場(chǎng)，河北 滄州 061108；3.湖北省獸藥監(jiān)察所，湖北 武漢 430070）

羅非魚種間存在雌性同形配子、雄性異形配子（XX♀/XY♂）和雌性異形配子、雄性同形配子（WZ♀/ZZ♂）等兩種性別決定類型。已知莫桑比克羅非魚Oreochromis mossambicus和尼羅羅非魚O.niloticus屬于前一類型，奧利亞羅非魚O.aureus和荷那龍羅非魚O.hornorum屬于后一類型[1]。以往大量雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)，將某些不同性別決定機(jī)制的羅非魚種間雜交，配子同型的XX型雌魚與ZZ型雄魚正交，可獲得全雄或高雄性率子代，即雌雄性比為0∶1；配子異型的WZ型雌魚與XY型雄魚反交，雜交子代的雄性率一般為75%左右，即雌雄性比為1∶3[2]。但是，近年來，國(guó)內(nèi)少數(shù)研究者對(duì)上述反交結(jié)果提出質(zhì)疑，他們用WZ雌奧利亞羅非魚與XY、YY雄尼羅羅非魚雜交，其子代雌雄性比都為1∶1，故推斷其中WY型雜交羅非魚為雌性[3-5]。本研究在2010年至2014年測(cè)交篩選YY超雄尼羅羅非魚的同時(shí)，也開展了奧利亞羅非魚（WZ♀）×尼羅羅非魚（XY♂、YY♂）測(cè)交實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證WY型雜交羅非魚的性比，并為育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚來源

奧利亞羅非魚為中捷羅非魚良種場(chǎng)從無錫淡水漁業(yè)中心引進(jìn)的“夏奧1號(hào)”良種；尼羅羅非魚系從上海海洋大學(xué)引進(jìn)的第13代新吉富品系，其中YY超雄尼羅羅非魚系本課題組篩選獲得。

1.2 奧利亞羅非魚（WZ♀）×尼羅羅非魚（XY♂）雜交

根據(jù)孟德爾遺傳學(xué)定律，WZ雌性?shī)W利亞羅非魚與XY雄性尼羅羅非魚交配，子代將產(chǎn)生WX、WY、ZX、ZY等4種性別基因型，各占1/4，其中WX♀、ZX♂、ZY♂為已知性別，WY型的性別由同窩子代雌雄性比來判斷，若性比為1∶1，則WY判斷為♀；若性比為1∶3，WY判斷為♂。

在兩口4m×2m×1.5m的水泥池中各放1尾體質(zhì)量1.4～1.5kg的雄親魚，再分別放入體質(zhì)量0.4～0.6kg的雌親魚7尾（105#池）和4尾（106#池）。每尾親本注射0.5個(gè)鯉腦垂體（PG）懸浮液催產(chǎn)。

本雜交父本為候選YY超雄魚的材料魚，在與奧利亞羅非魚雌魚交配見苗后，馬上又與XX型雌性尼羅羅非魚測(cè)交，用子代測(cè)試法驗(yàn)證其性別基因型為YY♂還是XY♂。

1.3 奧利亞羅非魚（WZ♀）×尼羅羅非魚（YY♂）雜交

根據(jù)遺傳學(xué)原理，WZ雌奧利亞羅非魚與YY超雄尼羅羅非魚交配，子代只產(chǎn)生WY、ZY等兩種基因型，各占50%，其中ZY♂為確認(rèn)的雜種超雄魚，WY型的性別可再由同窩雌雄性比來判斷。若性比為1∶1，則WY為♀；若性比為0∶N（N表示測(cè)交子代總數(shù)）[6]，即子代是全雄魚或高雄性率魚，WY為♂；若性比為1∶3，則WY仍為♂，但否定父本是YY♂，而是XY♂。

在池塘內(nèi)兩口1.5m×1m×1m的32目網(wǎng)箱中，每箱放入測(cè)交篩選的、體質(zhì)量1kg左右的YY超雄尼羅羅非魚1尾，其中5～26#箱配體質(zhì)量0.4～0.6kg的雌奧利亞羅非魚2尾，5～27#箱配相似體質(zhì)量的雌性?shī)W利亞羅非魚1尾，未注射催產(chǎn)劑。剪去YY超雄魚的上頜，防止大個(gè)體雄魚咬傷小個(gè)體雌魚。各箱配組繁苗20d后，移走親本，將子代單獨(dú)飼養(yǎng)至性別鑒定。

YY超雄尼羅羅非魚性別基因型分子標(biāo)記鑒定：為重復(fù)驗(yàn)證用測(cè)交法篩選的YY超雄魚的準(zhǔn)確性，后期剪取每尾YY超雄魚一小塊尾鰭樣品，裝進(jìn)1.5mL的編號(hào)試管中，經(jīng)脫水處理后，與其他尼羅羅非魚樣品一起，送西南大學(xué)水產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室作性別特異分子標(biāo)記鑒定[7]，看兩種鑒定結(jié)果是否相吻合。

1.4 子代雌雄鑒別

雜交子代個(gè)體一般長(zhǎng)到50g左右時(shí)，性別特征已完全分化。此時(shí)隨機(jī)撈取百尾以上樣本或全部樣本，逐尾觀察肛門之后有無產(chǎn)卵孔來辨別雌雄，統(tǒng)計(jì)性比。也對(duì)少數(shù)體長(zhǎng)達(dá)到4cm以上的子代，隨機(jī)取出一部分，腹腔注射5%的冰醋酸固定液，解剖觀察性腺，鑒別雌雄。

1.5 數(shù)據(jù)處理分析

用卡方分析檢驗(yàn)各組合子代雌雄性比實(shí)驗(yàn)值與期望值的適合度，顯著水平為P＞0.05或P＜0.001。觀察所得的子代性別比例是否與期望值相吻合。

2 結(jié)果與分析

2.1 奧利亞羅非魚（WZ♀）×尼羅羅非魚（XY♂）雜交子代的性比

經(jīng)7個(gè)半月的繁殖與飼養(yǎng)，兩池都獲得了大小兩批雜種子代魚，稱重測(cè)算105#池有1 413尾，106#池有2 132尾。各池隨機(jī)抽樣鑒別雌雄結(jié)果見表1。105#池鑒魚225尾，雄性率為49.3%，性比為1∶0.97。與1∶1的性比期望值作卡方分析，X2=0.018，P＞0.89，與期望值相吻合，由此判斷105#池的WY型魚為♀。106#池共鑒魚204尾，雄性率為80.4%，性比為1∶4.1。與1∶1的性比期望值作卡方分析，X2=74.16，P＜0.001，與該期望值有極顯著差異，而與1∶3 的期望值相吻合（X2=2.882，P＞0.089）。由此卡方分析判斷，106#池中的WY型魚應(yīng)為♂。父本測(cè)交結(jié)果顯示，105#池中父本子代的雄性率為64%，106#池中父本子代的雄性率為54%，確證兩尾父本的性別基因型均為XY♂。

2.2 奧利亞羅非魚（WZ♀）×尼羅羅非魚（YY♂）雜交子代的性比

5-26#網(wǎng)箱繁殖雜交子代兩窩，獲苗較多，5-27#網(wǎng)箱只繁殖1窩，獲苗較少。飼養(yǎng)8個(gè)月后，5-26#箱共鑒魚506尾，雄性率為99.4%，雌雄性比1∶168（表2）。以雌雄比1∶1的期望值作卡方分析，X2=492.10，P＜0.001，與1∶1的期望值有極其顯著的差異，而與0∶N（N表示雜交子代的總數(shù)）的期望值相吻合（X2=0.0124，P=0.92）。卡方分析證明，本箱中的WY型魚為♂，父本為YY超雄魚。5-27#箱僅有子代魚20尾，雄性率為80%，雌雄性比1∶4。以雌雄性比1∶1的期望值作卡方分析，X2=6.05，P=0.0139，雖與1∶1的期望值有明顯差異，但未達(dá)到極顯著水平，而與1∶3的期望值相吻合（X2=0.067，P=0.80）。卡方分析表明，5-27#箱中的 WY型魚也為♂，但父本可能不是YY型超雄魚，而是XY型雄魚。后與性別基因分子標(biāo)記鑒定結(jié)果對(duì)照，發(fā)現(xiàn)5-26#父本性別基因型確為YY，5-27#父本性別基因型則為XY，后者性別基因分子鑒定與雜交子代性比結(jié)果相吻合，但與之前測(cè)交篩選YY超雄魚（子代♀∶♂=5∶95，雄性率95%）的結(jié)果相矛盾。這就提示我們，盡管在測(cè)交過程中，子代抽樣達(dá)100尾，雄性率高達(dá)95%以上，父本仍有可能不是YY超雄魚。

為進(jìn)一步驗(yàn)證5-26#網(wǎng)箱中近乎全雄的F1代尼奧羅非魚中是否含有WY型雄魚，從中隨機(jī)取出少量性成熟個(gè)體，在網(wǎng)箱中與XX雌尼羅羅非魚作測(cè)交實(shí)驗(yàn)。從理論上講，WY型雄魚與XX型雌魚測(cè)交的后代（WX♀，XY♂）性比為1∶1，雄性率在50%左右，而YZ型超雄魚與XX型雌魚測(cè)交的后代（XY♂，XZ♂）雄性率至少應(yīng)在90%以上。配組9箱，產(chǎn)苗4箱，3個(gè)月后檢測(cè)F2代性比，除一口網(wǎng)箱的魚苗太小沒有鑒別外，其他3口網(wǎng)箱鑒別出兩尾F1代WY♂（表3）。少量測(cè)交結(jié)果充分證實(shí)，由YY超雄尼羅羅非魚與WZ雌性?shī)W利亞羅非魚雜交的全雄子代中含有大批WY型雄魚，并非只是單純的YZ型超雄魚，直接證實(shí)了WY♂的存在。

表1 奧利亞羅非魚（WZ♀）×尼羅羅非魚（XY♂）雜交子代的性比Tab.1 The sex ratios of offsprings from blue tilapia Oreochromis aureus（WZ♀）×Nile tilapia O.niloticus（XY♂）crosses

表2 奧利亞羅非魚（WZ♀）×尼羅羅非魚（YY♂）雜交子代的性比Tab.2 The sex ratios of offsprings from blue tilapia Oreochromis aureus（WZ♀）×Nile tilapia O.niloticus（XY♂）crosses

表3 5～26網(wǎng)箱F1代雄性尼奧羅非魚與正常XX雌性尼羅魚測(cè)交后代的性比Tab.3 The sex ratios of offsprings from F1NO-tilapia male in cage 5～26 test crossed to normal XX female Nile tilapia O.niloticus

3 討論

3.1 WY型羅非魚的性別

綜觀以上4組實(shí)驗(yàn)的測(cè)交結(jié)果，除1組子代雌雄性比顯示W(wǎng)Y型羅非魚為♀外，其他3組子代性比都表明WY型羅非魚為♂。特別是YY超雄魚為父本的組合中，子代雌雄性比為3∶503，接近0∶N的理論比值，雄性率高達(dá)99.4%,充分證實(shí)WY型羅非魚的確為♂。用該組少量F1代尼奧全雄羅非魚與XX雌性尼羅羅非魚測(cè)交，也進(jìn)一步證實(shí)了其中WY♂的客觀存在（表3）。這一結(jié)果與以前萬松良等[8]用YY超雄莫桑比克羅非魚作父本測(cè)交的結(jié)果完全相似。在以前研究中，筆者用3尾YY超雄莫桑比克羅非魚和3尾WZ雌性?shī)W利亞羅非魚分別測(cè)交，獲得雜種子代800尾，一年性成熟后再逐尾檢查性別，結(jié)果無一尾雌魚，全部為雄性，雌雄性比為0∶800，完全符合0∶N的理論比值，證實(shí)WY型羅非魚為♂。

基于以上研究結(jié)果認(rèn)為，在絕大多數(shù)情況下，將種質(zhì)純正的WZ型奧利亞羅非魚雌魚與XY型、特別是YY型尼羅羅非魚或莫桑比克羅非魚雄魚雜交，所獲得子代雌雄性比為1∶3和0∶N，其中WY型羅非魚的性別肯定為♂。這些結(jié)果也支持了筆者以前研究提出的羅非魚4種配子性別基因強(qiáng)度順序?yàn)閅♂＞W(wǎng)♀＞Z♂＞X♀的觀念[8]。而少數(shù)研究者將4種配子性別基因強(qiáng)度順序（或顯隱性關(guān)系）修改為W♀＞Y♂＞Z♂＞X♀[4]，不符合大多數(shù)研究結(jié)果。

3.2 關(guān)于某些實(shí)驗(yàn)值偏離理論期望值的原因分析

雖然上述絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)獲得的子代雌雄性比實(shí)驗(yàn)值都與1∶3和0∶N的理論期望值相吻合，但不可否認(rèn)，本次實(shí)驗(yàn)中畢竟有一組子代的雌雄性比實(shí)驗(yàn)值為1∶1。而國(guó)內(nèi)少數(shù)研究者（2012）用2尾XY♂和1尾YY♂尼羅羅非魚分別與10尾和11尾WZ♀奧利亞羅非魚測(cè)交實(shí)驗(yàn)，所得的子代雌雄性比值都為1∶1[3]。這種少數(shù)雌雄性比實(shí)驗(yàn)值偏離理論期望值的異常現(xiàn)象不容忽視，其原因值得深入分析探究。

尼羅羅非魚是世界性養(yǎng)殖魚類，大范圍的推廣養(yǎng)殖難免來自其他種類的基因滲入尼羅羅非魚的基因組，造成種質(zhì)不純，降低養(yǎng)殖性能[9]。大量生產(chǎn)實(shí)踐證實(shí)，兩種性別決定機(jī)制的羅非魚種間雜交，雜種后代的雄性率與親本種質(zhì)純度密切相關(guān)，親本種質(zhì)純度越高，雄性率也越高[10]，反之，親本種質(zhì)純度降低，雄性率也降低。李思發(fā)等[11]研究指出，我國(guó)尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚養(yǎng)殖群體存在一定程度的遺傳漸滲，有些雜種羅非魚的外表酷似尼羅羅非魚，這種雜種同正宗尼羅羅非魚肉眼難以區(qū)分，誤被當(dāng)作尼羅羅非魚而混入繁育群體。如果不純的尼羅羅非魚與奧利亞羅非魚雜交，或者其雜交種混雜進(jìn)了父母本群體，尼奧魚的雄性比將大幅降低，養(yǎng)殖性能降低?；谶@種遺傳漸滲理論推測(cè)，上述雜交子代雌雄性比實(shí)驗(yàn)值偏離預(yù)期值，下降為1∶1的意外結(jié)果，很有可能是因參與雜交的尼羅羅非魚父本不純所致。這種父本外形似尼羅羅非魚，遺傳本質(zhì)卻是奧利亞羅非魚，它的雜交后代雌雄性比為1∶1就不足為奇了。

決定羅非魚性別的遺傳學(xué)機(jī)制復(fù)雜[12]。有些子代性比結(jié)果僅用單因子性染色體遺傳或性配子決定理論解釋還不夠[13-16]。近期研究顯示，奧利亞羅非魚存在著兩對(duì)性染色體[17]。羅非魚的性別是以性別基因?yàn)橹鞯亩嘁蜃樱ㄈ绯Ｈ旧w、親魚效應(yīng)、環(huán)境等）共同作用來決定[18]。最近，Baroiller等[19]將尼羅羅非魚的性別決定機(jī)制重新歸納成三點(diǎn)：①主要由遺傳基因如性染色體主導(dǎo)；②某些次要因子如親代效應(yīng)，以及③環(huán)境如溫度等因子共同引導(dǎo)性別。據(jù)此推測(cè)，以上少數(shù)雜交子代雌雄性比結(jié)果偏離預(yù)期值的原因，也可能與測(cè)交的父母本種群和個(gè)體的親代效應(yīng)有關(guān)聯(lián)，即因雜交親代的種群或個(gè)體不同，影響到雜種后代的雌雄性比偏離預(yù)期值。以上推測(cè)都有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.3 關(guān)于建立WY♀-YY♂的超雄羅非魚自繁體系的可行性

本研究的初衷是想驗(yàn)證WY♀雜種羅非魚是否客觀存在。若存在，就可構(gòu)建免測(cè)交的WY♀-YY♂超雄羅非魚自繁體系。但本實(shí)驗(yàn)證實(shí)由YY超雄尼羅羅非魚與WZ型奧利亞羅非魚雜交產(chǎn)生的WY型雜種羅非魚性別絕大多數(shù)不為♀，而為♂，因而也未完成構(gòu)建WY♀-YY♂超雄羅非魚自繁體系。

如上分析，在親本種質(zhì)不純或可能存在種群不同的親代效應(yīng)的情況下，產(chǎn)生少數(shù)雜交后代的雌雄性比值偏離預(yù)期值的異常現(xiàn)象，但它并不能代表正常情況下絕大多數(shù)WY型雜種羅非魚的性別為雄的遺傳本質(zhì)。若以這少數(shù)異常結(jié)果來推斷絕大多數(shù)正常的WY型雜種羅非魚的性別，就會(huì)得出以偏概全的結(jié)論。少數(shù)研究者僅用一尾YY超雄魚作父本測(cè)交[3]，來推斷子代WY型雜種羅非魚為♀，其依據(jù)不夠充分，結(jié)論值得商榷。

尼羅羅非魚是羅非魚類中個(gè)體最大、生長(zhǎng)最快的優(yōu)良種類。從遺傳角度來說，即便WY型羅非魚性別為♀，但因它屬雜種，并不具備純種尼羅羅非魚的外形特征和生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。它需與YY超雄尼羅羅非魚經(jīng)過5代以上的回交和定向選種[4]，才能構(gòu)建具有尼羅羅非魚外形特征和生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的WY♀-YY♂型羅非魚繁殖體系，過程相當(dāng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力。WY♀-YY♂的性別決定機(jī)制在本質(zhì)上與WZ♀-ZZ♂一樣，都是雌性異形配子和雄性同形配子，理論上并無創(chuàng)新。

綜上所棕，目前建立WY♀-YY♂型超雄羅非魚自繁體系是不可行的。而直接利用Y♂配子超強(qiáng)顯性優(yōu)勢(shì)，將YY超雄尼羅羅非魚與WZ雌性?shī)W利亞羅非魚雜交，生產(chǎn)具有全雄和雜種雙重優(yōu)勢(shì)的奧尼羅非魚，對(duì)促進(jìn)單雄性羅非魚養(yǎng)殖更具重大意義。

［1］劉建康,何碧梧.中國(guó)淡水魚類養(yǎng)殖學(xué)（第三版）［M］.北京:科學(xué)出版社,1992:145.

［2］WohlfarthGW&HulataGI.Appliedgeneticsoftilapias［M］.ICLARM Studies and Reviews；6 International Center for Living Aquatic Resources Management,Manila,Philipines,1981.

［3］楊永銓,張海明,陳遠(yuǎn)生.WY型羅非魚的性別鑒定［J］.淡水漁業(yè),2012,42（4）:79-82.

［4］楊永銓,張海明,陳遠(yuǎn)生.WY♀-YY♂型羅非魚新品種選育和生物學(xué)研究［J］.淡水漁業(yè),2012,42（5）:73-74,88.

［5］楊永銓,張海明,陳遠(yuǎn)生.WY♀-YY♂型羅非魚繁殖體系研究［J］.淡水漁業(yè),2013,43（1）:89-93.

［6］劉漢勤,管波,徐江,等.YY超雄黃顙魚和全雄黃顙魚規(guī)模化繁育［C］.中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)水產(chǎn)生物技術(shù)專業(yè)委員會(huì)暨魚類性別決定機(jī)制和調(diào)控技術(shù)研討會(huì)論文集,2012.

［7］ Sun Y L,Jiang D N,Zeng S,et al.Screening and characterization of sex-linked DNA markers and markerassistedselectionintheNiletilapia（Oreochromis niloticus）［J］.Aquaculture，2014,433:19-27.

［8］萬松良,李懋,魏于生,等.藍(lán)非鯽（WZ,♀）×莫桑比克非鯽（YY,♂）雜交子一代性別觀察［J］.水產(chǎn)科學(xué),1994,13（1）:15-19.

［9］ Beardmore J A,Mair G C&Lewis R I.Monosex male production in finfish as exemplified by tilapia:applications,problems,and prospects［J］.Aquaculture,2001,197（1）:283-301.

［10］孫運(yùn)侶.尼羅羅非魚性別特異分子標(biāo)記的篩選、應(yīng)用及性別決定候選基因sdY的分子克隆［D］.重慶：西南大學(xué)，博士學(xué)位論文,2013.

［11］李思發(fā),蔡完其.我國(guó)尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚養(yǎng)殖群體的遺傳漸滲［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào),1995,19（2）:105-111.

［12］ Devlin R H&Nagahama Y.Sex determination and sex differentiation in fish:an overviewofgenetic,physiological,and environmental influences［J］.Aquaculture,2002,208:191-364.

［13］Mair G C,Scott A G,Penman D J,et al.Sex determination in the genus Oreochromis.1.Sex reversal,gynogenesis and triploidy in O.niloticus（L.）［J］.Theor Appl Genet,1991,82（2）:144-152.

［14］Mair G C,Scott A G,Penman D J,et al.Sex determination in the genus Oreochromis.2.Sex reversal,hybridization,gynogenesis and triploidy in O.aureus Steindachner［J］.Theor Appl Genet,1991,82（2）:153-160.

［15］ Lee B Y,Hulata G&Kocher T D.Two unlinked loci controlling the sex of blue tilapia（Oreochromis aureus）［J］.Heredity,2004,92（6）:543-549.

［16］ Cnaani A,Lee B Y,Zilberman N,et al.Genetics of sex determination in tilapiine species［J］.Sex Devel,2008,2（1）:43-54.

［17］ Campos-Ramos R,Harvey S C,Masabanda J S,et al.Identification of putative sex chromosomes in the blue tilapia,Oreochromisaureus,throughsynaptonemalcomplex andFISHanalysis［J］.Genetica,2001,111:143-153.

［18］陳榮華,蔡添財(cái),劉富光.超雄性（YY）尼羅吳郭魚之選育及單雄性魚苗量產(chǎn)的應(yīng)用［J］.臺(tái)灣水產(chǎn)研究,2013,21（2）:69-82.

［19］ Baroiller J F,D'Cotta H,Bezault E,et al.Tilapia sex determination:Where temperature and genetics meet［J］.Comparative Biochemistry and Physiology- Part A:Molecular&Integrative Physiology,2009,153（1）:30-38.