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    Numb基因不同亞型對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖和遷移能力的影響

    2018-07-05 09:29:26王保壘李華順2朱晨光
    關(guān)鍵詞:劃痕細(xì)胞系亞型

    蘇 杭, 王保壘, 李華順2,, 朱晨光

    (1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海200444;2.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院干細(xì)胞與納米醫(yī)學(xué)研究中心,上海201210;3.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)高等研究院,上海200085)

    Numb作為細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)性分裂的決定分子,最早被發(fā)現(xiàn)參與神經(jīng)系統(tǒng)的不對(duì)稱(chēng)分裂,近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)[1].Numb的缺陷會(huì)導(dǎo)致腫瘤的惡性程度增大,Numb在抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)中的作用也較受關(guān)注[2].然而Numb表達(dá)缺陷導(dǎo)致腫瘤惡性程度增大的機(jī)制尚不清楚.研究表明,Numb能夠阻滯抑癌蛋白p53被泛素化和降解的過(guò)程,并且與Notch,Hedgehog等重要信號(hào)通路密切相關(guān);同時(shí),Numb還是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)吞的因子[3-8].據(jù)報(bào)道Numb有6種剪切形式,但是最為廣泛關(guān)注的剪切體有4種,分別為膜聯(lián)形式(p66和p72)和胞質(zhì)形式(p65和p71),其分子及細(xì)胞內(nèi)定位的多樣性使研究Numb的功能機(jī)制變得更為復(fù)雜[9-12].過(guò)去的一項(xiàng)研究對(duì)321例乳腺癌樣本Numb進(jìn)行免疫組化分析,發(fā)現(xiàn)Numb陽(yáng)性率越低,乳腺癌的惡性程度就會(huì)越大[5].但是,很多研究?jī)H僅通過(guò)Numb表達(dá)的總量來(lái)對(duì)腫瘤惡性程度進(jìn)行分類(lèi),很少有研究涉及到Numb蛋白不同亞型在腫瘤細(xì)胞中的作用,而Numb的不同蛋白亞型之間,不論是在發(fā)育的時(shí)空表達(dá)方面,還是在功能方面,都有明顯差異.研究Numb的不同亞型在腫瘤中的表達(dá)和功能,是一項(xiàng)亟待解決的問(wèn)題.

    區(qū)分Numb不同形式的拼接分子的不同功能,對(duì)進(jìn)一步了解Numb的功能及其調(diào)控機(jī)制極為必要.基于前期的研究結(jié)果,本工作研究Numb在乳腺癌細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中的作用,并著重探討不同拼接形式的Numb亞型對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用及機(jī)制,嘗試以Numb的不同亞型表達(dá)高低作為腫瘤惡性程度分型的標(biāo)志,為癌癥個(gè)性化治療提供指導(dǎo).

    1 材料與方法

    1.1 材料

    DMEM(dulbeceo’s modif i ed eagle medium)培養(yǎng)液(高糖)、胎牛血清、磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buあer saline,PBS)(Hyclone公司);胰蛋白酶-乙二胺四乙醇(ethylendiaminetetraacetic acid)(Life Technologies公司);轉(zhuǎn)染試劑Megatran1.0(Origene公司);細(xì)胞系篩選抗生素嘌呤霉素(Puromycin)(Sigma公司);放射免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液(強(qiáng))(碧云天公司);蛋白酶抑制劑coctail(Roche公司);質(zhì)粒小量提取試劑(Omega公司);質(zhì)粒中量提取試劑(MN公司);基因組提取試劑(天根生物公司);轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(transcription activator-like eあector nuclease,TALEN)試劑(斯丹賽公司);各種限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和PstⅠ(NEB公司);細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑CCK-8(同仁化學(xué)公司);人乳腺細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞和人胚腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù));兔抗人Numb多克隆抗體(Cell Signaling Technology公司);大鼠抗小鼠E-cadherin抗體(Takara公司);小鼠來(lái)源β-actin內(nèi)參抗體(金斯瑞公司);山羊抗兔IgG(H&L)Antibody IRDye800CW抗體和山羊抗小鼠IgG(H&L)Antibody IRDye800CW抗體(Rockland Immunochemicals公司);Numb剪切體表達(dá)載體p65,p66,p71和p72(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院王保壘老師構(gòu)建).

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

    乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人胚腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞均采用含10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)液,置于37°C、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

    1.3 TALEN打靶載體構(gòu)建及驗(yàn)證

    人體Numb基因有23個(gè)轉(zhuǎn)錄本,選取23個(gè)轉(zhuǎn)錄本中共同的編程序列(coding sequencce,CDS)區(qū)TCCAGAGGCCAGTCGTCCACATCAGTGGCAGACAGATGAAGAAGGCGTTCGC設(shè)計(jì)打靶位點(diǎn)組合.TALEN打靶載體的構(gòu)建及驗(yàn)證參照斯丹賽公司提供的TALEN試劑盒使用說(shuō)明書(shū).

    1.4 Numb敲除的MCF-7細(xì)胞系構(gòu)建

    在成功構(gòu)建Numb基因TALEN打靶載體后,利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Megatran 1.0按標(biāo)準(zhǔn)方法將載體轉(zhuǎn)入MCF-7細(xì)胞,Megatran 1.0與載體比例為3μL:1μg.24 h后換成含2μg/mL Puromycin的篩選培養(yǎng)基,篩選培養(yǎng)3 d,3 d后去上清,用PBS洗3次,消化細(xì)胞并計(jì)數(shù),利用有限稀釋法接種在96孔板中,待單克隆細(xì)胞團(tuán)長(zhǎng)起,消化細(xì)胞,提取基因組,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增Numb基因片段,送測(cè)序.Numb基因PCR引物序列 (5’-3’):AGAGGTAGATGGGTAGGCAGA,CACTCCCTCAGCTTCACCAG.Numb 基因測(cè)序引物序列(5’-3’):GTTAGTATGGTAAT-CCAAAG.選取Numb基因發(fā)生突變的細(xì)胞系,經(jīng)Western blot檢測(cè)Numb蛋白表達(dá)情況,選取不表達(dá)蛋白的細(xì)胞系,作為Numb-KO穩(wěn)定細(xì)胞系.

    1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)

    Numb基因敲除和正常MCF-7細(xì)胞用胰酶消化,收集細(xì)胞,用冷的PBS洗3次,然后用蛋白裂解液RIPA(強(qiáng))冰上裂解30 min,4°C 13 000 g離心15 min,取上清即為提取的總蛋白懸液;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法測(cè)量蛋白質(zhì)量百分比,加入SDS上樣緩沖液100°C煮5 min,冰上放置5 min,即可進(jìn)行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳(polyacrylamide gel electroph-oresis,PAGE)電泳;完成電泳后轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene f l uoride,PVDF)膜上,294 mA,1 h;用含5%脫脂奶粉的PBS封閉1 h;4°C一抗(1:1 000)過(guò)夜,然后用PBS洗3次,每次5 min;二抗(1:10 000)室溫孵育1 h,然后用PBS洗3次,每次5 min,利用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)成像.

    1.6 Numb各亞型瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建

    將p65,p66,p71,p72和EGPF這5種質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)Numb-KO MCF-7細(xì)胞中,分別命名為p65組,p66組,p71組,p72組和增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced green f l uorescent protein,EGFP)組(陰性對(duì)照).使用的轉(zhuǎn)染試劑為Megaran 1.0,于轉(zhuǎn)染后24 h更換培養(yǎng)基,各瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞系用于以后的實(shí)驗(yàn).

    1.7 細(xì)胞增殖曲線(xiàn)測(cè)定

    收集細(xì)胞,加細(xì)胞懸液100μL(5 000個(gè)細(xì)胞)到96孔板(邊緣孔用無(wú)菌水或PBS填充).設(shè)置空白孔(有培養(yǎng)基,無(wú)細(xì)胞)和對(duì)照孔(正常MCF-7細(xì)胞),每組設(shè)定5個(gè)復(fù)孔.置37°C,5%CO2孵育過(guò)夜,倒置于顯微鏡下觀(guān)察.每孔加入10μL CCK-8溶液,37°C孵育1 h.測(cè)定450 nm各孔的吸光值.將各測(cè)試孔的光密度值(optical density,OD)值減去空白孔OD值,即為相對(duì)吸光度.

    1.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定遷移能力

    將Numb-KO MCF-7組、MCF-7組細(xì)胞接種于6孔板中(5×104個(gè)細(xì)胞/孔),待細(xì)胞呈現(xiàn)單層緊密貼壁生長(zhǎng)時(shí)用黃色移液器吸頭劃痕,用PBS洗去懸浮細(xì)胞,用含2%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞.分別于劃痕后0,24,48 h在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察并拍照,并應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量劃痕間的距離,計(jì)算細(xì)胞遷移率.

    1.9 PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期

    計(jì)數(shù)細(xì)胞,在流式管中加入1×106個(gè)細(xì)胞,用PBS洗滌1次(300 g離心5 min).用多聚甲醛固定細(xì)胞:去上清,加入500μL冷PBS,輕柔混勻.加入500μL的4°C的2%多聚甲醛,再次混勻.4°C孵育1 h.乙醇破膜:300 g離心5 min,去上清,再次用3 mL冷PBS洗滌1次.逐滴加入1 mL 70%的乙醇(?20°C),邊加邊振蕩混勻,4°C孵育過(guò)夜.PI染色:300 g離心5 min,去上清,加入RNAse工作液1 mL,室溫放置30 min,300 g離心,去上清加入1 mL碘化丙啶(propidium iodide,PI)工作液,37°C避光孵育30 min,用40或70μm的濾網(wǎng)過(guò)濾掉團(tuán)塊.上機(jī)分析.

    1.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面蛋白

    將單細(xì)胞懸液加入離心管中,離心,300 g,5 min,棄上清液.以冷PBS 1 mL離心洗滌,棄上清液.用PBS稀釋的第一抗體200μL,對(duì)照管中加入對(duì)應(yīng)于一抗的動(dòng)物IgG,輕輕吹打混勻,4°C或置冰上孵育1.5~2.0 h.離心,棄上清.PBS 1 mL離心洗滌2次,以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體.PBS適當(dāng)稀釋的熒光素標(biāo)記的第二抗體200μL,吹打混勻,4°C或置冰上孵育30 min,避光.PBS 1 mL離心洗滌2次.將細(xì)胞重新懸浮于0.5 mL的PBS中,混勻,置流式管中,避光,4°C冰箱保存,4 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè).

    1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    本工作中的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次.采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,用Student’s t-test分析2組間的差異,以p<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

    2 結(jié)果

    2.1 利用TALEN技術(shù)建立Numb基因敲除體外模型

    構(gòu)建的TALEN敲除載體轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后,經(jīng)Puromycin抗性篩選,單克隆挑取,PCR擴(kuò)增Numb靶點(diǎn)DNA序列,測(cè)序驗(yàn)證,選取Numb基因發(fā)生突變的單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng).測(cè)序結(jié)果顯示,Numb-KO MCF-7細(xì)胞Numb基因發(fā)生缺失7個(gè)堿基的突變(見(jiàn)圖1).經(jīng)Western blot檢測(cè),檢測(cè)不到Numb蛋白的表達(dá),故Numb敲除細(xì)胞模型成功建立(見(jiàn)圖2).

    2.2 Numb基因敲除促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖

    CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果顯示,從培養(yǎng)第3天起,Numb-KO MCF-7的細(xì)胞增殖速度明顯高于對(duì)照組正常MCF-7細(xì)胞,說(shuō)明Numb基因敲除能夠明顯促進(jìn)MCF-7的增殖,提示Numb對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展具有抑制作用(見(jiàn)圖3).PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示,在敲除Numb基因后,G0G1期細(xì)胞比例降低了9.28%,G2M期細(xì)胞比例增加了4.36%,S期細(xì)胞比例增加了4.92%,說(shuō)明Numb可以抑制MCF7細(xì)胞由G0G1期往G2M期和S期轉(zhuǎn)化,對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖起到抑制作用(見(jiàn)表1).

    圖1 Numb-KO MCF-7細(xì)胞Numb基因測(cè)序結(jié)果(紅框內(nèi):缺失的堿基)Fig.1 DNA sequencing of Numb in Numb-KO MCF-7 cells(Red box:deleted bases)

    圖2 MCF-7細(xì)胞和Numb-KO MCF-7細(xì)胞Numb表達(dá)Fig.2 Expression of Numb protein in MCF-7 and Numb-KO MCF-7 cells

    圖3 CCK-8檢測(cè)MCF-7細(xì)胞增殖Fig.3 MCF-7 cell proliferation assessed by CCK-8

    表1 PI染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCF-7和Numb-KO MCF-7的細(xì)胞周期Table 1 Detection for cell cycle of MCF-7 and Numb-KO MCF-7 cells by staining with PI and f l ow cytometry %

    2.3 Numb基因敲除促進(jìn)MCF-7細(xì)胞遷移

    采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)正常MCF-7細(xì)胞和Numb敲除后MCF-7細(xì)胞遷移能力的結(jié)果顯示,在細(xì)胞劃痕48 h后,Numb-KO MCF-7細(xì)胞遷移率比陰性對(duì)照組正常MCF-7細(xì)胞遷移率高出22%,提示Numb對(duì)MCF-7細(xì)胞的遷移能力有抑制作用(見(jiàn)圖4).流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)上皮細(xì)胞表面鈣粘蛋白(E-cadherin)結(jié)果顯示,Numb敲除后的MCF-7細(xì)胞細(xì)胞表面E-cadherin的表達(dá)量(平均熒光強(qiáng)度(median f l uoresence intensity,MFI))降低了20.28%,說(shuō)明Numb敲除后MCF-7細(xì)胞間黏附能力減弱,細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)(見(jiàn)圖5).

    2.4 Numb基因各亞型轉(zhuǎn)染效率觀(guān)察

    Numb基因各亞型轉(zhuǎn)染Numb-KO MCF-7細(xì)胞24 h后,在熒光顯微鏡下觀(guān)察可見(jiàn)載體質(zhì)粒上的綠色熒光蛋白表達(dá),細(xì)胞發(fā)出綠色熒光,轉(zhuǎn)染效率大于90%,說(shuō)明載體基因得到充分表達(dá)(見(jiàn)圖6).圖6中,第1行圖為在相差顯微鏡明場(chǎng)下觀(guān)察,第2行圖為暗場(chǎng)觀(guān)察綠色熒光.

    圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力Fig.4 Detection for the abilities of migration of MCF-7 cells by wound scratch assay

    圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)E-cadherin表達(dá)水平Fig.5 E-cadherin expression level detected by f l ow cytometry

    圖6 Numb-KO MCF-7轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡觀(guān)察Fig.6 Fluorescent microscope observation of Numb-KO MCF-7 cells

    2.5 Numb基因的4個(gè)亞型對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響

    采用CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn)(見(jiàn)圖7(a)),發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的第3天時(shí),與陰性對(duì)照組(EGFP)相比,Numb基因的亞型P72轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力明顯減弱.當(dāng)培養(yǎng)第3天時(shí)各組細(xì)胞增殖情況可由圖7(b)直觀(guān)地看出.相對(duì)吸光值p72組比EGFP組降低16%,提示p72可以抑制Numb-KO MCF-7細(xì)胞的增殖.其他3種亞型p65,p66,p71對(duì)Numb-KO MCF-7細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制作用(見(jiàn)圖7).通過(guò)PI檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),對(duì)Numb-KO MCF-7細(xì)胞增殖抑制最明顯的仍為p72,p72轉(zhuǎn)染后可將G0G1期細(xì)胞比例提高17.75%,S期細(xì)胞比例降低18.2%,對(duì)G2M期細(xì)胞比例沒(méi)有影響,說(shuō)明p72可以抑制細(xì)胞由G0G1往S期的轉(zhuǎn)變,從而抑制細(xì)胞增殖(見(jiàn)表2).

    圖7 CCK-8檢測(cè)個(gè)亞型轉(zhuǎn)染后Numb-KO MCF-7細(xì)胞增殖能力Fig.7 Numb-KO MCF-7 cell proliferation assessed by CCK-8 after transfection with Numb isoforms

    表2 PI染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各亞型轉(zhuǎn)染后Numb-KO MCF-7的細(xì)胞周期Table 2 Detection for cell cycle of Numb-KO MCF-7 cells after p65,p66,p71 and p72 expression vector transfecting by staining with PI and f l ow cytometry %

    2.6 Numb基因的4個(gè)亞型對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲能力的影響

    細(xì)胞劃痕后于含2%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,結(jié)果顯示各亞型轉(zhuǎn)染組遷移率與陰性對(duì)照EGFP組相比,遷移比率降低程度分別為p65組8.29%,p66組7.95%,p71組8.95%和p72組8.49%,這說(shuō)明4種亞型均對(duì)Numb-KO MCF-7細(xì)胞遷移能力有抑制作用,但是抑制能力沒(méi)有差異(見(jiàn)圖8).用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各亞型轉(zhuǎn)染后Numb-KO MCF-7細(xì)胞表面E-cadherin的表達(dá)情況后發(fā)現(xiàn),4種亞型轉(zhuǎn)染組與EGFP(陰性對(duì)照)組相比,E-cadherin表達(dá)量(MFI)均有所提高,提高程度分別為p65組23.65%,p66組39.78%,p71組24.73%和p72組44.80%,說(shuō)明4種亞型均對(duì)Numb-KO MCF7細(xì)胞的遷移能力起到抑制作用(見(jiàn)表3).

    圖8 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Numb各亞型對(duì)Numb-KO MCF-7細(xì)胞遷移能力的影響Fig.8 Dection for the abilities of migration of Numb-KO MCF-7 cells by wound scratch assay

    表3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各亞型轉(zhuǎn)染后Numb-KO MCF-7細(xì)胞表面E-cadherin表達(dá)水平Table 3 E-cadherin expression levels of Numb-KO MCF-7 cells after p65,p66,p71,p72 expression vector transfecting by f l ow cytometry

    3 討論

    為探討Numb不同亞型在乳腺癌發(fā)生中的作用,本工作利用TALEN技術(shù)構(gòu)建了Numb敲除的MCF-7穩(wěn)定細(xì)胞系Numb-KO MCF-7.首先,在Numb基因敲除后,MCF-7細(xì)胞增殖和遷移能力明顯增強(qiáng),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Numb基因敲除后的MCF-7細(xì)胞S期和G2M期的比例增大,說(shuō)明Numb可以阻滯MCF-7細(xì)胞由G0G1期往S期和G2M的轉(zhuǎn)變,從而抑制MCF-7細(xì)胞的分裂.E-cadherin是一類(lèi)介導(dǎo)同源細(xì)胞間粘附的鈣離子依賴(lài)性跨膜糖蛋白,主要存在于人和動(dòng)物上皮細(xì)胞中,對(duì)于維持上皮細(xì)胞形態(tài)和組織完整性發(fā)揮重要作用,同時(shí)抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移,影響原發(fā)腫瘤的早期生長(zhǎng)和繼發(fā)腫瘤的增殖生長(zhǎng).Numb敲除后的MCF-7細(xì)胞表面E-cadherin表達(dá)量降低,可能是腫瘤遷移能力增強(qiáng)的一個(gè)標(biāo)志[13].Numb基因?qū)CF-7細(xì)胞的增殖和遷移的抑制,原因可能是由于Notch、Hedgehog等信號(hào)通路失去Numb蛋白的抑制從而被增強(qiáng),p53穩(wěn)定性和細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)態(tài)平衡也可能受到影響,這與以往Numb基因在其他腫瘤細(xì)胞中的研究結(jié)果相吻合[14].

    Numb基因的4種亞型的產(chǎn)生,是由于哺乳動(dòng)物Numb基因存在轉(zhuǎn)錄后的選擇性剪切,在磷酸酪氨酸結(jié)合(phosphotyrosine-binding,PTB)和富含脯氨酸域(proline-rich region,PRR)結(jié)構(gòu)域分別插入11個(gè)氨基酸(ERKFFKGFFGK)或48個(gè)氨基酸(ANGTDSAFHVLAKPAHTALAPVA MPVRETNPWAHAPDAANKEIAATCS),由此產(chǎn)生PTBSPRRS(p65),PTBLPRRS(p66),PTBSPRRL(p71)和PTBLPRRL(p72)[9-10,15]4種蛋白亞型.本工作通過(guò)4種Numb表達(dá)質(zhì)粒載體p65,p66,p71和p72分別轉(zhuǎn)染Numb-KO MCF-7細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)PTBLPRRL(p72)能夠?qū)umb-KO MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G0G1期,從而對(duì)細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用,4種Numb基因亞型均對(duì)Numb-KO MCF-7細(xì)胞遷移能力有抑制作用,而且這4種亞型轉(zhuǎn)染后,均能提高Numb-KO MCF-7細(xì)胞表面E-cadherin的表達(dá)量.

    過(guò)去曾有學(xué)者在不同的系統(tǒng)中對(duì)Numb各亞型進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)在原代培養(yǎng)的小鼠神經(jīng)前體細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)PRRL將促進(jìn)增殖,同時(shí)將不影響或抑制分化,而過(guò)表達(dá)PRRS則促進(jìn)分化,同時(shí)抑制或不影響增殖[16];在P19細(xì)胞系中,PRRS能促進(jìn)分化,而PRRL則不能;在視黃酸的誘導(dǎo)下,PRRL將促進(jìn)P19細(xì)胞的增殖,而PRRS則不能[9];在果蠅外視原基中,h-PTBSPRRL(h表示來(lái)自人)能促進(jìn)神經(jīng)上皮細(xì)胞增殖,同時(shí)不影響分化,h-PTBSPRRS則能促進(jìn)神經(jīng)上皮分化而抑制其增殖[17].本研究結(jié)果與之前的一些報(bào)道有些不同,究其原因可能是研究系統(tǒng)有差異,因?yàn)樵诓煌慕M織細(xì)胞中,不同的Numb蛋白亞型具有不同功能,這是Numb的一個(gè)主要特點(diǎn).Numb蛋白發(fā)揮作用主要是通過(guò)PTB和PRR 2個(gè)結(jié)構(gòu)域,這2個(gè)結(jié)構(gòu)域使得Numb能夠介導(dǎo)其他蛋白的連接,從而發(fā)揮多種生理功能[18-20].Numb蛋白亞型p72與其他亞型相比,最主要的特點(diǎn)是在PTB和PRR 2個(gè)結(jié)構(gòu)域中都有插入序列.Numb蛋白亞型p72對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的抑制,可能是發(fā)揮維持Notch,Hedgehog和TP53等信號(hào)通路平衡的作用,而這一作用可能需要PTB和PRR結(jié)構(gòu)域中的2個(gè)插入序列.而p65,p66,p71和p72這4種亞型均對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移起到抑制作用,與Numb參與的細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移的功能有關(guān)[21],這一功能的發(fā)揮可能不需要PTB和PRR結(jié)構(gòu)域中的2個(gè)插入序列.

    Numb基因的不同蛋白亞型之間,不論是在發(fā)育時(shí)空的表達(dá)上,還是在功能方面,都有明顯的差異,這使得Numb蛋白的亞型研究非常復(fù)雜.在過(guò)去10多年里得到了一些有價(jià)值的結(jié)果,但由于各種研究采用的系統(tǒng)不同,無(wú)法得出一個(gè)統(tǒng)一的結(jié)論[22].這是由Numb蛋白本身的特點(diǎn)決定的:Numb作為一個(gè)銜接蛋白,能夠介導(dǎo)不同蛋白之間的連接,這使得Numb細(xì)胞選擇命運(yùn)的一個(gè)工具在不同的發(fā)育時(shí)空背景下被反復(fù)使用.因此,對(duì)Numb蛋白不同亞型的研究,要精確到特定的發(fā)育階段和細(xì)胞類(lèi)型.本工作對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中的Numb亞型作用進(jìn)行了初步研究,但Numb亞型在腫瘤中的表達(dá)情況及生物學(xué)功能、各個(gè)亞型與Notch,Hedgehog等信號(hào)通路是如何作用的,都還值得在今后作進(jìn)一步研究.

    [1]PECE S,CONFALONIERI S,RR P,et al.Numb-ing down cancer by more than just a Notch[J].Biochimica et Biophysica Acta,2011,1815(1):26-43.

    [2]WANG Z,LI S S C.Numb:a new player in EMT[J].Cell Adhesion and Migration,2010,4(2):176-179.

    [3]DING X,MA M,TENG J,et al.Numb induces E-cadherin adhesion dissolution,cytoskeleton reorganization,and migration in tubular epithelial cells contributing to renal f i brosis[J].Current Molecular Medicine,2015,15(4):368-379.

    [4]TOSONI D,ZECCHINI S,COAZZOLI M,et al.The Numb/p53 circuitry couples replicative selfrenewal and tumor suppression in mammary epithelial cells[J].Journal of Cell Biology,2015,211(4):845-862.

    [5]PECE S,SERRESI M,SANTOLINI E,et al.Loss of negative regulation by Numb over Notch is relevant to human breast carcinogenesis[J].Journal of Cell Biology,2004,167(2):215-221.

    [6]DI M L,FERRETTI E,GRECO A,et al.Numb is a suppressor of Hedgehog signalling and targets Gli1 for itch-dependent ubiquitination[J].Nature Cell Biology,2006,8(12):1415-1423.

    [7]SHAO X,LIU Y,YU Q,et al.Numb regulates vesicular docking for homotypic fusion of early endosomes via membrane recruitment of Mon1b[J].Cell Research,2016,26(5):593-612.

    [8]SUN M,ASGHAR S Z,ZHANG H.The polarity protein Par3 regulates APP traきcking and processing through the endocytic adaptor protein Numb[J].Neurobiology of disease,2016,93(9):1-11.

    [9]DHO S E,FRENCH M B,WOODS S A,et al.Characterization of four mammalian Numb protein isoforms.Identif i cation of cytoplasmic and membrane-associated variants of the phosphotyrosine binding domain[J].Journal of Biological Chemistry,1999,274(46):33097-33104.

    [10]錢(qián)文雨,李華順.Numb與神經(jīng)發(fā)育[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào),2010(1):1-16.

    [11]BANI-YAGHOUB M,KUBU C J,COWLING R,et al.A switch in Numb isoforms is a critical step in cortical development[J].Developmental Dynamics,2007,236(3):696-705.

    [12]VERDI J M,BASHIRULLAH A,GOLDHAWK D E,et al.Distinct human Numb isoforms regulate diあerentiation vs.proliferation in the neuronal lineage[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of USA,1999,96(18):10472-10476.

    [13]SLEEMAN J P,THIERY J P.SNAPSHOT:the epithelial-mesenchymal transition[J].Cell,2011,145(1):162-162.

    [14]GULINO A,DI M L,SCREPANTI I.The multiple functions of Numb[J].Experimental Cell Research,2009,316(6):900-906.

    [15]KARACZYN A,BANIYAGHOUB M,TREMBLAY R,et al.Two novel human Numb isoforms provide a potential link between development and cancer[J].Neural Development,2010,5(12):1040-1048.

    [16]VERDI J M,BASHIRULLAH A,GOLDHAWK D E.Distinct human Numb isoforms regulate diあerentiation vs.proliferation in the neuronal lineage[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1999,96(18):10472-10476.

    [17]TORIYA M,TOKUNAGA A,SAWAMOTO K,et al.Distinct functions of human Numb isoforms revealed by misexpression in the neural stem cell lineage in the Drosophila larval brain[J].Developmental Neuroscience,2005,28(1/2):142-155.

    [18]GUO M,JAN L Y,JAN Y N.Control of daughter cell fates during asymmetric division:interaction of Numb and Notch[J].Neuron,1996,17(1):27-41.

    [19]DHO S E,JACOB S,WOLTING C D,et al.The mammalian Numb phosphotyrosine-binding domain.Characterization of binding specif i city and identif i cation of a novel PDZ domain-containing Numb binding protein,LNX[J].Journal of Biological Chemistry,1998,273(15):9179-9187.

    [20]WILLIAMSON M P.The structure and function of proline-rich regions in proteins[J].Biochemical Journal,1994,297(2):249-260.

    [21]BERDNIK D,TOROK T G M,KNOBLICH J A.The endocytic protein alpha-adaptin is required for Numb-mediated asymmetric cell division in Drosophila[J].Developmental Cell,2002,3(2):221-231.

    [22]RASIN M R,GAZULA V R,BREUNIG J J,et al.Numb and Numbl are required for maintenance of cadherin-based adhesion and polarity of neural progenitors[J].Nature Neuroscience,2007,10(7):819-827.

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