巴氏生孢八疊球菌用作混凝土裂縫愈合劑的活性研究

陳 歆， 韓依璇， 張國榮， 馬 聰， 朱小駿

(1.蘇交科集團(tuán)股份有限公司 在役長大橋梁安全與健康國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 211112；2.中南大學(xué) 土木工程學(xué)院， 湖南 長沙 410075； 3.河海大學(xué) 土木與交通學(xué)院， 江蘇 南京 210098)

近年來，隨著微生物學(xué)、地球化學(xué)、無機(jī)材料學(xué)、土木工程等學(xué)科間的交叉研究不斷發(fā)展，微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉淀技術(shù)逐步應(yīng)用于各相關(guān)領(lǐng)域[1-4].本世紀(jì)初，國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)開展了將這一技術(shù)應(yīng)用于混凝土裂縫修補(bǔ)的研究[5-8].本文所用微生物為巴氏生孢八疊球菌(Sporosarcina pasteurii，以下簡稱S. pasteurii，在舊生物分類系統(tǒng)里稱巴氏芽孢桿菌，Bacillus pasteurii).其能通過分泌脲酶催化尿素水解，水解產(chǎn)物中的碳酸根離子能與前體鈣源中的鈣離子結(jié)合產(chǎn)生碳酸鈣沉淀.

作為最早被應(yīng)用于土木工程領(lǐng)域的微生物之一，國內(nèi)外學(xué)者對影響S. pasteurii活性的因素開展了許多研究.Bang等[9]證實(shí)了較高的菌濃度為S. pasteurii修復(fù)效果的保證.Okwadha等[10]研究了常規(guī)環(huán)境下不同微生物濃度、鈣離子濃度、尿素濃度以及溫度與pH值對脲酶活性的影響，得到了最適碳酸鈣沉積參數(shù).趙茜[11]基于巖土工程的環(huán)境條件，也對脲酶作過類似的研究.李沛豪等[12]還探究了前體鈣源對碳酸鈣晶相的影響.但脲酶活性并不完全等同于微生物活性，S. pasteurii在混凝土裂縫修補(bǔ)過程中的活性是其存活能力、脲酶分泌能力及脲酶活性的綜合體現(xiàn).而且，微生物技術(shù)在混凝土領(lǐng)域應(yīng)用的研究起步較晚，對其應(yīng)用于實(shí)體混凝土工程時(shí)面臨的迥異于土壤的復(fù)雜環(huán)境還缺乏針對性研究，對微生物(非單純脲酶)的強(qiáng)堿耐受性、尿素濃度適應(yīng)性與溫度適應(yīng)性等方面的研究有所欠缺，難以對工程應(yīng)用提供理論支持.

基于此，本文不再以細(xì)菌所分泌的脲酶作為研究對象，而是對完整的細(xì)菌-尿素-鈣源溶液體系進(jìn)行研究，在自變量及其范圍的選擇上更貼近愈合劑在戶外混凝土結(jié)構(gòu)上施作時(shí)可能面臨的復(fù)雜環(huán)境.本文探究了弱堿至強(qiáng)堿環(huán)境下S. pasteurii的尿素水解活性與碳酸鈣產(chǎn)率的差別，考察了S. pasteurii的尿素濃度適應(yīng)性與溫度適應(yīng)性，分析了愈合劑中外加鈣源不足時(shí)的影響，測試了愈合產(chǎn)物的化學(xué)成分與晶體結(jié)構(gòu)，為S. pasteurii用作混凝土裂縫愈合劑的施工作業(yè)提供技術(shù)指導(dǎo)與數(shù)據(jù)支持.

1 材料與方法

1.1 菌液制備

巴氏生孢八疊球菌(S. pasteurii)，中國普通微生物菌種保藏管理中心編號CGMCC 1.3687，分離號DSM33，分離源為土壤.菌液配置方法參照文獻(xiàn)[11]，配置菌株生長所需的培養(yǎng)基(酵母提取物，20g/L；NH4Cl，10g/L；MnSO4·H2O，10mg/L；NiCl·6H2O，1.2mg/L)，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5，培養(yǎng)得到高濃縮菌液，放入4℃冰箱中冷藏待用.

1.2 試驗(yàn)方法

測定碳酸鈣產(chǎn)量時(shí)外加鈣源為醋酸鈣，溶液中醋酸鈣與尿素的摩爾比為1∶1，采用對溶液反復(fù)離心水洗后烘干稱量的方法：在20℃下，待菌液與尿素在塑料管中反應(yīng)90h后，電導(dǎo)率不再明顯變化，將醋酸鈣加入混合液中，擰緊管蓋震蕩，使醋酸鈣和混合液充分反應(yīng)，生成白色沉淀，靜置24h.將塑料管置于離心機(jī)中離心(4000r/min，10min)，棄去上層清液后加入蒸餾水再次離心，反復(fù)3次后將沉淀物置于烘箱(80℃)中，6h后取出稱量，并留作元素組成與晶體結(jié)構(gòu)分析的樣品.

2 結(jié)果與分析

2.1 強(qiáng)堿耐受性

不同初始pH值下的菌液電導(dǎo)率和細(xì)菌活性(即電導(dǎo)率的變化速率)隨時(shí)間的變化關(guān)系如圖1，2所示.不同初始pH值下S. pasteurii-尿素-醋酸鈣溶液體系的碳酸鈣產(chǎn)量見圖3.

圖1 不同初始pH值下菌液電導(dǎo)率隨時(shí)間的變化Fig.1 Time-varying conductivity of bacteria solutions with different initial pH values

圖2 不同初始pH值下菌液電導(dǎo)率變化速率隨時(shí)間的變化Fig.2 Time-varying conductivity variation rate of bacteria solutions with different initial pH values

圖3 不同初始pH值下菌液的碳酸鈣產(chǎn)量Fig.3 Production of calcium carbonate of bacteria solutions with different initial pH values

從圖1，2可以看出，初始pH值為12.0的菌液電導(dǎo)率先略有下降，而后開始上升，其上升趨勢相較初始pH值為8.5，10.0和11.0的3組曲線滯后6h.說明初始pH值為12.0的強(qiáng)堿性環(huán)境會(huì)在一段時(shí)間內(nèi)抑制S. pasteurii的活性，但不足以對其造成傷害，S. pasteurii 會(huì)自我調(diào)節(jié)并分泌脲酶.初始pH值為13.0的菌液電導(dǎo)率及其變化速率維持恒定，可見初始pH值為13.0的強(qiáng)堿性環(huán)境超出了S. pasteurii的強(qiáng)堿耐受極限，S. pasteurii遭到破壞.

圖2中，除初始pH值為13.0的曲線外，其他曲線都大體呈現(xiàn)先降低后略升高最后降低至趨于0的態(tài)勢.結(jié)合圖1可見，初始pH=8.5條件下菌液反應(yīng)最先達(dá)到平衡，其次是初始pH值為10.0和11.0的菌液，最后是初始pH值為12.0的菌液.由此可知，初始pH=8.5時(shí)，S. pasteurii菌液的電導(dǎo)率變化速率最先到達(dá)平衡，并且隨著環(huán)境初始pH值的升高，菌液電導(dǎo)率變化速率到達(dá)平衡所需時(shí)間延長.

由圖3可見，初始pH=13.0的環(huán)境下S. pasteurii不能誘導(dǎo)碳酸鈣沉淀.初始pH值為10.0～12.0時(shí)對S. pasteurii誘導(dǎo)碳酸鈣沉淀最有利.

基于上述分析，S. pasteurii作為混凝土(其孔溶液pH值一般大于12.5)裂縫愈合劑時(shí)，其活性可能會(huì)受到抑制.考慮到修補(bǔ)初期愈合劑中溶劑較多，對混凝土孔溶液有一定稀釋作用，其工作環(huán)境應(yīng)當(dāng)在S. pasteurii可耐受范圍之內(nèi).后期愈合劑中的溶劑蒸發(fā)，其對孔溶液的稀釋作用減弱，pH值重新升高，可能對S. pasteurii的存活構(gòu)成威脅.因此，可考慮在愈合劑中增加酸堿緩沖組分.

2.2 尿素濃度適應(yīng)性

不同尿素濃度下(初始pH=8.5)菌液電導(dǎo)率變化速率測試結(jié)果如圖4所示.

圖4 不同尿素濃度下菌液電導(dǎo)率變化速率Fig.4 Conductivity variation rate of bacteria solutions with different urea concentrations

由圖4可見，菌液電導(dǎo)率變化速率總體上隨尿素濃度升高而升高.在尿素濃度達(dá)到0.6mol/L后，菌液電導(dǎo)率變化速率趨于穩(wěn)定.整體曲線走向與趙茜[11]對脲酶所做的試驗(yàn)結(jié)果大體一致，證明各尿素濃度下細(xì)菌活性差異為脲酶活性差異，尿素濃度對S. pasteurii的脲酶分泌本身影響不大.實(shí)際工程中，愈合劑注入裂縫后其濃度會(huì)在蒸發(fā)作用下進(jìn)一步提升，所以考慮到經(jīng)濟(jì)性，工程應(yīng)用時(shí)愈合劑中的尿素濃度宜為0.6mol/L.

2.3 溫度適應(yīng)性

在10～40℃水浴下(初始pH=8.5，尿素濃度為1.0mol/L)菌液電導(dǎo)率和菌液電導(dǎo)率變化速率測試結(jié)果見圖5，6.

圖5 不同溫度下菌液電導(dǎo)率隨時(shí)間變化Fig.5 Time-varying conductivity of bacteria solutions at different temperatures

圖6 不同溫度下菌液電導(dǎo)率變化速率隨時(shí)間變化Fig.6 Time-varying conductivity variation rate of bacteria solutions at different temperatures

由圖5,6可見，在10～40℃內(nèi)，S. pasteurii活性隨溫度升高而升高.隨著時(shí)間增加，S. pasteurii活性有所衰減，由溫度差異帶來的活性差距也逐漸減小.中國普通微生物菌種保藏管理中心資料顯示S. pasteurii的最適培養(yǎng)溫度為30℃，而Moyo等[14]的研究結(jié)果顯示脲酶的最適溫度為45℃以上，因此即使溫度超過30℃(江蘇省夏季日均最高氣溫)，其活性依然隨溫度上升(見圖5，6)，故建議該種愈合劑于夏季高溫時(shí)段施工作業(yè).

2.4 外加鈣源不足的影響

不同初始pH值下S. pasteurii-尿素-氫氧化鈣溶液的pH值隨時(shí)間變化如圖7所示.

圖7 不同初始pH值下溶液pH值隨時(shí)間的變化Fig.7 Time-varying pH value of solutions with different initial pH values

由圖7可見，初始pH值為8.5，10.0，11.0的溶液pH值隨時(shí)間延長都很快被調(diào)節(jié)為9.5.初始pH值為12.0的溶液經(jīng)過一段時(shí)間后，pH值也被調(diào)節(jié)為9.5，而初始pH值為13.0的溶液pH值一直維持恒定.

因此，在利用S. pasteurii作為混凝土裂縫愈合劑時(shí)，外加的前體鈣源一定要充足，否則將會(huì)消耗混凝土孔溶液中的氫氧化鈣，加劇混凝土的碳化，對保護(hù)層內(nèi)鋼筋的耐久性和C-S-H凝膠基體的穩(wěn)定性帶來不良影響.此外，尿素水解生成的(NH4)2CO3具有酸堿緩沖作用，會(huì)降低原混凝土孔溶液的堿度，所以S. pasteurii更適用于混凝土表層開裂的修補(bǔ).

2.5 元素組成與微觀形貌

采用掃描電鏡能譜儀(SEM-EDS)對沉淀物進(jìn)行化學(xué)元素分析，其結(jié)果見圖8和表1.沉淀物微觀形貌觀測和晶體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見圖9，10.從圖8與表1中可判斷沉淀物應(yīng)全部為碳酸鈣，尿素水解產(chǎn)物與醋酸鈣反應(yīng)完全，肯定了S. pasteurii的工作效率.圖9顯示S. pasteurii-尿素-醋酸鈣體系沉淀物微觀形貌呈多晶球形，經(jīng)XRD分析(見圖10)，其主要成分為球霰石，不同于以氯化鈣作前體鈣源時(shí)所生成的方解石[12].此結(jié)果與李沛豪等[12]的試驗(yàn)結(jié)果相符.

2.6 修復(fù)效果

采用S. pasteurii-尿素-醋酸鈣作為裂縫愈合劑(尿素濃度0.6mol/L,室溫20℃)，按文獻(xiàn)[13]的方法對混凝土裂縫進(jìn)行修補(bǔ).修補(bǔ)后用水沖洗試件表面，用刷子刷去非裂縫處沉積的碳酸鈣(愈合劑在施用過程中溢出所致)，烘干.修補(bǔ)前、修補(bǔ)中、修補(bǔ)后的裂縫對比見圖11.修補(bǔ)后，白色沉淀物(球霰石形式的碳酸鈣)完全封閉裂縫表面，能阻礙外部有害物質(zhì)進(jìn)入混凝土內(nèi)部，初步驗(yàn)證了S. pasteurii-尿素-醋酸鈣體系作為混凝土裂縫愈合劑的可行性.混凝土裂縫內(nèi)部的填充率及開裂混凝土各項(xiàng)性能的補(bǔ)償效果尚需進(jìn)一步試驗(yàn)研究.

圖8 掃描電鏡能譜儀分析圖Fig.8 SEM-EDS analysis diagram

ElementMass fraction/%Atomic number percentage/%C15.3028.43O29.1240.62Ca55.5930.95

圖9 沉淀物SEM形貌Fig.9 SEM micro morphology of precipitation

圖10 沉淀物XRD晶相分析結(jié)果Fig.10 XRD crystal phase analysis of precipitation

圖11 某裂縫修補(bǔ)前中后對比Fig.11 Comparison of a crack before, during and after healing

3 結(jié)論

(1)pH值為11.0～12.0的溶液體系對巴氏生孢八疊球菌誘導(dǎo)碳酸鈣沉淀最有利.但由于體系pH值低于混凝土孔溶液pH值，因此在實(shí)際應(yīng)用時(shí)混凝土內(nèi)部的強(qiáng)堿環(huán)境逼近或可能超出該菌的強(qiáng)堿耐受極限.

(2)工程應(yīng)用時(shí)，愈合劑中的尿素濃度宜為0.6mol/L.在10～40℃范圍內(nèi)，溫度越高，巴氏生孢八疊球菌活性越大，建議該種愈合劑于夏季高溫時(shí)段作業(yè).

(3)利用巴氏生孢八疊球菌作為混凝土裂縫愈合劑時(shí)，外加的前體鈣源要充足，否則會(huì)對結(jié)構(gòu)耐久性帶來不良影響.由于尿素水解生成的碳酸銨具有酸堿緩沖作用，會(huì)降低原混凝土孔溶液的堿度，因此該種愈合劑更適合混凝土表層開裂的修補(bǔ).

(4)S. pasteurii-尿素-醋酸鈣溶液體系中的沉淀物呈多晶球形，為球霰石形式的碳酸鈣.該溶液體系可用于混凝土裂縫修補(bǔ).

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