卡介菌-多糖核酸不同干預(yù)方式對哮喘小鼠氣道反應(yīng)性和氣道炎癥的影響

姜華 賴克方 沈璐 席寅 南巖東 金發(fā)光

支氣管哮喘是一種以氣道高反應(yīng)性、可逆的氣流受阻、氣道嗜酸性粒細(xì)胞等浸潤、氣道黏液高分泌及血清高IgE為特征的氣道慢性炎癥性疾病，Th1/Th2失衡學(xué)說解釋了哮喘的部分發(fā)病機(jī)制[1-3]。此后有研究證實(shí)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞也參與了哮喘的免疫紊亂[4]?？ń槊?bacillus calmette-guerin, BCG)具有很強(qiáng)的Th1細(xì)胞作用，多個(gè)研究證實(shí)在造模前給予BCG干預(yù)可明顯降低哮喘小鼠的氣道反應(yīng)性、氣道炎癥[5-8]?？ń榫嗵呛怂?BCG polysaccharide nucleotide, BCG-PSN)是BCG經(jīng)過滅活后制成的一種免疫制劑，具有多種免疫活性[9-10]。目前臨床BCG-PSN的用藥途徑為肌肉注射，其缺點(diǎn)是用藥周期長，臨床應(yīng)用受限，且需在相關(guān)動(dòng)物研究為造模前給藥。因此本研究主要探討B(tài)CG-PSN不同方式干預(yù)對已造模成功的哮喘小鼠氣道炎癥和氣道反應(yīng)性的影響。

材料和方法

一、材料及試劑

Balb/c小鼠(購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)5～6周齡，體質(zhì)量16～18 g，雌性。飼養(yǎng)在廣州呼吸疾病研究所SPF級(jí)動(dòng)物房。卵白蛋白(OVA，Sigma公司)，佐劑Al(OH)3(Sigma公司)?？ń榫?多糖核酸購自醫(yī)院藥房(國藥準(zhǔn)字92S020100，湖南斯奇生物制藥有限公司生產(chǎn))。小鼠無創(chuàng)肺功能儀(美國Buxco公司)。

二、試驗(yàn)方法

1. 動(dòng)物致敏、激發(fā)： 以O(shè)VA首次致敏為0 d，在0、7、14 d OVA(0.01%OVA，0.2 ml/只)腹腔注射致敏，28、29、30 d(早期)，42、43、44 d(晚期) OVA(0.4%OVA，50 μl/只)滴鼻激發(fā)，一次/d。正常組在每次給藥時(shí)間點(diǎn)給予相應(yīng)劑量的生理鹽水。動(dòng)物造模干預(yù)流程，見圖1。

圖1 研究中動(dòng)物致敏、激發(fā)、BCG-PSN干預(yù)流程；注：ip腹腔注射致敏20 μg OVA(0.01% OVA,0.2 ml/只)；in麻醉滴鼻激發(fā)200 μg OVA(0.4% OVA，50 μl/只)im 肌肉注射

2. BCG干預(yù)： 劑量為20 μg/只，體積為60 μl，均為末次激發(fā)后(30 d)進(jìn)行干預(yù)，根據(jù)干預(yù)方式分為肌肉注射組(im)和麻醉滴鼻組(in)。

3. 麻醉滴鼻給藥方式藥物分布檢測： 取10只正常小鼠，分別用1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔麻醉，將5%伊文思藍(lán)溶液50 μl(用NS配制)經(jīng)鼻滴入，滴完后轉(zhuǎn)動(dòng)小鼠體位數(shù)次以促進(jìn)激發(fā)液在肺內(nèi)均勻分布。處死小鼠，分別留取鼻、氣管、食管、肺臟(包括支氣管)、脾臟(陰性對照)，分別加入1 ml甲酰胺溶液，65 ℃水浴24 h，配制伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液(156、78、39、19. 5、9.7、4.8、2.4、0 μ/ml)，用酶標(biāo)儀在600 nm處檢測標(biāo)準(zhǔn)液及各器官組織的吸光度OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成各器官伊文思藍(lán)濃度。

4. 氣道反應(yīng)性： 分別在實(shí)驗(yàn)流程的32、46 d，小鼠進(jìn)行無創(chuàng)肺功能檢測，通過乙酰甲膽堿(Mch)激發(fā)測定各濃度時(shí)的Penh值，Mch激發(fā)濃度包括3.12、6.25、12.5、25、50 mg/ml。以生理鹽水(normal saline, NS)時(shí)的Penh值為基值，將各個(gè)濃度Penh的百分比(Penh/NS%)，作為氣道反應(yīng)性統(tǒng)計(jì)指標(biāo)[11-12]。本研究評價(jià)氣道反應(yīng)性包括以下二個(gè)方面：①與哮喘組相比可以顯著降低氣道反應(yīng)性(P<0.05)的激發(fā)濃度；②氣道反應(yīng)性升高為基值2倍時(shí)的Mch激發(fā)濃度即PC100，值越小，氣道敏感性越高。

5. 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)分析：在實(shí)驗(yàn)流程第46 d，小鼠行無創(chuàng)肺功能檢測后，以100 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，摘眼球放血，仰臥位，行氣管插管，以0.8 ml PBS灌洗3次，回收率在80%以上。4 ℃以離心半徑8 cm，1 500 r/min，離心10 min，沉淀涂片并行HE染色，連續(xù)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞并計(jì)其中Eos的個(gè)數(shù)，計(jì)算Eos百分比。

6. 肺組織學(xué)病理： 分離肺臟，通過氣管插管灌注10%中性甲醛使肺膨脹進(jìn)行內(nèi)固定，取出肺臟浸入10%中性甲醛中外固定，切取左肺葉，經(jīng)不同梯度濃度乙醇、二甲苯處理后，石蠟包埋，切片，HE染色并鏡檢。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間比較采用spss13.0進(jìn)行單因素方差分析，方差齊用最小顯著差異法(least significant difference, LSD)，當(dāng)方差不齊時(shí)用Tamhane′s T2法或采用秩和檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在造模過程中死亡及感染的動(dòng)物不列入統(tǒng)計(jì)。

結(jié) 果

一、麻醉滴鼻給藥方式的藥物分布

結(jié)果顯示伊文思藍(lán)經(jīng)麻醉狀態(tài)滴鼻后進(jìn)入體內(nèi)，主要沉積于支氣管及肺部，的濃度為(43.11±7.68)μg/ml，與脾臟中藥物濃度(2.57±0.65)μg/ml，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其次是鼻，其濃度為(8.44±2.82)μg/ml，與脾臟相比(P<0.05)，但明顯低于支氣管及肺組織中藥物濃度，主氣管(2.39±0.73)μg/ml與食管(1.96±0.43)μg/ml 中的分布幾乎可以忽略不計(jì)，見圖2。

圖2 5%伊文思藍(lán)麻醉滴鼻給藥后各個(gè)器官分布的濃度(μg/ml)；注：* vs. spleen P<0.05, ** vs. spleen P<0.01

二、氣道反應(yīng)性

1. Penh/NS%： 對于早期激發(fā)，BCG-PSN im組與in組在Mch激發(fā)濃度(3.12～50 mg/ml)與哮喘組相比，Penh/NS%均明顯降低，且在12.5、50 mg/ml時(shí)in組顯著低于im組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而對于晚期激發(fā)：im組完全不能降低氣道反應(yīng)性，而in組則在Mch激發(fā)濃度為12.5、25、50 mg/ml時(shí)，Penh/NS%與哮喘組相比明顯減低，且在激發(fā)濃度為25、50 mg/ml時(shí)明顯低于im組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、2。

2. PC100： BCG-PSN im組早期PC100為(9.48±3.06)mg/ml、與哮喘組(4.79±1.51)mg/ml相比P<0.05，晚期PC100(4.96±1.88)mg/ml，哮喘組為(5.55±3.11)mg/ml，兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，BCG-PSN in組早期、晚期PC100分別為(12.39±4.89)mg/ml、(9.19±2.35)mg/ml，與哮喘組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且晚期激發(fā)PC100 in組明顯高于im組，見圖3。

圖3 BCG-PSN不同干預(yù)方式對哮喘小鼠氣道反應(yīng)性(PC100)的影響；注：im 肌肉注射組，in 麻醉滴鼻組 *vs. asthmaP<0.05; **vs. asthmaP<0.01；& 兩種干預(yù)方式相比P<0.05

表1 BCG-PSN干預(yù)對哮喘小鼠在Mch各濃度早期激發(fā)氣道阻力(Penh/NS)%的影響

注：與哮喘組比較，aP<0.05，bP<0.01；兩種干預(yù)方式比較cP<0.05

表2 BCG-PSN干預(yù)對哮喘小鼠在Mch各濃度晚期激發(fā)氣道阻力(Penh/NS)%的影響

注：與哮喘組比較，aP<0.05，bP<0.01；兩種干預(yù)方式比較cP<0.05

三、氣道炎癥

哮喘組BALF中Eos%為(40.73±6.01)%，明顯高于正常組，BCG-PSN im組Eos% 為(35.65±4.27)%，與哮喘組相比無明顯差異(P>0.05)，BCG-PSN in組(30.98±5.45)%顯著低于哮喘組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見圖4。

圖4 各組對哮喘小鼠BALF中Eos%的影響；注：im 肌肉注射組，in 麻醉滴鼻組 *vs. asthmaP<0.05; **vs. asthmaP<0.01

四、肺組織病理變化

正常組小鼠肺組織光鏡下肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)無滲出液，肺泡上皮細(xì)胞排列有序，極少有嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤。哮喘組肺泡腔內(nèi)可見巨噬細(xì)胞浸潤，氣管壁及血管周圍可見大量的Eos及淋巴細(xì)胞浸潤。BCG-PSN干預(yù)組與哮喘組相比血管周圍及氣管壁Eos、淋巴細(xì)胞浸潤均明顯減少，見圖5。

圖5 肺組織病理圖；注：A：正常組小鼠肺組織學(xué)病理(HE×400)；B：哮喘組小鼠肺組織學(xué)病理(HE×400)；C：im組小鼠肺組織學(xué)病理(HE×400)；D：in組小鼠肺組織學(xué)病理(HE×400)

討 論

大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)BCG可以顯著抑制哮喘小鼠的氣道反應(yīng)性和減輕其氣道炎癥，具體機(jī)制包括BCG-PSN多糖及核酸的作用，BCG是經(jīng)熱酚法去除蛋白后提取的卡介菌多糖核酸，配以滅菌生理鹽水制成的以多糖成分為主的一種非特異免疫調(diào)節(jié)劑[5-8,13]。前期實(shí)驗(yàn)也證實(shí)在致敏前腹腔注射給予卡介菌多糖核酸可對哮喘小鼠產(chǎn)生預(yù)防作用[14]。因此本研究旨在探討B(tài)CG-PSN不同方式干預(yù)對已造模成功的哮喘小鼠氣道炎癥和氣道反應(yīng)性的影響。

本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)過致敏、激發(fā)后具備哮喘動(dòng)物模型的基本條件：氣道呈高反應(yīng)性和氣道炎癥，此時(shí)給予BCG-PSN干預(yù)，肌肉注射和鼻內(nèi)吸入兩種干預(yù)方式均可降低早期激發(fā)的小鼠氣道反應(yīng)性，后者還可顯著降低晚期激發(fā)氣道反應(yīng)性。本研究還證實(shí)對于氣道炎癥，肌肉注射干預(yù)不能有效的減輕氣道炎癥，而鼻內(nèi)干預(yù)則可顯著地抑制氣道炎癥。與之前的研究采取的干預(yù)時(shí)機(jī)即造模前干預(yù)不同，本研究證實(shí)對已造模成功的哮喘小鼠進(jìn)行BCG-PSN干預(yù)，仍然可以顯著降低哮喘小鼠的氣道反應(yīng)性和氣道炎癥[5-8]。Shirota等[15]在氣道內(nèi)予OVA激發(fā)時(shí)同時(shí)給予CpG-ODN(BCG核酸中的成分)，發(fā)現(xiàn)CpG-ODN能顯著抑制OVA介導(dǎo)的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性，也從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了BCG組分鼻內(nèi)干預(yù)對哮喘小鼠的治療作用。有研究通過臨床觀察研究發(fā)現(xiàn)BCG-PSN可通過增加血清中IL-4及IFN-r調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡，從而提高臨床哮喘兒童治療效果[9]。BCG-PSN對哮喘患者具有一定的治療及免疫調(diào)節(jié)作用，褚明慧[16]、李靖[17]通過研究證實(shí)BCG-PSN對咳嗽變異性哮喘患兒、哮喘合并過敏性鼻炎的兒童及成人均有一定的療效，也證實(shí)了BCG-PSN對哮喘具有治療作用。

目前臨床BCG-PSN用藥途徑為肌肉注射，且需多次干預(yù)，療程為2～3個(gè)月，給臨床使用帶來了諸多限制，因此在保留其藥理作用的前提下是否存在更為方便的干預(yù)方式，則一直未有研究報(bào)道。早在2002年有學(xué)者就探討過麻醉后滴鼻這種干預(yù)方式，認(rèn)為BCG經(jīng)麻醉滴鼻干預(yù)可以降低小鼠氣道反應(yīng)性并減輕氣道炎癥，并發(fā)現(xiàn)麻醉后滴鼻干預(yù)效果優(yōu)于腹腔注射[18-19]。Samary等[20]通過與皮下注射相比，發(fā)現(xiàn)鼻內(nèi)給予BCG干預(yù)也可通過增加CD4+CD25+T細(xì)胞關(guān)鍵因子foxp3的表達(dá)及刺激IL-10的分泌從而降低哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性，但干預(yù)時(shí)機(jī)為造模前。以上多個(gè)研究均證實(shí)了鼻內(nèi)吸入干預(yù)是BCG或BCG-DNA的有效的干預(yù)方式。本研究發(fā)現(xiàn)，對于已造模成功的哮喘小鼠模型，肌肉注射對哮喘小鼠的治療作用僅體現(xiàn)在早期氣道反應(yīng)性的抑制，而對晚期氣道反應(yīng)性無抑制作用，而麻醉后滴鼻干預(yù)對早期激發(fā)和晚期激發(fā)的氣道反應(yīng)性均有明顯抑制，說明麻醉滴鼻比肌肉注射效果更加明顯，作用時(shí)間更為持久。此外對于氣道炎癥，肌肉注射組并未降低氣道炎癥，而麻醉滴鼻組明顯減輕了氣道嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤，與羅光燕等[21]的研究相比，多次給予BCG-PSN干預(yù)既可明顯降低氣道反應(yīng)性，又可減輕氣道炎癥，結(jié)果優(yōu)于臨床上BCG-PSN肌肉注射需要多次給藥，且總的治療周期長的缺點(diǎn)。

對于鼻內(nèi)干預(yù)方式，Choi等[22]發(fā)現(xiàn)BCG鼻內(nèi)干預(yù)對哮喘小鼠氣道反應(yīng)性指標(biāo)PC100無明顯影響，但該研究是在小鼠清醒的情況下鼻內(nèi)干預(yù)，筆者也曾嘗試在小鼠清醒狀態(tài)下滴鼻，觀察到小鼠存在吞咽、打噴嚏動(dòng)作，可能使部分藥物進(jìn)入了食管、胃等消化道，并且部分藥物被噴出。曾有研究證實(shí)在清醒狀態(tài)下小鼠進(jìn)行滴鼻，發(fā)現(xiàn)藥物主要分布于鼻部，而下氣道的藥物分布極少，這些可能都是部分研究中鼻內(nèi)干預(yù)效果欠佳的原因[23-24]。而本研究采取麻醉后滴鼻，利用小鼠自然呼吸使藥物進(jìn)入呼吸道，并通過伊文思藍(lán)證實(shí)藥物多數(shù)分布于支氣管與肺中，少數(shù)分布于鼻，保證了藥物充分作用于哮喘小鼠的呼吸道，可能也是鼻內(nèi)干預(yù)優(yōu)于肌肉注射干預(yù)的原因。此外Gauvreau等[25]發(fā)現(xiàn)哮喘患者吸入CpG(未甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸)治療后，患者痰和外周血單個(gè)核細(xì)胞的IFN-γ水平明顯增高，證實(shí)臨床上核酸組分吸入干預(yù)的可行性，為BCG-PSN經(jīng)鼻臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

本研究初步證實(shí)了BCG-PSN不僅對哮喘小鼠具有預(yù)防作用，而且對已造模成功的哮喘小鼠具有治療作用。麻醉滴鼻相當(dāng)于氣道吸入對哮喘小鼠的作用效果，且與肌肉注射給藥相當(dāng)甚至更優(yōu)。但是臨床BCG-PSN通過氣道給藥仍需要更進(jìn)一步的對其劑型、顆粒大小以及具體吸入方式進(jìn)行研究。

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