苯系物對皺紋盤鮑的急性毒性效應

許翠婭，楊 芳，羅冬蓮，陳小紅，魏姍姍，余 穎，陳財珍

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；2.福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361013)

苯系物(BTEX)屬于單環(huán)芳香烴類，是石油類物質(zhì)中常見的烷基苯類化合物，廣泛存在于化工行業(yè)或石油相關行業(yè)中[1]。苯系物易揮發(fā)，具有一定的溶解性，隨著石油工業(yè)的迅速發(fā)展，在采油、煉油、石油運輸?shù)冗^程中，苯系物很容易進入大氣和水體中，進而對生態(tài)系統(tǒng)、水生生物和人類健康造成威脅[2]。目前，國內(nèi)外有關苯系物的研究主要集中于大氣、土壤、沉積物和淡水，對海水中苯系物的研究相對較少。對海洋環(huán)境中苯系物的研究集中于苯系物的檢測技術、微生物修復等，關于苯系物的水生生態(tài)毒性報道相對較少[3-6]，《海水水質(zhì)標準》(GB 3097—1997)中也沒有苯系物的標準限值。

海洋貝類對環(huán)境污染物具有很強的富集性，通常被用作海洋污染物的指示生物。皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)具有很高的經(jīng)濟價值，是目前我國最廣泛的貝類養(yǎng)殖品種之一，也是福建海域貝類養(yǎng)殖的主導種之一。目前關于苯系物對海洋貝類的生態(tài)毒理學研究尚不多見[6]，對皺紋盤鮑的毒性效應研究也尚未見相關報道。因此，開展苯系物對皺紋盤鮑的毒性效應研究可以考察貝類對苯系物污染的耐受能力和海洋生態(tài)系統(tǒng)的健康水平，可為評估苯系物對海洋環(huán)境和水產(chǎn)品質(zhì)量安全的風險提供基礎數(shù)據(jù)和科學依據(jù)，并為科學制訂苯系物的水環(huán)境質(zhì)量標準提供理論依據(jù)，在海洋環(huán)境中苯系物泄露的突發(fā)事件處理中，本研究成果也可為管理部門的決策提供技術支撐和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試生物

試驗用皺紋盤鮑均購自福建省東山縣馬鞍嶼水產(chǎn)養(yǎng)殖場，選擇活力好、健康、無外傷的鮑，采用網(wǎng)兜扎緊(20只/袋)、冰塊降溫的方法，約2 h運輸?shù)礁＝ㄊ∷a(chǎn)研究所生態(tài)實驗室。將鮑置于規(guī)格5 L的玻璃燒杯，按試驗密度進行暫養(yǎng)(20只·5 L-1)，以避免二次轉移對鮑造成的機械損傷。暫養(yǎng)7 d，期間每日定時換水和投喂江蘺，全天充氣，暫養(yǎng)期間鮑活力良好、攝食正常，死亡率為0.5%，符合急性毒性試驗標準(<10%)[7]。試驗前24 h停止喂食。試驗前隨機抽取50只鮑進行生物性狀測量，試驗鮑殼長為(3.8±0.5)cm，體重為(6.2±2.0)g。

1.2 試驗藥劑與儀器

試驗藥劑：苯、甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯和無水乙醇，均為分析純，由國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)。母液配制：試驗使用助溶劑無水乙醇配制母液，母液于每次試驗前配得，當日使用，助溶劑不超過0.1 mg·L-1[7]。試驗常規(guī)理化因子(水溫、鹽度、pH和溶解氧)用WTW Multi3430多參數(shù)分析儀進行測定。

1.3 試驗方法與條件

試驗在5 L的玻璃燒杯中進行，試驗溶液體積為5 L，每個燒杯放入20只鮑。試驗周期為96 h，期間不喂食。為滿足試驗鮑對溶解氧的需求，試驗海水在使用前充分曝氣，試驗期間采用不間斷微充氣的方法，保證試驗水體中溶解氧≥4 mg·L-1。為保證毒性試驗過程中溶液濃度保持在初始濃度的80%以上[7]，試驗容器玻璃燒杯采用保鮮膜、Parafilm封口膜和錫箔紙封口。試驗方式為半靜態(tài)，每12 h換1次水并檢查記錄鮑死亡情況，挑出死亡鮑(死亡判定標準：腹足無自主吸附力，通常腹足朝上，無法翻轉，個別靠物理吸附力附著但脫落后無法再吸附，多次觸碰后無反應)。

依據(jù)相關急性毒性試驗方法[7-8]，經(jīng)預實驗，分別確定苯、甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯的正式試驗濃度范圍，按等對數(shù)間距法設置5個質(zhì)量濃度梯度組，每個濃度組設3個平行組，并設空白對照組(不添加任何試劑)和助溶劑對照組(無水乙醇濃度100 μL·L-1)。根據(jù)預試驗結果，苯正式試驗濃度設置為24.91、31.04、38.66、48.16和60.00 mg·L-1；甲苯正式試驗濃度設置為22.92、28.34、35.03、43.30和53.53 mg·L-1；鄰二甲苯和間二甲苯的正式試驗濃度設置為10.00、13.99、19.58、27.39和38.32 mg·L-1；對二甲苯正式試驗濃度設置為3.62、5.00、6.90、9.52和13.13 mg·L-1。

試驗所用的海水取自廈門海域，經(jīng)沉淀砂濾后使用，添加海水晶調(diào)節(jié)鹽度至(30.0±0.1)，在實驗室充分曝氣備用。試驗期間海水水溫為(19±1)℃，pH為 7.22～8.09，溶解氧為4.77～9.72 mg·L-1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗結果采用SPSS 23軟件進行分析，利用Pearson相關分析判斷劑量和死亡率的相關性，然后進行概率回歸分析，求得LC50值及其95%置信區(qū)間和回歸方程。

安全濃度(SC)的計算公式：SC=96 h LC50(96 h半致死濃度)×AF(應用系數(shù))，一般來說，對不穩(wěn)定而又很少產(chǎn)生殘留的化學物質(zhì)，常用0.1作為應用系數(shù)[9]，依據(jù)苯系物的化學特性，AF取值0.1。

2 結果

2.1 中毒癥狀

試驗鮑在5種苯系物溶液中的中毒癥狀相似，試驗中觀察到，隨著藥物濃度的增加和時間的推移，試驗鮑分泌大量的黏液，呈泡沫狀浮于水面(高濃度組尤為明顯)，試驗水體逐漸變渾濁。在較高濃度苯系物的海水中，鮑中毒反應明顯，表現(xiàn)為：試驗鮑明顯不適，初時鮑殼左右扭轉，一段時間后鮑肌肉松弛，附著力減弱，漸漸脫離杯壁，腹足朝上臥于杯底，腹足蠕動掙扎但無法翻身，逐漸死亡；個別試驗鮑掙扎后靜臥于杯底，逐漸死亡。

在低濃度苯系物的海水中鮑中毒反應較不激烈，中毒后死亡的鮑一般表現(xiàn)為：初時試驗鮑緊閉殼吸附于杯壁，一段時間后鮑肌肉松弛，附著力減弱，漸漸脫離杯壁，腹足朝上臥于杯底，腹足蠕動但無法翻身，逐漸死亡；部分試驗鮑無明顯掙扎，靜臥于杯底死亡；個別試驗鮑靜靜吸附于杯壁，人工剝離后觸之無反應，已死亡。

瀕死的鮑活力明顯下降，附著力弱，觸角和腹足肌肉松弛，觸之反應遲鈍，呈麻痹狀。中毒癥狀較輕的鮑一般不喜活動，附著力較弱，容易被剝離杯壁。對照組的鮑一般白天緊附于杯底，吸附力強，夜間活動。

2.2 苯系物對皺紋盤鮑的急性毒性

試驗過程中，空白對照組和助溶劑對照組的試驗鮑均未死亡，符合急性毒性試驗標準方法的要求[7]。急性毒性試驗結果顯示，不同濃度的藥物對皺紋盤鮑造成不同程度的毒害，隨藥物濃度的增加和試驗進程的推進，鮑死亡率呈逐漸上升的趨勢(圖1～圖5)。對苯系物濃度和皺紋盤鮑死亡率進行劑量-效應相關性分析，得到Pearson相關系數(shù)(表1)，試驗結果表明，5種苯系物對皺紋盤鮑毒性作用存在明顯的劑量-效應相關關系。

在苯的急性毒性試驗中，最低濃度組(24.91 mg·L-1)在72 h內(nèi)鮑沒有出現(xiàn)死亡，96 h鮑的死亡率為8.5%；最高濃度組(60.00 mg·L-1)24 h和48 h鮑的死亡率分別為55.0%和100%。苯對皺紋盤鮑的24 h、48 h、72 h和96 h LC50分別為57.11、41.23、38.25和33.37 mg·L-1，苯系物對皺紋盤鮑24 h、48 h、72 h和96 h LC50的95%置信區(qū)間見表1，其中苯對皺紋盤鮑96 h LC50的95%置信區(qū)間為30.40～36.39 mg·L-1。

在甲苯的急性毒性試驗中，最低濃度組(22.92 mg·L-1)在24 h內(nèi)鮑沒有出現(xiàn)死亡，48 h鮑的死亡率為5.0%，96 h鮑的死亡率為32.5%；最高濃度組(53.53 mg·L-1)24 h、48 h和72 h鮑的死亡率分別為75.0%、85.0%和100%。甲苯對皺紋盤鮑的24 h、48 h、72 h和96 h LC50分別為46.14、37.98、30.38和25.24 mg·L-1，其中96 h LC50的95%置信區(qū)間為23.03～27.01 mg·L-1。

在鄰二甲苯的急性毒性試驗中，最低濃度組(10.00 mg·L-1)在96 h內(nèi)鮑沒有出現(xiàn)死亡；13.99 mg·L-1濃度組在48 h內(nèi)鮑沒有出現(xiàn)死亡，72 h和96 h鮑的死亡率分別為35.0%和50.0%；最高濃度組(38.32 mg·L-1)24 h和48 h鮑的死亡率分別為52.5%和100%。鄰二甲苯對皺紋盤鮑的24 h、48 h、72 h和96 h LC50分別為37.51、23.34、17.91和15.61 mg·L-1，其中96 h LC50的95%置信區(qū)間為13.88～17.40 mg·L-1。

在間二甲苯的急性毒性試驗中，最低濃度組(10.00 mg·L-1)在48 h內(nèi)鮑沒有出現(xiàn)死亡，72 h和96 h鮑的死亡率分別為15.0%和20.0%；最高濃度組(38.32 mg·L-1)24 h、48 h和72 h鮑的死亡率分別為62.5%、80.0%和100%。間二甲苯對皺紋盤鮑的24 h、48 h、72 h和96 h LC50分別為35.61、25.96、15.12和12.84 mg·L-1，其中96 h LC50的95%置信區(qū)間為11.55～14.20 mg·L-1。

在對二甲苯的急性毒性試驗中，最低濃度組(3.62 mg·L-1)在48 h內(nèi)鮑沒有出現(xiàn)死亡，72 h和96 h鮑的死亡率分別為1.5%和8.5%；最高濃度組(13.13 mg·L-1)24 h、48 h和72 h鮑的死亡率分別為67.5%、92.5%和100%。對二甲苯對皺紋盤鮑的24 h、48 h、72 h和96 h LC50分別為11.07、7.69、5.43和4.81 mg·L-1，其中96 h LC50的95%置信區(qū)間為4.42～5.25 mg·L-1。

國家環(huán)境保護總局1986年制訂的《環(huán)境監(jiān)測技術規(guī)范 第四冊 生物監(jiān)測(水環(huán)境部分)》中，將化學物質(zhì)對水生生物的毒性劃分為5個等級：LC50<1 mg·L-1為劇毒；LC50=1～100 mg·L-1為高毒；LC50=100～1 000 mg·L-1為中毒；LC50=1000～10 000 mg·L-1為低毒；LC50>10 000 mg·L-1為微毒或無毒。參照此標準，苯、甲苯和3種二甲苯對皺紋盤鮑均為高毒物質(zhì)。經(jīng)驗公式計算結果：苯、甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯對皺紋盤鮑的安全濃度分別為3.34、2.52、1.56、1.28和0.48 mg·L-1。

表1 苯系物對皺紋盤鮑的LC50及毒性試驗回歸方程

續(xù)表1

注：Y為死亡率；X為物質(zhì)濃度對數(shù)。

Notes：Ywas mortality rate；Xwas substance concentration logarithm.

3 討論

苯系物為一類易揮發(fā)的單環(huán)芳香烴類化合物。有機污染物毒性作用可分為麻醉型毒性和反應型毒性[10]。麻醉型毒性有機物對生物的毒性較低，通常表現(xiàn)為不同程度的致麻醉作用。致麻醉作用幾乎是所有有機物最起碼的生物效應，稱為基本毒性。麻醉型毒性又分為非極性麻醉和極性麻醉。非極性麻醉型化合物為疏水性物質(zhì)，不與生物大分子結合，其急性毒性主要表現(xiàn)為對膜的穿透破壞作用。極性麻醉型化合物是分子結構中具有強失電子的氨基、羥基的芳烴化合物，其毒性作用高于基本毒性[11]。從皺紋盤鮑的中毒癥狀來看，試驗鮑出現(xiàn)了反應遲鈍、肌肉松弛、附著力減弱等麻醉狀態(tài)，符合麻醉型毒性的中毒癥狀。

急性毒性試驗結果表明，5種苯系物對皺紋盤鮑毒性大小順序為：對二甲苯>間二甲苯>鄰二甲苯>甲苯>苯。以96 h LC50來比較，對二甲苯的毒性效應相當于7倍苯的毒性效應，約等于5倍甲苯的毒性效應；鄰二甲苯和間二甲苯對皺紋盤鮑的毒性效應差異不顯著，對二甲苯對鮑的毒性效應約等于3倍鄰、間二甲苯的毒性效應。一般認為，非極性麻醉型化合物引起麻醉的能力主要與疏水性大小有關，根據(jù)相似相溶原理，生物體內(nèi)細胞膜及細胞中的類脂物質(zhì)都會吸附麻醉化合物，疏水性越大，則非極性麻醉型化合物就越容易非選擇性地透過細胞膜，所以非極性麻醉型化合物的毒性大小可以根據(jù)辛醇-水分配系數(shù)來確定[12]。我國學者王連生等和戴朝霞等認為，芳香烴類有機物分子結構會影響生物活性以及毒性作用大小，化合物分析結構大小貢獻的順序為：疏水性>親水性>電性效應>空間效應[13-14]。本試驗中的苯系物均屬非極性麻醉型化合物，苯、甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯和對二甲苯20℃辛醇-水分配系數(shù)logKow分別是2.13、2.69、2.77、3.20和3.15 mg·L-1[15]，所以它們的疏水性大小順序為二甲苯>甲苯>苯。根據(jù)以上理論，二甲苯更容易通過皺紋盤鮑的細胞膜并對其產(chǎn)生毒性作用，其次為甲苯和苯。這與本試驗得到的結果相吻合。

姜北、范亞維等、李學峰等、鄭師梅等也開展了苯系物的急性毒性研究[5，16-18]，姜北在苯系物對仿刺參的急性毒性試驗的研究表明，6種苯系物對仿刺參的毒性效應大小順序是：對二甲苯>間二甲苯>鄰二甲苯>乙苯>甲苯>苯，苯系物對仿刺參的96 h半數(shù)致死濃度分別是：苯101.61 mg·L-1、甲苯58.28 mg·L-1、乙苯43.42 mg·L-1、鄰二甲苯34.58 mg·L-1、間二甲苯27.19 mg·L-1、對二甲苯20.25 mg·L-1。此研究結果中苯系物毒性效應大小順序與本試驗的結果一致。范亞維等的研究表明，水體中甲苯、乙苯和二甲苯對斑馬魚96 h LC50分別為77.5、31.0和34.8 mg·L-1；李學峰等的研究結果為，甲苯、乙苯和二甲苯對中華新米蝦的96 h LC50分別為13.8、10.4和11.3 mg·L-1，二者的研究結果均表明3種苯系物的毒性大小順序為乙苯>二甲苯>甲苯，也與本研究結果相似。鄭師梅的研究表明，在預實驗中，苯系物引起銅繡環(huán)棱螺死亡的濃度高達500 mg·L-1，遠遠高于引起螺行為變化的濃度，試驗以螺的行為變化作為毒性效應指標來研究苯系物對銅繡環(huán)棱螺的急性毒性，結果表明：甲苯、乙苯和二甲苯對銅銹環(huán)棱螺不良反應的96 h EC50分別為37.2、13.3和8.9 mg·L-1，毒性大小順序為二甲苯>乙苯>甲苯。銅銹環(huán)棱螺和皺紋盤鮑均隸屬于軟體動物門腹足綱，從試驗結果來看，苯系物對皺紋盤鮑的毒性效應明顯大于對銅銹環(huán)棱螺的毒性效應。從以上研究結果來比較，相對于仿刺參、斑馬魚、中華新米蝦、銅繡環(huán)棱螺，皺紋盤鮑對苯系物的敏感程度相對較高。

目前《生活飲用水衛(wèi)生標準》(GB 5749—2006)、《地表水環(huán)境質(zhì)量標準》(GB 3838—2002)中對集中式生活飲用水地表水源中的苯系物規(guī)定了標準限值，苯、甲苯和二甲苯的標準限值分別為0.01、0.7和0.5 mg·L-1，而《海水水質(zhì)標準》(GB 3097—1997)和《漁業(yè)水質(zhì)標準》(GB 11607—1989)中均無苯系物標準限值。苯、甲苯、二甲苯均具有很強的生物毒性，對人體而言，苯的毒性最大，已確定為致癌物，可導致白血病和淋巴瘤[19]，還具有致畸作用，引起染色體斷裂和阻礙染色體分離[20]；甲苯具有神經(jīng)毒性和致畸作用[21]；二甲苯對人的神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟和腎臟具有損傷作用[22-23]。依據(jù)其對人體的危害程度，相關飲用水衛(wèi)生標準對苯系物的標準限值，尤其是對苯進行了嚴格的規(guī)定。不同的生物對污染物的敏感性存在差異，目前苯系物對水生生物的毒性效應研究開展得較少，對苯系物中毒機制的研究也不夠深入，因此亟需開展相關研究，為科學制訂苯系物水環(huán)境質(zhì)量標準以及排放標準提供理論依據(jù)。

致謝：福建省水產(chǎn)研究所的鄭惠東、王雪玲、馬文學、陳月忠、錢小明、陳思等參與了本試驗，謹致謝忱。

參考文獻：

[1]An Y J.Toxicity of benzene，toluene，ethylbenzene，and xylene(BTEX) mixtures toSorghumbicolorandCucumissativus[J].Bulletin of environmental contamination and toxicology，2004，72(5)：1006-1011.

[2]Elisabet A，Ernest M U，Gloria C，et al.Advanced oxidation of benzene，toluene，ethylbenzene and xylene isomers (BTEX) byTrametesversicolor[J].Journal of Hazardous Materials，2010，181(1-3)：181-186.

[3]Lennart B，Ketil H，Tomas H，et al.Biomarkers in natural fish populations indicate adverse biological effects of offshore oil production [J].Plos one，2011，6(5)：1-10.

[4]高會.苯類化學品對典型海洋浮游生物的毒性研究[D].大連：大連海事大學，2006.

[5]姜北.苯系物(BTEX)對仿刺參(Apostichopusjaponicus)毒理學的初步研究[D].大連：大連理工大學，2013.

[6]王擺，賀凌，高杉，等.6種苯系物對蝦夷扇貝的生殖毒性作用[J]．生態(tài)毒理學報，2014，9(6)：1083-1090.

[7]國家環(huán)境保護局.GB/T 13267—1991 水質(zhì) 物質(zhì)對淡水魚(斑馬魚)急性毒性測定方法[S].北京：中國標準出版社，1991.

[8]國家技術監(jiān)督局.GB/T 16310.1—1996 船舶散裝運輸化學品危害性評價規(guī)范 水生生物急性毒性試驗方法[S].北京：中國標準出版社，1996.

[9]周永欣，章宗涉.水生生物毒性試驗方法[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1989.

[10]Blum D J W，Speece R E.Determining chemical toxicity to aquatic species[J].Environmental Science Technology，1990，24(3)：284-293.

[11]沈洪艷，甄芳芳，宋存義，等.3種硝基苯污染物對錦鯉魚的急性毒性[J]，農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2007，26(增刊)：63-67.

[12]Schultz T W，Sinks G D，Bearden A P.QSARS in aquatic toxicology：a mechanism of action approach comparing toxic potency toPimephalesprodelas，Tetrahymenapyriformis，andVibriofischeri[M].New York：Taylor & Francis，1998.

[13]王連生，劉征濤，周風帆，等.芳烴類有機物結構與活性相關的模式參數(shù)研究[J].環(huán)境科學，1994，15(3)：7-11.

[14]戴朝霞，趙勁松，陳振翔，等.取代芳香烴化合物對4種水生生物的毒性研究[J].中國環(huán)境科學，2005，25(2)：165-168.

[15]WHO(World Health Organization).Guidelines for drinking-water quality：Health criteria and other supporting information[Z].Geneva：WHO，1996.

[16]范亞維，周啟星.水體中甲苯、乙苯和二甲苯對斑馬魚的毒性效應[J].生態(tài)毒理學報，2009，4(1)：136-141.

[17]李學峰，周啟星，羅義.甲苯、乙苯和二甲苯對中華新米蝦的毒性效應[J].中國環(huán)境科學，2013，33(3)：530-537.

[18]鄭師梅.苯系物對我國典型腹足綱動物的毒害效應及其水質(zhì)基準的研究[D].天津：南開大學，2013.

[19]Bird M G，Greim H，Snyder R，et al.International symposium：Recent advances in benzene toxicity[J].Chemico-Biological Interactions，2005，(153-154)：1-5.

[20]Chen C S，Hseu Y C，Liang S H，et al.Assessment of genotoxieity of methyl tert butyl ether，benzene，toluene，ethylbenzene，and xylene to human lymphocytes using comet assay[J].Journal of Hazardous Materials，2008，153(1-2)：351-356.

[21]Hammer K D.Metabolite ratio of toluene-exposed rotogravure printing plant workers reflects individual mutagenic risk by sister chromatid exchanges[J].Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis，2002，519(1-2)：171-177.

[22]ATSDR.Agency for Toxic Substances and Disease Registry.Interaction Profile for：Benzene，Toluene，Ethylbenzene，and Xylenes(BTEX)[M].Atlanta：US Department of Health and Human Services，Public Health Service，Agency for Toxic Substances and Disease Registry，2004.

[23]USEPA.US Environmental Protection Agency.Toxicological Review of Toluene (CAS No.108-88-3)[M].Washington:USEPA，EPA/635/R-05/004，2005.