產(chǎn)脂肪酶菌株篩選及其抗氧化性的研究

王 吉， 張 鑫， 胡靜榮， 于智慧， 朱迎春

(山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，晉中 030800)

發(fā)酵肉制品是指將禽畜肉或水產(chǎn)品等原料按照一定的肥瘦比例進行絞碎，與鹽、糖、亞硝酸鈉、發(fā)酵劑和香辛料等混合均勻后，在特定條件下利用微生物發(fā)酵制成的一種具有特殊發(fā)酵風味、營養(yǎng)豐富、易于保存的肉制品[1]。

脂質(zhì)是發(fā)酵肉制品的重要成分之一，肉制品在發(fā)酵成熟過程中，脂質(zhì)降解產(chǎn)生游離脂肪酸，尤其是多不飽和脂肪酸，極大提高了發(fā)酵香腸的營養(yǎng)價值[2]。脂肪降解產(chǎn)生的游離脂肪酸經(jīng)過氧化作用生成羰基化合物，從而產(chǎn)生了醇類、酮類、醛類等風味物質(zhì)[3]。有研究表明[4, 5]，脂肪酶通過催化肉制品中脂質(zhì)的分解，提高了游離脂肪酸的含量，從而促進風味前體物質(zhì)的產(chǎn)生。在發(fā)酵過程中，微生物對脂質(zhì)的水解起著重要的作用。李想等[6]發(fā)現(xiàn)腐生葡萄球菌可以促進發(fā)酵肉中脂質(zhì)的水解。劉英麗等[7]報道了乳酸菌在薩米拉發(fā)酵香腸中的作用，指出乳酸菌可以促進香腸中脂質(zhì)的降解。Xiao等[8]報道接種植物乳桿菌和木糖葡萄球菌可以促進游離脂肪酸的釋放。脂質(zhì)適度的氧化，有助于發(fā)酵肉制品風味的形成[9]。然而，脂質(zhì)的過度氧化會導致產(chǎn)品酸敗、質(zhì)地和顏色的改變、微生物的生長、食用品質(zhì)的降低和保質(zhì)期的縮短[10]。有研究人員通過在制作發(fā)酵肉制品中添加一些抗氧化劑來抑制脂質(zhì)的過度氧化[11]。也有研究人員采用具有抗氧化性的菌株作為發(fā)酵劑來抑制脂質(zhì)的過度氧化，如韓飛云等[12]報道，在發(fā)酵羊肉香腸中接種復配發(fā)酵劑(木糖葡萄球菌和植物乳桿菌)可以顯著降低TBARS值。

本實驗從實驗室保藏的12株發(fā)酵菌株中篩選具有產(chǎn)脂肪酶的菌株，對菌株表達脂肪酶的基因進行定性和定量分析，研究培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度、時間、接菌量對油脂降解率的影響，并對菌株進行抗氧化分析，旨在篩選出同時具備脂解能力和抗氧化活性的菌株，為提高發(fā)酵香腸的營養(yǎng)價值和改善發(fā)酵香腸的風味提供技術支持，為開發(fā)具有我國自主知識產(chǎn)權的新型發(fā)酵劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院畜產(chǎn)品實驗室保藏的12株菌株，前期經(jīng)過分離、純化和16S rDNA鑒定，種屬關系明確，分別為：2株戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)MGC2、MSZ1， 3株巨球菌(Macrococcuscaseolyticus)YZC2、YZC3、YXN2，2株木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)YSZ11、YCC3，1株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)MSZ2，1株表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)MYJC2，2株腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)YCC2、YRC1，1株屎腸球菌(Enterococcusfaecium)MRC2。

無水乙醇、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、沒食子酸、水楊酸均為分析純；RNA試劑盒、TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒。

1.1.2 培養(yǎng)基

中性紅油脂培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 5 g，蛋白胨10 g，大豆油10 g，牛肉膏5 g，1.6%中性紅1 mL；MRS培養(yǎng)基、三丁酸甘油酯培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉。

1.1.3 設備與儀器

5804R高速冷凍離心機，HPP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱，ST2100 pH計，UV-1100分光光度計，SW-CJ-2FD雙人單面超凈化工作臺，LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌器，LC96實時定量 PCR 儀，NanoDrop2000核酸蛋白分析儀。

1.2 方法

1.2.1 菌株產(chǎn)脂肪酶能力篩選

參照Griebeler等[13]的方法，利用中性紅油脂平板法和三丁酸甘油酯平板法篩選具有產(chǎn)脂肪酶能力的菌株。

1.2.2 菌株脂肪酶基因相關基因表達量的檢測

用細菌RNA提取試劑盒提取菌株RNA，并用核酸蛋白分析儀對RNA濃度和純度進行檢測。將所提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩＝?jīng)過NCBI查詢，葡萄球菌和巨球菌編碼脂肪酶的相關基因為FJ979867.1、FJ979868.1、AY551101.1。進行設計并合成相應的引物，實時定量PCR引物見表1。3個基因為實驗基因，18S為內(nèi)參基因，cDNA作為模板進行定量PCR擴增，反應體系為： 25 μL TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ，2 μL上游引物，2 μL下游引物，2 μL cDNA，R Nase Free dH2O 19 μL[14]；PCR反應條件見表2。采用2-ΔΔCt計算基因的相對表達量。

表1 實時定量PCR引物

表2 PCR反應條件

1.2.3 初始pH對菌株產(chǎn)脂肪酶的影響

篩選出的菌株在營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)48 h，將菌株稀釋到8 log10CFU/mL后接種到pH分別為5、6、7的三丁酸甘油酯平板中，在37 ℃下培養(yǎng)48 h。測量透明圈的大小來判定pH對菌株產(chǎn)脂肪酶能力的影響。

1.2.4 菌株培養(yǎng)溫度對油脂降解率的影響

篩選出的菌株在營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)48 h，稀釋到8 log10CFU/mL后按體積分數(shù)為0.2%分別接種到含有質(zhì)量分數(shù)為2%油脂的營養(yǎng)肉湯中，在不同溫度(27、32、37、42 ℃)下培養(yǎng)48 h，然后用25 mL石油醚對油脂萃取3次，收集有機相并且用無水硫酸鈉吸取殘留的水分，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除有機溶劑，然后置于(60±2)℃的烘箱中烘干，稱量剩余油脂的質(zhì)量。計算公式為：

1.2.5 菌株培養(yǎng)時間對油脂降解率的影響

篩選出的菌株在營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)48 h，將其稀釋到8 log10CFU/mL后按體積分數(shù)為0.2%分別接種到含有質(zhì)量分數(shù)為2%油脂的營養(yǎng)肉湯中，在37 ℃下培養(yǎng)，分別在24、36、48、60 h測定油脂的降解率。

1.2.6 接菌量對油脂降解率的影響

篩選出的菌株在營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)48 h，稀釋到8 log10CFU/mL后分別按照按體積分數(shù)為0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的接種量接種到含有質(zhì)量分數(shù)為2%油脂的液體培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)48 h測定油脂的降解率。

1.2.7 菌株發(fā)酵液抗氧化性分析

參照李權威等[15]的方法進行測定。在營養(yǎng)肉湯中接種體積分數(shù)為2%篩選出的菌株，37 ℃培養(yǎng)48 h后離心(10 000 g，15 min)得到上清液，進行抗氧化指標測定。DPPH自由基清除率參照馮美琴等[16]的方法測定。羥自由基清除率參照王靜等[17]的方法測定。超氧陰離子自由基清除率參照Fonagy等[18]的方法測定。總還原力測定參照馮艷鈺等[19]的方法測定。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗均做3個平行，結(jié)果以平均數(shù)值±標準差表示。通過Statistix 8.1 進行顯著性差異分析(顯著水平為P<0.05)；通過Origin 9.0軟件繪制圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的初篩結(jié)果

通過油脂中性紅平板顏色的變化可定性分析菌株是否具有產(chǎn)脂肪酶的能力[20]。如果平板顏色未發(fā)生變化，說明菌株產(chǎn)酶能力弱或者不具備產(chǎn)酶能力；如果平板顏色發(fā)生變化，說明該菌可以分泌脂肪酶，油脂在脂肪酶的作用下分解成脂肪酸，使平板顏色變?yōu)榧t色。產(chǎn)脂肪酶定性實驗結(jié)果見表3。菌株YZC2、YSZ11、YCC3、YZC3、YCC2可以使中性紅平板變?yōu)榧t色，說明這5株菌株具有分泌脂肪酶的能力；菌株MGC2、MRC2、YXN2、MSZ1、MSZ2、YRC1、YMJC2未使中性紅平板變色，說明這7株菌分泌脂肪酶的能力弱或不具備分泌能力。

表3 產(chǎn)脂肪酶定性實驗結(jié)果

2.2 產(chǎn)脂肪酶菌株的復篩結(jié)果

菌株產(chǎn)脂肪酶能力實驗見表4，5株菌株均能夠分解三丁酸甘油酯產(chǎn)生透明圈，5株菌株的透明圈直徑與菌落直徑比值(D/d)為1.78～2.29，其中菌株YCC3、YZC2、YCC2D/d值>2，說明脂肪酶活力較強，特別是菌株YCC3的D/d值最高，達到2.29。故選取YCC3、YZC2、YSZ11、YZC3、YCC2這5株菌株進行后續(xù)實驗。

表4 菌株產(chǎn)脂肪酶能力實驗

2.3 菌株編碼脂肪酶基因表達量分析

從NCBI上查閱到葡萄球菌和巨球菌編碼脂肪酶的基因并對菌株DNA進行了擴增，只對FJ979867.1、 AY551101.1、FJ979868.1這3種基因擴增成功。由表5可見，含有編碼脂肪酶基因FJ979867.1的菌株有YCC2、YCC3；含有編碼脂肪酶基因 AY551101.1的菌株有YSZ11、YCC2、YCC3、YZC3；含有編碼脂肪酶基因FJ979868.1的菌株有YSZ11、YCC2、YCC3、YZC2、YZC3。

表5 5株菌株編碼脂肪酶相關基因的定性結(jié)果

菌株脂肪酶基因的相對表達量如圖1所示，F(xiàn)J979867.1的相對表達量在菌株YCC2中最高，顯著高于菌株YCC3(P<0.05)，但是在其他3株菌株中均無表達。FJ979868.1在菌株YCC2、YCC3、YSZ11、YZC3中相對表達量在0.309～0.570之間，在菌株YZC2中無表達。AX551101.1在5株菌株中均有所表達，且YCC2和YSZ11的表達量顯著高于其他3株菌株(P<0.05)。5株菌株比較，菌株YCC2的3種脂肪酶基因均有所表達，尤其是FJ979867.1和AX551101.1的相對表達量顯著高于其他菌株(P<0.05)。

注：不同大寫字母表示不同菌株對FJ979867.1 的表達量差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母不同菌株對FJ979868.1的表達量差異顯著(P<0.05)；*、**分別表示不同菌株對AX551101.1 的表達量差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)；NS表示沒有檢出該基因。圖1 菌株脂肪酶基因的相對表達量

2.4 pH對菌株產(chǎn)脂肪酶能力的影響

不同pH對菌株產(chǎn)脂肪酶能力的影響如圖2所示，5株菌株脂肪酶活力隨著pH的下降而降低。pH為7時，菌株YZC3、YCC3、YCC2、YSZ11、YZC2D/d值分別1.88、2.18、2.18、1.51、1.55，說明5株菌株在pH為7時具有較高的脂肪酶活性；pH為6時，5株菌株D/d值降低為1.34(YZC3)、1.53(YCC3)、1.81(YCC2)、1.35(YSZ11)、1.36(YZC2)，顯著低于(P<0.05)pH為7時的D/d，說明在此條件下，菌株分泌脂肪酶的能力降低且酶活性降低；當pH為5時，僅有菌株YCC2出現(xiàn)透明圈，D/d值為1.57，而菌株YZC3、YZC2、YCC3、YSZ11均未出現(xiàn)透明圈，說明YCC2耐酸性較強，在pH為5時仍舊能夠分泌脂肪酶且表現(xiàn)出較高的活力；而其余4株菌株在pH為6～7時，生長代謝較為活躍，產(chǎn)酶量較高，并且所產(chǎn)脂肪酶有較高活性，但是當pH降低為5時，菌株生長代謝能力減弱，產(chǎn)酶量降低或消失。

注：不同大寫字母表示相同pH不同菌株之間D/d差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示菌株在不同pH D/d差異顯著(P<0.05)。圖2 不同pH對菌株產(chǎn)脂肪酶能力的影響

2.5 培養(yǎng)溫度對油脂降解率的影響

培養(yǎng)溫度對油脂降解率的影響如圖3所示。5株菌株隨著培養(yǎng)溫度的升高油脂降解率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。溫度對菌株YCC2、YCC3的油脂降解率影響顯著(P<0.05)，并且在37 ℃時油脂降解率達到最高，分別為57.34%(YCC2)和49.71%(YCC3)。培養(yǎng)溫度為32～37 ℃時，YZC3、YSZ11油脂降解率維持在較高水平，而菌株YZC2在32 ℃下培養(yǎng)油脂降解率最高，達到16.12%。

注：不同大寫字母表示相同培養(yǎng)條件不同菌株之間油脂降解率差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示菌株在不同培養(yǎng)條件油脂降解率差異顯著(P<0.05)，下同。圖3 培養(yǎng)溫度對油脂降解率的影響

2.6 培養(yǎng)時間對油脂降解率的影響

培養(yǎng)時間對油脂降解率的影響如圖4所示，隨著培養(yǎng)時間的延長，油脂的降解率呈現(xiàn)先顯著上升后趨于平緩的趨勢。除菌株YZC2外，其余4株菌株油脂降解率培養(yǎng)48 h與60 h時無顯著性差異(P<0.05)，說明此時酶活力較弱，油脂降解能力低。5株菌株在培養(yǎng)60 h時，油脂降解率排序為：YCC2>YCC3>YZC3>YSZ11>YZC2。

圖4 培養(yǎng)時間對油脂降解率的影響

2.7 接菌量對油脂降解率的影響

如圖5所示，隨著接菌量的增加，油脂降解率不斷提高，當接菌量為0.20%時，5株菌株對油脂的降解率均達到最高，YZC3、YCC3、YCC2、YSZ11、YZC2降解率范圍為14.57%～56.57%。當繼續(xù)加大接種量時，油脂的降解率開始下降。

圖5 接菌量對油脂降解率的影響

2.8 菌株抗氧化性分析

注：不同大寫字母(A～E)表示差異顯著(P<0.05)。圖6 5株菌株的抗氧化能力

5株菌株的抗氧化能力如圖6所示。如圖6a可見，5株菌株對DPPH自由基均具有清除能力，不同菌株對DPPH自由基清除能力存在差異，菌株YCC3對DPPH自由基清除率最高，為74.96%，其次為菌株YSZ11，DPPH自由基清除率達到66.84%，YZC3的清除率最低為25.04%，僅達到菌株YCC3清除率的33.40%。由圖6b可知，5株菌株對羥自由基均具有清除能力，清除率在19.06%～50.17%之間。其中YCC3對羥自由基清除能力最強，為50.17%，顯著高于其他菌株(P<0.05)，YZC2對羥自由基清除能力最弱，為19.06%。由圖6c可知，5株菌株均對超氧陰離子均具有清除能力，且不同菌株之間清除率存在顯著性差異(P<0.05)。YCC3對超氧陰離子自由基清除率最高，為51.79%，顯著高于其他菌株(P<0.05)。圖6d為5株菌株的總還原力測定。可以看出5株菌株均具有還原性，不同菌株總還原力有顯著性差異?？傔€原力大小依次是YCC3>YZC3>YZC2>YSZ11>YCC2。綜合發(fā)現(xiàn)5株菌株均具有抗氧化性，且不同菌株抗氧化能力有所差異?？傮w而言，菌株YCC3的抗氧化能力最強，菌株YSZ11和YCC2的抗氧化能力次之。

3 討論

脂肪酶對于發(fā)酵肉制品的營養(yǎng)價值和風味的形成具有十分重要的作用，在發(fā)酵過程中不僅對游離脂肪酸的釋放起主導作用，而且可以在短時間內(nèi)積累大量的風味前體物質(zhì)，加速發(fā)酵肉制品的成熟。發(fā)酵肉制品中脂肪酶的來源有兩個途徑：肉組織中的內(nèi)源性脂肪酶和在發(fā)酵過程中微生物分泌的脂肪酶。國內(nèi)外許多研究人員研究了不同源菌株對發(fā)酵肉制品脂質(zhì)分解的影響，發(fā)現(xiàn)葡萄球菌、乳酸菌、微球菌均具有較強的脂質(zhì)降解能力。Kenneally等[21]報道木糖葡萄球可以促進發(fā)酵香腸中游離脂肪酸的釋放，提供更加豐富的風味前體物質(zhì)。Lorenzo等[22]采用商業(yè)發(fā)酵劑制作發(fā)酵香腸，發(fā)現(xiàn)添加發(fā)酵劑(清酒乳桿菌和木糖葡萄球菌)香腸中脂肪酸含量顯著高于對照組(P<0.05)。

菌株是否具有脂解能力與其是否含有編碼脂肪酶的基因緊密相關。根據(jù)NCBI官網(wǎng)查詢，葡萄球菌和巨球菌編碼脂肪酶的相關基因為FJ979867.1、FJ979868.1、AY551101.1，本實驗5株菌株中均發(fā)現(xiàn)了這3種基因，這也是菌株具有脂解能力的原因所在。編碼基因不同，則生成的脂肪酶作用機制不同。如華根霉中基因pro27RCL編碼的脂肪酶對C6-C8中鏈脂肪酸具有分解作用，而基因mRCL編碼的脂肪酶則分解短鏈脂肪酸[23]。此外，有的菌株雖含有相同的編碼基因，但表達量也存在差異。張開屏等[20]對6株具有產(chǎn)脂肪酶性能的乳酸菌進行研究，發(fā)現(xiàn)6株菌株中均具有編碼脂肪酶的基因Lip0069、Lip0893，但不同菌株表達量存在顯著差異(P<0.05)，這也是降脂能力存在差異的原因所在。

不僅編碼脂肪酶的基因表達量決定菌株的脂質(zhì)降解能力，培養(yǎng)條件(pH、溫度、時間、接菌量)也對菌株的降脂能力有重要影響。肉制品在發(fā)酵過程中利用微生物分解碳水化合物，產(chǎn)生大量乳酸[24]，導致肉中pH降低，因此，菌株和所產(chǎn)脂肪酶的耐酸性需引起重視。本實驗的5株菌株在pH為7時酶活性均較高，但隨著pH的下降，酶活性也隨之下降，只有菌株YCC2表現(xiàn)出較強的耐酸性。Kamarudin等[25]研究報道，表皮葡萄球菌分泌的脂肪酶在中性條件時表現(xiàn)出較高的酶活，隨著pH的降低，其酶活也顯著降低。劉元利等[26]的研究也表明pH為7時沙雷氏菌脂肪酶活性最高。培養(yǎng)溫度也對發(fā)酵菌株的降脂能力有重要影響。本實驗中的5株菌株均在32～37 ℃時油脂降解處于一個較高水平，李曉楠等[27]報道35 ℃是脂肪酶活力較高的溫度，趙興秀等[28]則研究發(fā)現(xiàn)所分離純化的菌株在30 ℃培養(yǎng)時具有最高的酶活力。培養(yǎng)時間和接菌量也顯著影響脂肪酶活性，本實驗中油脂降解率在48 h與60 h無顯著變化，原因可能是培養(yǎng)48 h時，脂肪酶活性已達到最高水平，再增加培養(yǎng)時間反而會使酶活力降低。鄧永平等[29]研究報道顯示酶活力在在72 h時最高，延長至96 h呈下降趨勢。接菌量過高油脂降解率也呈下降趨勢，其原因可能是過高的接種量，使培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)提前耗盡，并且培養(yǎng)基中的氧氣含量不足，菌株提前進入衰亡期，不利于菌株的產(chǎn)酶[30]；也可能是接種量過高時，菌株產(chǎn)酸速度加快，較低的pH抑制了脂肪酶的活力。

肉制品發(fā)酵過程中伴隨著脂質(zhì)的水解也會發(fā)生脂質(zhì)的氧化反應。適度的脂質(zhì)氧化，有助于發(fā)酵肉制品風味的形成。然而，脂質(zhì)的過度氧化會降低產(chǎn)品品質(zhì)。因此，具有抗氧化性也是篩選發(fā)酵菌株的一個重要指標。菌株的抗氧化能力來自于兩個方面：其一為菌株本身的抗氧化性，其二為菌株的代謝產(chǎn)物具有抗氧化性。目前對乳酸菌的抗氧化性進行了較多研究，Chen等[31]和Ren等[32]的研究表明乳酸菌上清發(fā)酵液具有抗氧化性，推斷乳酸菌的抗氧化性主要由代謝產(chǎn)物產(chǎn)生。Monica等[33]也報道乳酸菌株在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等抗氧化酶，這些抗氧化酶可將過氧化氫物分解為水，從而體現(xiàn)其抗氧化性[34]。此外，有研究表明利用葡萄球菌、微球菌作為發(fā)酵劑生產(chǎn)發(fā)酵肉制品時，脂質(zhì)氧化程度顯著低于不接種的空白組[35，36]。但是對葡萄球菌、微球菌等發(fā)酵菌株抗氧化性機制的研究較少。本實驗通過體外抗氧化性指標測定，發(fā)現(xiàn)菌株的抗氧化性來源于具有較強的DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基清除能力和具有較高的總還原力，從機制上解釋了菌株抗氧化性高的原因。

4 結(jié)論

利用中性紅油脂平板和三丁酸甘油酯平板從12株菌株中篩選出5株具有產(chǎn)脂肪酶的能力，分別為2株木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)YSZ11和YCC3、1株腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)YCC2、和2株巨球菌(Macrococcuscaseolyticus)YZC2、YZC3。對菌株編碼脂肪酶的基因進行了檢測，發(fā)現(xiàn)不同菌株編碼脂肪酶的基因不同，且表達量也存在顯著差異。5株菌株均在培養(yǎng)溫度為32～37 ℃，接種量為0.2%，培養(yǎng)48～60 h時具有較高的脂質(zhì)降解率。通過對發(fā)酵上清液DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的清除率和總還原力的測定表明5株菌株均具有抗氧化性。綜合考察，5株菌株中腐生葡萄球菌YCC2和木糖葡萄球菌YCC3油脂降解能力和抗氧化性較為突出，可作為備選菌株應用于發(fā)酵香腸生產(chǎn)中，以促進發(fā)酵香腸中脂質(zhì)分解并抑制脂質(zhì)的過度氧化。