基于Zn2+高靈敏檢測的多肽熒光化學(xué)傳感器的合成及熒光性質(zhì)研究

王 鵬

(西華師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，四川 南充 637009)

鋅是人體所必需的微量元素，主要以離子狀態(tài)作為酶的輔助成分存在于人體細(xì)胞和組織中[1-3]。鋅參與細(xì)胞內(nèi)幾乎所有的新陳代謝過程，在細(xì)胞分裂、激素分泌、基因表達以及蛋白質(zhì)和核酸合成等各方面扮演著重要角色。近年來，檢測Zn2+的熒光化學(xué)傳感器被廣泛報道[4-5]。相比于其他類型熒光化學(xué)傳感器，利用多肽固相合成技術(shù)設(shè)計并合成的多肽熒光化學(xué)傳感器因為合成簡便，水溶性好，靈敏度高，檢測限低及響應(yīng)時間短等優(yōu)勢被化學(xué)工作者所青睞[6-12]。在已有研究工作的基礎(chǔ)上，我們設(shè)計并合成了一個基于熒光比率響應(yīng)模式檢測Zn2+的多肽熒光化學(xué)傳感器L (Dansyl-His-His-Tyr-Pro-Gly-Tyr-His-His-Trp-Gly-NH2)，在傳感器L中，色氨酸(Trp)作為電子供體，脯氨酸(Pro)與甘氨酸(Gly)形成的二肽(Pro-Gly)折疊結(jié)構(gòu)作為連接體，丹磺酰氯(Dansyl)作為電子受體，四個組氨酸(His)作為結(jié)合Zn2+的識別基團，根據(jù)軟硬酸堿理論，組氨酸的咪唑基團可以很好與Zn2+發(fā)生配位結(jié)合作用。L具有很好的水溶性和很高的靈敏度，在290 nm激發(fā)條件下，當(dāng)Zn2+存在時，基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)(FRET)，色氨酸的發(fā)射峰(360 nm)下降，丹磺酰氯的發(fā)射峰(510 nm)上升，在HEPES緩沖溶液中實現(xiàn)了對Zn2+的比率型快速靈敏檢測。

1 實驗部分

1.1 藥品、試劑和儀器

藥品與試劑：Fmoc-Rink Amide 樹脂(0.45 mmol/g)，丹磺酰氯(97%)，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH(99%)，F(xiàn)moc-His(Trt)-OH(99%)，F(xiàn)moc-Pro-OH(99%)，F(xiàn)moc-Gly-OH(99%)，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH(99%)和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(98%)購置于上海淘普生物科技有限公司，脫Fmoc保護基試劑 (六氫吡啶:N,N-二甲基甲酰胺=1∶4，V/V)，接肽試劑 (二異丙基乙胺:N,N-二甲基甲酰胺=174：826，V/V)和多肽裂解液 (三氟乙酸:三異丙基硅烷:蒸餾水=9.5∶0.25∶0.25，V/V/V)在實驗室自行配制；氫氧化鈉(99%)，氯化鈉(99%)，苯酚(99%)，茚三酮(99%)，三氟乙酸(99%)，吡啶(99%)，4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(99%)，二異丙基乙胺(98%)和三異丙基硅烷(97%)購置于上海九鼎化學(xué)有限公司；二氯甲烷，N,N-二甲基甲酰胺，無水乙醇，乙腈，無水乙醚，三乙胺和六氫吡啶等化學(xué)試劑均為分析純，購置于利安隆博華(天津)醫(yī)藥化學(xué)有限公司。所有化學(xué)試劑直接使用，沒有進一步處理。

儀器：精騏牌BC—4201搖床(上海鼎科科學(xué)儀器有限公司)，25 mL多肽合成管(上海鼎科科學(xué)儀器有限公司)，F(xiàn)D—1 Ultra-low freeze dryer型冷凍干燥機(北京比朗實驗設(shè)備有限公司)，Agilent1200液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)，C18半制備分離柱(美國安捷倫科技有限公司)，湘儀牌H1850型高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)，Precisa XB120A型電子天平(上海天美天平儀器有限公司)，Bruker Esquire HCT離子阱質(zhì)譜儀(美國布魯克公司)，島津RF—5301PC 型熒光分光光度計(日本島津公司)。

1.2 L的合成與表征

(1)在電子天平上稱取0.20 g Fmoc-Rink Amide 樹脂，倒入25 mL多肽合成管中，加入10 mL二氯甲烷，浸泡30 min，然后用 N,N-二甲基甲酰胺洗滌3次，向多肽合成管加入脫除Fmoc保護基試劑5 mL，在3D搖床上反應(yīng)30 min；分別用N,N-二甲基甲酰胺，二氯甲烷，無水乙醇，N,N-二甲基甲酰胺各洗滌3次，抽干樹脂，進行K氏檢測，若樹脂顏色變成藍紫色，則說明Fmoc-Rink Amide 樹脂上Fmoc保護基已經(jīng)完全被脫除，可以進行多肽縮合反應(yīng)。

(2)稱取0.10 g Fmoc-Gly-OH和0.20 g HBTU，用N,N-二甲基甲酰胺溶解，加入到上述多肽合成管中，加入的接肽試劑(40 μL)，在3D搖床上反應(yīng)1 h。抽干，進行K氏檢測，若樹脂顏色不變，說明縮合反應(yīng)進行完全。向多肽合成管加入5 mL脫除Fmoc保護基試劑，在3D搖床上反應(yīng)30 min。然后進行K氏檢測，若樹脂顏色變成藍紫色，則進行下一步。

(3)重復(fù)上述(2)操作，直至十肽(His-His-Tyr-Pro-Gly-Tyr-His-His-Trp-Gly-NH2)全部合成完畢，將肽鏈縮合反應(yīng)完的最后一個組氨酸的Fmoc保護基脫除。然后進行K氏檢測，若樹脂顏色變成藍紫色，則說明組氨酸的Fmoc保護基已經(jīng)完全被脫除，可以進行下一步。

(4)稱取丹磺酰氯(0.1 g)，用N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后加入上述多肽合成管中，加入三乙胺(40 μL)，在3D搖床上反應(yīng)4 h。分別用N,N-二甲基甲酰胺，二氯甲烷，無水乙醇洗滌3次，抽干。

(5)現(xiàn)配4 mL的多肽裂解液，加入多肽合成管中，在3D搖床上反應(yīng)4 h。將裂解得到的多肽產(chǎn)物倒入離心管中，加入-20℃無水乙醚，離心，棄去上清液，即得粗產(chǎn)物。

(6)利用高效液相色譜將粗產(chǎn)物進行純化，由高效液相色譜純化圖可知產(chǎn)物的純度高達95.65%，符合各項熒光檢測的要求。利用Esquire 6 000離子阱質(zhì)譜儀對L進行結(jié)構(gòu)表征，由質(zhì)譜圖得到兩個最高質(zhì)譜峰分別為1 522.3578 g/mol和1 544.308 6 g/mol，最高質(zhì)譜峰值分別對應(yīng)[L+ H]+和[L +Na]+。由兩個質(zhì)譜峰可以看出是我們得到了目標(biāo)產(chǎn)物。

2 結(jié)果與討論

2.1 金屬離子選擇性研究

配置濃度為10-2mol/L，pH=7.4的HEPES緩沖溶液，10-3mol/L的熒光傳感器L溶液和15種10-3mol/L的金屬離子(Ag+,Al3+,Ca2+,Cd2+,Co2+,Cr3+,Cu2+,Fe3+,Hg2+,K+,Mn2+,Na+,Ni2+,Pb2+,Zn2+)溶液。在熒光比色皿中加入2 mL，10-2mol/L的HEPES緩沖溶液，依次分別加入20 μL，10-3mol/L的L溶液和20 μL，10-3mol/L的15種金屬離子，并在熒光分光光度計中檢測L對于15種金屬離子的選擇性識別檢測情況(圖1)。由圖1a可以看出，若用290 nm激發(fā)，在含有L的HEPES緩沖溶液中加入Zn2+之后，由于色氨酸和丹磺酰氯之間存在熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光能量從色氨酸轉(zhuǎn)移到丹磺酰氯，因此色氨酸的發(fā)射峰(360 nm)下降，丹磺酰氯的發(fā)射峰(510 nm)上升，熒光檢測呈比率模式；當(dāng)其他14種金屬離子加入傳感器L之后，L的熒光響應(yīng)強度與L單獨存在時相同，基本沒有變化，所以在15種金屬離子中，L可以通過比率型模式特異性識別Zn2+，而其他相關(guān)金屬離子沒有相同的比率模式響應(yīng)。由圖1b可以看出，當(dāng)Zn2+加入傳感器L后，熒光比率(F510/F360)：增強了約8倍。這充分說明在290 nm激發(fā)下，在10-2mol/L，pH=7.4的HEPES緩沖溶液中，L可以實現(xiàn)對Zn2+的高選擇性快速檢測，而且熒光響應(yīng)信號變化明顯。

2.2 金屬離子競爭性研究

探討化學(xué)傳感器的熒光性質(zhì)時，必須考察傳感器抗其他相關(guān)金屬離子干擾的能力。因此我們做了其他14種相關(guān)金屬離子對Zn2+檢測的熒光競爭實驗。在熒光比色皿中加入2 mL，10-2mol/L的HEPES緩沖溶液 (pH=7.4)，20 μL，10-3mol/L的L溶液和20 μL，10-3mol/L的Zn2+，記錄下最大熒光發(fā)射峰值，然后分別在上述L-Zn混合溶液中加入20 μL，5×10-3mol/L其他14種金屬離子，記錄下最大熒光發(fā)射峰值，然后得到熒光干擾競爭圖，由圖2可以看出，傳感器L在檢測Zn2+的過程中，即使加入5倍量的其他金屬離子，除過Al3+，其他金屬離子幾乎不存在競爭和干擾現(xiàn)象，但Al3+的干擾也在預(yù)期的誤差范圍之內(nèi)。實驗現(xiàn)象表明L具有良好的抗干擾能力，可應(yīng)用于其他金屬離子存在的復(fù)雜環(huán)境中實現(xiàn)對Zn2+的特異性檢測。

2.3 Zn2+熒光滴定研究

為了確定傳感器L與Zn2+的配位結(jié)合模式，我們做了Zn2+的熒光滴定實驗。在熒光比色皿中加入2 mL，10-2mol/L的HEPES緩沖溶液 (pH=7.4)和20 μL，10-3mol/L的L溶液，然后累計依次加入0～1.5 eq.的10-3mol/L的Zn2+進行熒光測量，記錄下360 nm和510 nm處的最大熒光發(fā)射峰值，得到Zn2+的熒光滴定圖和熒光滴定趨勢圖(圖3)。從熒光滴定圖(圖3a)可以看出，在290 nm激發(fā)下，隨著Zn2+濃度依次遞增，傳感器L中色氨酸的發(fā)射峰(360 nm)逐漸下降，相應(yīng)的丹磺酰氯的發(fā)射峰(515 nm)逐漸上升，能量從色氨酸轉(zhuǎn)移到丹磺酰氯。從熒光滴定趨勢圖(圖3b)可以看出，當(dāng)Zn2+濃度滴加到達20 μL時，熒光滴定達到飽和，由此可以得出L和Zn2+的結(jié)合比例是1∶1，即一個L分子結(jié)合一個Zn2+。

2.4 Job工作曲線測定

Job工作曲線也是確定傳感器和金屬離子結(jié)合模式的重要手段之一。在290 nm激發(fā)下，我們分別向熒光比色皿中加入2 mL，10-2mol/L的HEPES緩沖溶液 (pH=7.4)，然后加入10-3mol/L的L和10-3mol/L的Zn2+離子，L體積在20 μL～0 μL范圍內(nèi)依次等梯度遞減，同時Zn2+的體積在0～20 μL范圍內(nèi)依次等梯度遞增，且兩者體積之和始終為20 μL。記錄下各比例條件下的最大熒光發(fā)射峰值，作圖后的丹磺酰氯和色氨酸熒光強度比(F510/F360)最大時的濃度比即為L和Zn2+的結(jié)合比。根據(jù)配體L-Zn的Job曲線圖(圖4)再次證實L與Zn2+以1∶1的方式進行結(jié)合。

2.5 pH響應(yīng)研究

將多肽化學(xué)熒光傳感器應(yīng)用于生理條件范圍內(nèi)檢測Zn2+具有重大的生物應(yīng)用意義。為此我們做了pH熒光響應(yīng)實驗，即在pH=2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12的10-2mol/L的HEPES緩沖溶液中分別測試20 μL，10-3mol/L的L和20 μL，10-3mol/L的L-Zn的比率熒光強度變化情況。圖5為傳感器L和L-Zn的熒光強度隨pH變化的響應(yīng)趨勢圖。由該圖可以清晰的看出，當(dāng)傳感器L溶液單獨存在時，丹磺酰氯和色氨酸熒光強度比(F510/F360)在pH為 2～12范圍內(nèi)基本沒有什么變化，然而在L溶液中加入Zn2+形成配合物后，在6～10的pH范圍內(nèi)丹磺酰氯和色氨酸熒光強度比(F510/F360)明顯高于L單獨存在時的熒光強度比。文獻報道人體生理pH值約為7.0～7.4，因此L可以在生理范圍內(nèi)實現(xiàn)對Zn2+的熒光檢測研究。

2.6 Zn2+的檢測限研究

通過熒光滴定數(shù)據(jù)，我們可以計算出Zn2+的檢測限。在2 mL，10-2mol/L的HEPES緩沖溶液 (pH=7.4)中，通過逐次等量遞增Zn2+濃度，在發(fā)射波長在510 nm處測得系列熒光強度數(shù)據(jù)。重復(fù)三組平行實驗取最好的一組并求標(biāo)準(zhǔn)偏差得到圖6，從圖6可以觀察到，在Zn2+濃度為0～1.5 μM范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性曲線(R=0.9887)。最后，利用檢測限LOD=3σ/k公式計算出Zn2+的最低檢測限為59 nM。該實驗結(jié)果表明傳感器L可以在體外實現(xiàn)對Zn2+的高靈敏檢測。

3 結(jié) 論

合成了一個新穎的多肽熒光化學(xué)傳感器L(Dansyl-His-His-Tyr-Pro-Gly-Tyr-His-His-Trp-Gly-NH2)，基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移機理，在HEPES緩沖溶液中實現(xiàn)了對Zn2+的高靈敏比率型檢測。通過熒光選擇實驗分析發(fā)現(xiàn)L對Zn2+具有很好的特異性熒光檢測性能；通過Zn2+熒光滴定實驗和Job工作曲線可知L和Zn2+的以1∶1的結(jié)合方式進行配位結(jié)合；通過相關(guān)金屬離子競爭性實驗得到其他14種金屬離子對Zn2+的檢測基本沒有干擾作用；通過pH響應(yīng)實驗得知L對Zn2+在人體生理范圍內(nèi)均有較好的識別能力；最后，通過計算得到Zn2+的最低檢測限為59 nM。綜上所述，在HEPES緩沖溶液中，傳感器L能夠高靈敏特異性實現(xiàn)對Zn2+離子的比率模式檢測。

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