組織蛋白酶S水平與慢性阻塞性肺疾病嚴(yán)重程度及CT表型的關(guān)系

李耕誼 殷少軍 柳毅 李虹 宋爽 孔志斌 左晟 劉華 朱珍

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)特征性的病理學(xué)改變存在于氣道、肺實質(zhì)和肺血管。在外周氣道內(nèi)，慢性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致氣道壁損傷和修復(fù)的過程反復(fù)發(fā)生。修復(fù)過程導(dǎo)致氣道壁結(jié)構(gòu)重塑，膠原含量增加及瘢痕組織形成，這些病理改變造成氣道狹窄，引起固定性氣道阻塞[1-2]。FEV1占預(yù)計值%的變化和包括急性發(fā)作頻率等各種臨床參數(shù)是目前最常用的評估COPD嚴(yán)重程度和療效的終點指標(biāo)，但這些參數(shù)有局限性，無法在短時間內(nèi)觀察到明顯的動態(tài)變化。近年來研究顯示，組織蛋白酶S作為一種蛋白酶可促進(jìn)COPD肺氣腫發(fā)生和小氣道重塑，參與COPD的發(fā)生發(fā)展[3-4]。本文旨在探討血漿組織蛋白酶S是否與COPD嚴(yán)重程度存在關(guān)聯(lián)，及是否可作為評估COPD表型尤其是影像學(xué)表型的潛在生物標(biāo)志物，對臨床COPD的治療起到重要的指導(dǎo)意義[5-6]。

對象與方法

一、研究對象

選擇2015年6月至2017年5月在我院呼吸內(nèi)科門診隨診的COPD穩(wěn)定期患者361例，其中男268例，年齡(65.1±10.8)歲，女93例，年齡(66.2±11.1)歲。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會制定的“慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)”綜合評估分組標(biāo)準(zhǔn)，將入選患者分為4組：A組：mMRC<2級、FEV1占預(yù)計值%≥50%且近一年急性加重次數(shù)<2次；B組：mMRC≥2級、FEV1占預(yù)計值%≥50%且近一年急性加重次數(shù)<2次；C組：mMRC <2級、FEV1占預(yù)計值%<50%或近一年急性加重次數(shù)≥2次；D組：mMRC≥2級、FEV1占預(yù)計值%<50%或近一年急性加重次數(shù)≥2次。肺功能評估的風(fēng)險與急性加重評估的風(fēng)險結(jié)果不一致時，以最高風(fēng)險為準(zhǔn)。同時納入健康對照組196例，均為同期肺功能正常的健康體檢者，其中男147例，平均年齡(65.8±10.4)歲；女49例，平均年齡(66.9±11.6)歲。本研究經(jīng)上海第六人民醫(yī)院臨床倫理委員會審核批準(zhǔn)，研究對象均簽署知情同意書。

患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①需符慢性阻塞性肺疾病(2013年修訂版)的診斷標(biāo)準(zhǔn)：除外其他疾病，吸入支氣管擴(kuò)張劑后1 s用力呼氣容積/用力肺活量%(forced expiratory volume in onesecond/forced vital capacity, FEV1/FVC)<70%；②近2個月內(nèi)均處于臨床穩(wěn)定期：咳嗽、咳痰和呼吸困難無明顯加重者為穩(wěn)定期；③接受正規(guī)治療；④3個月內(nèi)吸入藥物劑型劑量維持不變；⑤3個月內(nèi)未使用抗生素。排除標(biāo)準(zhǔn)：①口服糖皮質(zhì)激素者；②合并支氣管擴(kuò)張癥、支氣管哮喘、肺間質(zhì)纖維化和肺部惡性腫瘤等除COPD以外的肺部疾病；③合并糖尿病、肥胖等代謝性疾??；④合并心功能不全、高血壓、動脈粥樣硬化等心血管或腦部疾病；⑤合并慢性腎臟疾病。

二、研究方法

采用改良版英國醫(yī)學(xué)研究委員會呼吸問卷(modified British Medical Reseach Council, mMRC) 進(jìn)行呼吸困難評分或采用慢阻肺患者自我評估測試(COPD assessment test, CAT)問卷進(jìn)行評估，記錄過去1年急性加重次數(shù)。測量所有研究對象的血壓、身高、體質(zhì)量，計算體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)。

血糖、血脂和肌酐測定使用酶法，糖化血紅蛋白用高壓液相法。估算的腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate, eGFR)應(yīng)用慢性腎臟病流行病學(xué)合作研究(chronic kidney disease epidemiology collaboration, CKD-EPI)公式計算[7]：女性：Scr≤62 μmol/L，eGFR=144×(Scr/62)-0.329×(0.993)年齡；Scr>62 μmol/L，eGFR=144×(Scr/62)-1.209×(0.993)年齡。男性：Scr≤80 μmol/L，eGFR=141×(Scr/80)-0.411×(0.993)年齡；Scr>80 μmol/L，eGFR=141×(Scr/80)-1.209×(0.993)年齡。GFR變化率通過以下的公式計算：(研究結(jié)束時的eGFR-基線eGFR)/(基線eGFR×隨訪時間)。所有研究對象在入選當(dāng)天整夜禁食，次日清晨靜臥位，采集外周靜脈血10 ml，肝素抗凝，以離心半徑8 cm，3 000 r/min離心5 min，分離血漿，-80 ℃冰箱儲存?zhèn)錂z。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒(美國R&D公司，明尼阿波利斯，明尼蘇達(dá)州，美國)測定血漿總組織蛋白酶S濃度。試劑盒測定組織蛋白酶S的檢測下限為15.6 pg/ml。

肺功能檢測采用瑞士席勒Spirovit SP-1肺功能儀檢查肺功能。記錄主要指標(biāo)包括FEV1/FVC、FEV1占預(yù)計值%、DLCO、 RV/TLC。

所有研究對象接受美國GE公司胸部高分辨率CT(high-resolution computed tomography, HRCT)檢查，分別在吸氣末憋氣和呼氣末憋氣連續(xù)掃描主動脈弓、氣管隆突上1 cm、隆突下1 cm、右肺靜脈下1 cm和右膈膜上2 cm。

肺氣腫程度評估：在GE軟件Thoracic VCAR中，設(shè)置CT值<950 HU為低密度區(qū)，即為肺氣腫，自動辨識并定量低衰減區(qū)域(low attenuation area, LAA)并計算其占全肺體積的百分比(LAA%)，即肺氣腫指數(shù)。根據(jù)Kitaguch方法進(jìn)行LAA分級[8]：首先計算各層面的LAA評分：0分：LAA<5%，1分：5%≤LAA<25%，2分：25%≤LAA<50%，3分：50%≤LAA<75%，4分：LAA>75%。將主動脈弓、氣管隆突下1 cm、右膈膜上2 cm這3個解剖層面6個視野評分相加評估肺氣腫總和：0級：0分，1級：1～6分，2級：7～12分，3級13～18，4級19～24分；

氣道管壁厚度的測定：管開口處三維重建支氣管模型，軟件自動求得2倍氣道壁厚度與氣道直徑比(2 times the ratio of airway wall thickness to outer diameter, 2T/D)、管壁面積占總橫截面積比(ratio of wall area to total airway area, WA)。檢查由2名放射科主治醫(yī)師采用盲法獨立進(jìn)行，并由1名放射科主任醫(yī)師審核，然后取平均值。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、患者臨床資料

各組對象的性別、年齡、吸煙指數(shù)、BMI和血壓等一般狀況無顯著差異(P>0.05)。各組間的生化指標(biāo)包括尿素氮、血肌酐、eGFR、空腹血糖、糖化血紅蛋白等差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

二、組織蛋白酶S水平

COPD患者A、B、C、D四組的組織蛋白酶水平分別為(20.1±10.1)ng/ml、(27.9±9.8)ng/ml、(35.2±11.3)ng/ml、(41.9±11.7)ng/ml，均顯著高于對照組(6.4±3.6)ng/ml(P<0.01)；COPD患者A、B、C、D四組間組織蛋白酶水平均有顯著差異(P<0.01)。

三、肺功能及CT影像學(xué)

各組對象肺功能指標(biāo)包括FEV1/FVC、FEV1占預(yù)計值%、肺一氧化碳彌散量(diffusion of the lungs for carbon monoxide, DLCO)、殘氣容積/肺總量(residual volume/total lung capacity, RV/TLC)均存在顯著差異(P<0.01)，且與對照組相比，A、B、C、D各組患者的FEV1/FVC、FEV1占預(yù)計值%和DLCO的水平均顯著降低，而RV/TLC的水平較對照組顯著升高(P<0.05)；各組研究對象HRCT參數(shù)包括LAA%、2T/D和WA的水平均存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，且與對照組相比，A、B、C、D各組患者的LAA%、2T/D和WA的水平顯著增加(P<0.05)，見表2。

四、不同氣流受限程度及肺氣腫程度患者組織蛋白酶S的水平

GOLD Ⅰ級-GOLD Ⅳ級的組織蛋白酶S水平分別為(21.9±11.5) ng/ml、(25.6±10.3) ng/ml、(33.5±11.1)ng/ml、(39.8±10.6)ng/ml，不同GOLD分級的組織蛋白酶S水平差異顯著(P<0.01)，提示隨著氣流受限程度的增加，組織蛋白酶S的水平顯著升高。LAA 0級-LAA 3級的組織蛋白酶S水平分別為LAA 3級(22.6±10.7)ng/ml、(30.1±9.7)ng/ml、(33.8±11.0)ng/ml、 (42.5±12.4)ng/ml，不同LAA分級的組織蛋白酶S水平差異顯著(P<0.01)，提示肺氣腫越明顯，組織蛋白酶S水平越高。

五、相關(guān)性及回歸分析

COPD患者的組織蛋白酶S水平與FEV1/FVC(r=-0.667)、FEV1占預(yù)計值%(r=-0.591)呈顯著負(fù)相關(guān)，與LAA%(r=0.483)、2T/D(r=0.72)和WA(r=0.549)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。將所有觀測變量引入Logistic回歸模型，采用多元逐步回歸方法篩選嚴(yán)重氣流受限和重度肺氣腫發(fā)生的獨立危險因子。以性別(男=1，女=0)，年齡(大于等于60歲=1，小于60歲=0)，組織蛋白酶S、尿素氮、肌酐、eGFR、空腹血糖、糖化血紅蛋白等指標(biāo)作為自變量(X)，將是否患有嚴(yán)重氣流受限(FEV1占預(yù)計值%<50%)作為因變量Y(患病=1，未患病=0)，另一方面，將是否患有重度肺氣腫改變(LAA %≥15%)作為因變量Y(患病=1，未患病=0)?；貧w分析提示，組織蛋白酶S、年齡為嚴(yán)重氣流受限的獨立危險因子[P=0.0493,比值比(OR)=3.06, 95%可信區(qū)間(95%CI) 1.5～6.8;P=0.0137,OR=4.56, 95%CI1.7～7.9]。同時，組織蛋白酶S(P=0.0147，OR=8.41, 95%CI0.9～26.4)也是重度肺氣腫發(fā)生的獨立危險因子。

表1 各組患者臨床一般資料

表2 各組肺功能及HRCT影像學(xué)參數(shù)比較

討 論

COPD的發(fā)病機制尚未完全明了，近期研究已識別到一些潛在作為新型治療靶點的分子和信號通路[9-10]。蛋白酶是其中一種，已經(jīng)證實肺內(nèi)蛋白酶和抗蛋白酶失衡可導(dǎo)致肺氣腫的發(fā)展。中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶等蛋白酶也可促進(jìn)COPD肺氣腫發(fā)生和小氣道重塑[11-12]。組織蛋白酶S是半胱氨酸蛋白酶家族的一員，人體組織蛋白酶S最早從肺泡巨噬細(xì)胞中提取到，主要分布在淋巴結(jié)、脾臟、肺等器官，廣泛分布于巨噬細(xì)胞和樹狀突細(xì)胞等參與COPD發(fā)病機制的主要細(xì)胞內(nèi)的溶酶體酸性蛋白酶中，其可有效降解彈性蛋白的蛋白酶，也參與適應(yīng)性免疫反應(yīng)，在抗原遞呈中發(fā)揮重要作用。組織蛋白酶S可驅(qū)動MHC Ⅱ介導(dǎo)的T細(xì)胞活化，后者分泌INF-γ可激活巨噬細(xì)胞、趨化炎癥因子集聚致肺損傷部位，提升肺內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而分泌大量蛋白水解酶[13-14]。

COPD患者支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)組織蛋白酶S水平和活性顯著升高，其升高原因可能與COPD患者自身免疫反應(yīng)相關(guān)[15]。有報道認(rèn)為慢性阻塞性肺病是一種自身免疫性疾病，抗彈力蛋白、肺上皮細(xì)胞抗體、內(nèi)皮細(xì)胞抗體在疾病的進(jìn)展中起到作用，尤其是在嚴(yán)重疾病的患者中[16]。過度表達(dá)IL-13和IFN-γ的轉(zhuǎn)基因小鼠，其BALF中組織蛋白酶S增高，更易出現(xiàn)肺部炎癥，同時更容易出現(xiàn)肺部結(jié)構(gòu)破壞而導(dǎo)致肺氣腫[17-18]。在過度表達(dá)IFN-γ的轉(zhuǎn)基因小鼠中，組織蛋白酶S可通過促進(jìn)上皮細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致氣道擴(kuò)張，加速肺氣腫的發(fā)展[19]。Geraghty等[15]的研究已表明IFN-γ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)組織蛋白酶S可能有助于促進(jìn)COPD的發(fā)展。本研究提示，與健康對照組相比，COPD患者血漿組織蛋白酶S水平顯著升高，提示組織蛋白酶S與COPD發(fā)病可能相關(guān)；且根據(jù)COPD綜合評估分組，COPD病情越嚴(yán)重，組織蛋白酶S水平越高，提示組織蛋白酶S與綜合評估分組的病情相關(guān)；本研究對COPD患者血漿組織蛋白酶S水平與患者氣流受限程度(FEV1/FVC、FEV1占預(yù)計值)、低衰減區(qū)域(LAA)、氣道壁厚度(2T/D、WA)等指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果提示組織蛋白酶S水平與氣流受限、肺氣腫、氣道重塑相關(guān)，且可能參與其發(fā)病機制；進(jìn)一步的多元回歸分析提示，組織蛋白酶S不僅為嚴(yán)重氣流受限(FEV1占預(yù)計值%<50%)的獨立危險因子，同時也是重度肺氣腫(LAA%≥15%)發(fā)生的獨立危險因子，進(jìn)一步證實了組織蛋白酶S與COPD發(fā)病和病情進(jìn)展有關(guān)，表明其參與COPD氣流受限、肺氣腫、氣道重塑的形成。Nakajima等[4]對COPD患者血漿組織蛋白酶S進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)COPD患者血漿組織蛋白酶S水平與患者氣流受限程度和肺氣腫程度相關(guān)，與本研究結(jié)果相一致，并且本研究還測定了組織蛋白酶S水平與氣道壁厚度的相關(guān)性，提示組織蛋白酶S在COPD氣道重塑中可能起到一定的作用。

綜上所述，本文結(jié)果顯示血漿組織蛋白酶與COPD綜合評估的病情嚴(yán)重程度和CT評估的肺氣腫及其他協(xié)變量相關(guān)，提示可將組織蛋白酶S作為COPD的表型標(biāo)志物，其對COPD的個體化治療及療效監(jiān)測存在潛在的指導(dǎo)意義。本文尚存在一定的局限性：①血漿組織蛋白酶S，無法確定其活化程度以及其來源；②組織蛋白酶S受血肌酐、血糖、血壓、年齡、激素用藥情況等多種因素影響，研究設(shè)計方案有待改進(jìn)與細(xì)化來規(guī)避這些混淆因素的干擾；③有必要對誘導(dǎo)痰或支氣管肺泡灌洗液中組織蛋白酶S水平進(jìn)行檢測，明確氣道局部組織蛋白酶S的分泌情況；④有必要進(jìn)一步探討血漿組織蛋白酶S與COPD患者氣道炎癥因子或氣道重塑相關(guān)因子的關(guān)系，深入研究組織蛋白酶S在COPD發(fā)生發(fā)展中的作用機制。

參 考 文 獻(xiàn)

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