大鼠熱應(yīng)激對細(xì)胞免疫學(xué)的影響

周文蕓，呂芷嫻，曾黎峰，何 丹，胡國柱

(江西省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，南昌 330006)

熱應(yīng)激是指在高溫環(huán)境中的機(jī)體對過熱刺激所產(chǎn)生的非特異性生理反應(yīng)，其中包括呼吸、心率加快、缺氧等；細(xì)胞氧化代謝及過氧化物產(chǎn)生增加；水和電解質(zhì)平衡紊亂。然而熱應(yīng)激最初反應(yīng)是神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂，交感神經(jīng)系統(tǒng)及腦垂體-丘腦下部-腎上腺系統(tǒng)功能亢進(jìn)，免疫受到抑制。狗熱應(yīng)激42.3 ℃90 min，外周血淋巴細(xì)胞持續(xù)8 d減少，有絲分裂原刺激T細(xì)胞增殖也被抑制[1]。熱應(yīng)激的孕牛其產(chǎn)下的小牛4周內(nèi)Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)表達(dá)下降，淋巴細(xì)胞數(shù)量減少[2]。大鼠熱應(yīng)激腸系膜淋巴結(jié)CD3+CD4+T細(xì)胞減少，而CD3+CD8+T細(xì)胞增加[3]。20～40歲的男性志愿者熱應(yīng)激，其血漿去甲腎上腺素/腎上腺素、去甲腎上腺素/皮質(zhì)醇，以及白細(xì)胞介素4/Ⅱ型干擾素(IL-4/IFN-γ)的比值升高，證明交感神經(jīng)系統(tǒng)參與免疫抑制調(diào)節(jié)，同時(shí)免疫調(diào)節(jié)向輔助T細(xì)胞(Th2)方向發(fā)展[4]。動(dòng)物慢性熱應(yīng)激增加了H5N1流感病毒感染的易感性，抑制了Th1和Th2 免疫反應(yīng)，降低了H5N1流感病毒疫苗免疫接種后的保護(hù)作用，其原因是慢性熱應(yīng)激誘導(dǎo)動(dòng)物CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞產(chǎn)生，IL-10和TGF-β產(chǎn)生增加[5]。少突細(xì)胞髓鞘糖蛋白[MOG(35-55)]肽接種小鼠2 d開始熱應(yīng)激，結(jié)果實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的發(fā)生率減少了70%，且延遲發(fā)病，癥狀減輕，白細(xì)胞浸潤減少，CD4+CD25+T細(xì)胞減少，MOG(35-55)活化的T細(xì)胞也下降[6]。

TLR4是識別細(xì)菌脂多糖(LPS)、一些病毒及原蟲等病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)的識別受體(pattern recognition receptors，PRR)，主要表達(dá)于單核/巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、粒細(xì)胞及自然殺傷(NK)細(xì)胞，TLR4在脾和外周血白細(xì)胞表達(dá)最強(qiáng)。TLR4與PAMPs 結(jié)合起到清除病原微生物的天然免疫[7]和特異性免疫作用[8]。

TLR4具有天然免疫和特異性免疫雙重作用。CD4+CD25+FoxP3+Treg和CD8+CD25+FoxP3+Treg均為Treg細(xì)胞[9]。因此，本文觀察熱應(yīng)激大鼠脾臟細(xì)胞TLR4表達(dá)及外周血兩種Treg細(xì)胞的變化，以期為高溫高濕所致疾病的預(yù)防提供理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級SD大鼠(上海市西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)72只，雄性，體質(zhì)量(267.26±31.08)g，鼠齡9～15周。LPS和刀豆素A(Con-A，Sigma公司)；抗PE-TLR4(Abcam公司)及抗PE-IgG2b k(eBioscience公司)；抗PE-Cy5-CD4(BD Pharmingen公司)及抗PE-Cy5-IgG2a k(eBioscience公司)；抗PE-CD25及抗PE-IgG1，抗FITC-Foxp3及抗FITC-IgG2a，抗FITC-CD8b及抗FITC-IgG1，抗PE-Cy5-Foxp3及抗PE-Cy5-IgG2a；Foxp3 Fixation/Permeabilization及Permeabilization緩沖液(eBioscience公司)。

1.2方法

1.2.1分組 (1)正常對照組(20 ℃組)36只大鼠分為非刺激組、LPS刺激組(腹腔注射LPS,1.0 mg/kg)，Con-A刺激組(腹腔注射Con-A,5.0 mg/kg)，每組12只，自然環(huán)境飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水，濕度50%；(2)高溫濕熱組(37 ℃組)組36只大鼠分為非刺激組、LPS刺激組、Con-A刺激組，每組12只，37 ℃培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水，飽和濕度(100%)；每組觀察時(shí)間點(diǎn)為處理后1、12、48、168 h時(shí)間點(diǎn)(3只大鼠/時(shí)間點(diǎn))。

1.2.2脾臟單個(gè)核細(xì)胞懸液制備 大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，取脾臟用含1.0%小牛血清(FCS)+0.03% NaN3的0.01 mol/L PBS(pH 7.4)經(jīng)200目不銹鋼網(wǎng)研磨制成細(xì)胞懸液，離心洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL。

1.2.3脾臟TLR4+測定 采用流式細(xì)胞術(shù)方法：10.0 μL TLR4-PE抗體(1.0 μg)加至塑料試管底，再加同型對照抗體5.0 μL于另一管，然后每管加5×108個(gè)/L脾臟細(xì)胞混勻，室溫孵育40 min；再加90.0 μL紅細(xì)胞裂解液孵育10 min；最后加2.0 mL PBS 400×g離心力離心5 min，洗滌2次。加0.4 mL流式細(xì)胞儀鞘液混勻后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4Treg細(xì)胞檢測 CD4+CD25+T細(xì)胞及CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞，CD8+CD25+T細(xì)胞及CD8+CD25+Foxp3+Treg測定采用流式細(xì)胞術(shù)方法，具體步驟見參考文獻(xiàn)[10]。

2 結(jié) 果

2.1高溫濕熱影響大鼠脾臟TLR4+細(xì)胞的數(shù)量 37 ℃高溫濕熱導(dǎo)致大鼠脾臟TLR4+細(xì)胞數(shù)量下降(P<0.05)，即使LPS和Con-A刺激大鼠也無法逆轉(zhuǎn)這種免疫抑制狀態(tài)，提示高溫濕熱可破壞機(jī)體天然免疫功能，見表1～3。

表1 非刺激亞組不同時(shí)間點(diǎn)TLR4+細(xì)胞比較

a：P<0.05,與同時(shí)間點(diǎn)20 ℃比較;b：P<0.05與同組1 h比較

表2 LPS刺激亞組不同時(shí)間點(diǎn)TLR4+細(xì)胞比較

a：P<0.05,與同時(shí)間點(diǎn)20 ℃比較;b：P<0.05,與同組1 h比較

2.2高溫濕熱影響大鼠外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞表達(dá) 37 ℃高溫濕熱各亞組外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞在1～48 h較20 ℃顯著下降(P<0.05)，只有LPS刺激168 h則較20 ℃顯著升高(P<0.05)，見表4～6。

表3 Con-A刺激亞組不同時(shí)間點(diǎn)TLR4+細(xì)胞比較

a：P<0.05,與同時(shí)間點(diǎn)20 ℃比較;b：P<0.05，與同組1 h比較

表4 非刺激亞組不同時(shí)間點(diǎn)外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞比較

a：P<0.05,與同時(shí)間點(diǎn)20 ℃比較;b:P<0.05，與同組1 h,12 h,48 h比較

表5 LPS刺激亞組不同時(shí)間點(diǎn)外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞比較

a：P<0.05，與同時(shí)間點(diǎn)20 ℃比較;b:P<0.05，與同組1 h,12 h比較;c:P<0.05，與同組1 h,12 h,48 h比較

表6 Con-A刺激亞組不同時(shí)間點(diǎn)外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞比較

a:P<0.05，與同時(shí)間點(diǎn)20 ℃比較;b:P<0.05，與同組1 h,12 h,48 h比較

2.3高溫濕熱影響大鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞表達(dá) 37 ℃高溫濕熱各亞組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞所占CD4+CD25+Treg細(xì)胞的百分率在12 h高于20 ℃組(P<0.05)，而168 h則顯著低于20 ℃組(P<0.05)，LPS刺激使12 h相對降低。168 h長期高溫濕熱導(dǎo)致外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞顯著減少，可能改變機(jī)體的免疫狀態(tài)，見表7～9。

表7 非刺激亞組不同時(shí)間點(diǎn)外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比較

a:P<0.05,與同時(shí)間點(diǎn)20 ℃比較;b:P<0.05,與同組1 h,48 h,168 h比較;c:P<0.05,與同組1 h比較;d:P<0.05,與同組12 h,48 h比較

2.4高溫影響大鼠外周血CD8+CD25+Treg細(xì)胞表達(dá) 37 ℃高溫濕熱各亞組在1 h和168 h外周血CD8+CD25+Treg細(xì)胞較20 ℃升高(P<0.05)，LPS和Con-A刺激也未明顯改變這種規(guī)律，見表10～12。

表8 LPS刺激亞組不同時(shí)間點(diǎn)外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比較

a:P<0.05,與同時(shí)間點(diǎn)20 ℃比較;b:P<0.05,與同組1 h,168 h比較

表9 Con-A刺激亞組不同時(shí)間點(diǎn)外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比較

a:P<0.05,與同時(shí)間點(diǎn)20 ℃比較;b:P<0.05,與同組12 h,48 h比較;c:P<0.05,與同組12 h,48 h比較

表10 非刺激亞組不同時(shí)間點(diǎn)外周血CD8+CD25+Treg細(xì)胞均數(shù)間的比較

a:P<0.05,與同時(shí)間點(diǎn)20 ℃比較;b:P<0.05,與同組12,48 h比較

表11 LPS刺激亞組不同時(shí)間點(diǎn)外周血CD8+CD25+Treg細(xì)胞比較

a:P<0.05,與同時(shí)間點(diǎn)20 ℃比較;b:P<0.05,與同組12 h,48 h比較

表12 Con-A刺激亞組不同時(shí)間點(diǎn)外周血CD8+CD25+Treg細(xì)胞均數(shù)間的比較

a:P<0.05,與同時(shí)間點(diǎn)20 ℃比較;b:P<0.05,與同組12 h,48 h比較

表13 非刺激亞組不同時(shí)間點(diǎn)外周血CD8+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比較

a:P<0.05,與同時(shí)間點(diǎn)20 ℃比較;b:P<0.05,與同組1 h,48 h,168 h比較

2.5高溫濕熱影響大鼠外周血CD8+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞表達(dá) 37 ℃高溫濕熱非刺激和LPS刺激亞組在12 h和168 h外周血CD8+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞較20 ℃顯著升高(P<0.05)，而Con-A刺激亞組在37 ℃ 168 h則恢復(fù)正常，見表13～15。

表14 LPS刺激亞組不同時(shí)間點(diǎn)外周血CD8+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比較

a:P<0.05,與同時(shí)間點(diǎn)20 ℃比較;b:P<0.05,與同組1 h,48 h,168 h比較

表15 Con-A刺激亞組不同時(shí)間點(diǎn)外周血CD8+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞均數(shù)間的比較

a:P<0.05,與同時(shí)間點(diǎn)20 ℃比較;b:P<0.05,與同組1 h,168 h比較

3 討 論

TLR4存在于髓系非特異性免疫活性細(xì)胞上參與固有免疫和獲得性免疫反應(yīng)[8]，因此免疫活性細(xì)胞TLR4表達(dá)下降不但導(dǎo)致非特異性免疫功能下降，同時(shí)也降低了特異性免疫反應(yīng)。TLR4的刺激劑LPS能夠刺激DCs表達(dá)TLR4增加，促進(jìn)DCs上的TLR4對病原和異物進(jìn)行內(nèi)吞[11]。小鼠靜脈注射LPS 1～5 h后脾組織TLR4、CD14和TNF-α的mRNA表達(dá)逐漸增加[12]。本研究證明大鼠在37 ℃飽和濕度(100%濕度)熱應(yīng)激時(shí)脾臟TLR4+免疫活性細(xì)胞數(shù)量在1～168 h均顯著降低，TLR4的激動(dòng)劑LPS也未能在1～12 h促進(jìn)脾臟免疫活性細(xì)胞表達(dá)TLR4增加，在48～168 h也未能恢復(fù)，而T淋巴細(xì)胞有絲分裂原Con-A刺激更不能改變TLR4表達(dá)被抑制的狀態(tài)，見表1～3。

熱應(yīng)激引起交感神經(jīng)系統(tǒng)(去甲腎上腺素)和下丘腦-垂體-腎上腺系統(tǒng)(腎上腺素)的亢進(jìn)，然而腎上腺素能促進(jìn)LPS刺激的巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)增加、TNF-α、IL-1β分泌，以及CD14表達(dá)[13]，也有報(bào)道證明腎上腺素抑制LPS誘導(dǎo)的單核細(xì)胞IL-1β、IL-8、MCP-1的產(chǎn)生，以及CD11b的表達(dá)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)非刺激組及48～168 h的LPS亞組即使腎上腺素應(yīng)激激素下降后脾臟免疫細(xì)胞TLR4表達(dá)率仍顯著下降，說明高溫高濕環(huán)境下大鼠天然免疫受抑制可能是多因素共同作用的結(jié)果。

去甲腎上腺素升高經(jīng)β2腎上腺能受體導(dǎo)致人和小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖降低、CD8+細(xì)胞減少IFN-γ和TNF-α表達(dá)，出現(xiàn)免疫力降低[15-16]。CD4+CD25+T細(xì)胞和CD8+CD25+T細(xì)胞只有表達(dá)Foxp3后獲得抑制功能[17]，而單純CD4+CD25+T細(xì)胞和CD8+CD25+T細(xì)胞僅僅是輔助和抑制或殺傷功能細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠熱應(yīng)激CD4+CD25+T細(xì)胞和CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞表現(xiàn)不盡相同，大鼠CD4+CD25+Treg細(xì)胞在37 ℃飽和濕度(100%)熱應(yīng)激1～48 h顯著下降，增殖受到明顯抑制，即使T淋巴細(xì)胞刺激劑Con-A刺激也不能改變抑制狀態(tài)，更不用說LPS無關(guān)刺激；而CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞在1～48 h 之內(nèi)并不降低，其中12 h時(shí)間點(diǎn)在非刺激和Con-A刺激組仍顯著升高，這種現(xiàn)象反映熱應(yīng)激早期(1～48 h)機(jī)體出現(xiàn)相對免疫抑制狀態(tài)，將促進(jìn)感染性疾病的發(fā)生；但是長期高溫濕熱應(yīng)激(168 h)，CD4+CD25+Treg細(xì)胞在非刺激和Con-A刺激組恢復(fù)正常，LPS組甚至顯著高于正常對照(20 ℃)，事實(shí)上LPS能夠刺激DC促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖[18]；而CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞在168 h則較正常對照組顯著下降，這可能與熱應(yīng)激激素下降有關(guān)，也許長期高溫濕熱容易導(dǎo)致免疫抑制減弱。

本研究還發(fā)現(xiàn)大鼠熱CD8+CD25+Treg細(xì)胞在37 ℃飽和濕度(100%)熱應(yīng)激在非刺激、LPS刺激及Con-A刺激組1 h均顯著高于20 ℃組，慢慢下降直到48 h達(dá)最低，168 h又顯著升高，可能熱應(yīng)激導(dǎo)致應(yīng)激激素增加后出現(xiàn)機(jī)體炎性反應(yīng)和細(xì)胞毒性作用，然后隨著機(jī)體免疫相對處于抑制狀態(tài)(CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞相對增加)，其CD8+增殖和活化受到抑制，但長期(168 h)高溫濕熱(100%)又顯著升高，可能與同期CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞降低，免疫抑制減弱相關(guān)，Con-A和LPS刺激也對CD8+CD25+Treg細(xì)胞無改變；而CD8+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的表現(xiàn)與CD8+CD25+Treg細(xì)胞不一致，其在1 h和48 h顯著降低，12 h顯著升高，這可能與熱應(yīng)激激素作用相關(guān)，也進(jìn)一步證明CD8+CD25+Treg細(xì)胞被作用后12～48 h顯著降低，但長期(168 h)高溫濕熱(100%)CD8+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞在非刺激和LPS刺激組又顯著升高，其與CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的下降產(chǎn)生互補(bǔ)，避免了免疫過強(qiáng)或變態(tài)反應(yīng)發(fā)生，然而T細(xì)胞有絲分裂原Con-A刺激組則在長期高溫濕熱中CD8+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞并不增加，也許代表著T細(xì)胞在長期高溫濕熱中被抗原刺激容易導(dǎo)致免疫抑制減弱而出現(xiàn)免疫過強(qiáng)或變態(tài)反應(yīng)發(fā)生。HENEKA等[6]證明，MOG(35-55)免疫接種小鼠2 d后開始熱應(yīng)激，結(jié)果實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的發(fā)病率減少了70%，且延遲發(fā)病，并發(fā)癥減輕，白細(xì)胞浸潤減少，CD4+CD25+T細(xì)胞減少，MOG(35-55)活化的T細(xì)胞也下降。

高溫濕熱應(yīng)激機(jī)體CD4+CD25+Treg細(xì)胞及CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞與CD8+CD25+Treg細(xì)胞及CD8+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的表現(xiàn)不相同，因?yàn)檫@兩大類細(xì)胞群體結(jié)構(gòu)不同，功能作用方面也有差別，例如病毒感染高負(fù)荷時(shí)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞也高，而CD8+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞則在病毒高峰后數(shù)天才出現(xiàn)[19]；與CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞不同的是CD8+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞主要通過接觸抑制[20]。CD4+CD25+Treg細(xì)胞與CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞，以及CD8+CD25+Treg細(xì)胞與CD8+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的表現(xiàn)也不相同，其原因是CD4+CD25+Treg細(xì)胞和CD8+CD25+Treg細(xì)胞并不與抑制免疫反應(yīng)相關(guān)，他們是正?；罨妮o助和殺傷及細(xì)胞毒功能細(xì)胞，而CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞和CD8+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞才是抑制性Treg細(xì)胞?？傊?，在高溫濕熱應(yīng)激中機(jī)體的免疫功能在早期有炎性因子產(chǎn)生和細(xì)胞殺傷導(dǎo)致炎性反應(yīng)，而長時(shí)間持續(xù)高溫濕熱應(yīng)激免疫抑制功能增強(qiáng)。

[1]OGLESBEE M J,DIEHL K,CRAWFORD E,et al.Whole body hyperthermia:effects upon canine immune and hemostatic functions[J].Vet Immunol Immunopathol,1999,69(2/4):185-199.

[2]STRONG R A,SILVA E B,CHENG H W,et al.Acute brief heat stress in late gestation alters neonatal calf innate immune functions[J].J Dairy Sci,2015,98(11):7771-7783.

[3]LIU X,LI H,LU A,et al.Reduction of intestinal mucosal immune function in heat-stressed rats and bacterial translocation[J].Int J Hyperthermia,2012,28(8):756-765.

[4]SHAHABI S,HASSAN Z M,MAHDAVI M,et al.Hot and cold natures and some parameters of neuroendocrine and immune systems in traditional Iranian medicine:a preliminary study[J].J Altern Complement Med,2008,4(2):147-156.

[5]MENG D,HU Y,XIAO C,et al.Chronic heat stress inhibits immune responses to H5N1 vaccination through regulating CD4+CD25+Foxp3+Tregs[J].Biomed Res Int,2013,2013(1):160859.

[6]HENEKA M T,SHARP A,MURPHY P,et al.The heat shock response reduces myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in mice[J].J Neurochem,2001,77(2):568-579.

[7]ROMANO C C,MAZZOLA N,PAOLILLO R,et al.Toll-like receptor-4(TLR4) mediates human beta-defensin-2(HBD-2) induction in response to Chlamydia pneumoniae in mononuclear cells[J].FEMS Immunol Med Microbiol,2009,57(2):116-124.

[8]DABBAGH K,DAHLME,STEP ICK-BIEK P,et al.Toll-like receptor 4 is required for optimal development of Th2 immune responses:role of dendritic cells[J].J Immunol,2002,168(9):4524-4530.

[9]KIM J M,RUDENSKY A.The role of the transcription factor Foxp3 in the development of regulatory T cells[J].Immunol Rev,2006,212(1):86-98．

[10]楊思俊，胡微煦，文珠，等.冷應(yīng)激對大鼠細(xì)胞免疫的影響[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2014,41(12):2215-2219.

[11]ANDERSSON L I,HELLMAN P,ERIKSSON H.Receptor-mediated endocytosis of particles by peripheral dendritic cells[J].Hum Immunol,2008,69(10):625-633.

[12]萬幸，王培訓(xùn)，周聯(lián)，等.脂多糖刺激前后小鼠肺肝脾組織中Toll樣等受體基因表達(dá)情況[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué),2004,16(2):73-76.

[13]ZHOU J,YAN J,LIANG H,et al.Epinephrine enhances the response of macrophages under LPS stimulation[J].Biomed Res Int,2014,2014:254686.

[14]MARGARYAN S,HYUSYAN A,MARTIROSYAN A,et al.Differential modulation of innate immune response by epinephrine and estradiol[J].Horm Mol Biol Clin Investig，2017，30(3):46.

[15]CASE A J,ZIMMERMAN M C.Redox-regulated suppression of splenic T-lymphocyte activation in a model of sympathoexcitation[J].Hypertension,2015,65(4):916-923.

[16]ESTRADA L D,AGA? D,FARRAR J D.Sympathetic neural signaling via the β2-adrenergic receptor suppresses T-cell receptor-mediated human and mouse CD8+T-cell effector function[J].Eur J Immunol,2016,46(8):1948-1958.

[17]COSMI L,LIOTTA F,LAZZERI E,et al.Human CD8+CD25+thymocytes share phenotypic and functional features with CD4+CD25+regulatory thymocytes[J].Blood,2003,102(12):4107-4114.

[18]TAKENAKA M C,ARAUJO L P,MARICATO J T,et al.Norepinephrine controls effector T cell differentiation through β2-adrenergic receptor-mediated inhibition of NF-κB and P-1 in dendritic cells[J].J Immunol,2016，196(2):637-644.

[19]KARLSSON I,MALLERET B,BROCHARD P,et al.FoxP3+CD25+CD8+T-cell induction during primary simian immunodeficiency virus infection in cynomolgus macaques correlates with low CD4+T-cell activation and high viral load[J].J Virol,2007,81(24):13444-13455.

[20]MAHIC M,HENJUM K,YAQUB S,et al.Generation of highly suppressive adaptive CD8+CD25+FOXP3+regulatory T cells by continuous antigen stimulation[J].Eur J Immunol,2008,38(3):640-646.