對蝦白斑綜合征病毒新株型WSSV-CN-Pc的毒力研究

李 凱， 江錄志， 夏文旭， 潘迎捷,2,3， 王永杰,2,3*

(1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室(上海)，上海 201306)

對蝦白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)是一種具囊膜、桿狀、雙鏈環(huán)狀DNA病毒，屬于Nimaviridae科Whispovirus屬[1-2]。WSSV是造成對蝦養(yǎng)殖過程中大量死亡的最主要病源，自20世紀90年代爆發(fā)以來，已經(jīng)傳播到世界上主要的對蝦養(yǎng)殖地區(qū)包括東亞和東南亞、美洲、印度、中東甚至歐洲[3]，嚴重威脅著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展?？蒲腥藛T至今尚未找到防治該病毒的有效方法。WSSV宿主范圍廣泛，除了可以感染一些重要的商業(yè)養(yǎng)殖對蝦，龍蝦、螯蝦和蟹均可以成為其宿主[4]。不同宿主對其敏感性存在差異。一般而言，南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)對WSSV極其敏感[5]，而螯蝦(P.clarkii,Cheraxquadricarinatus)對WSSV的侵染表現(xiàn)出一定的抗性[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)羅氏沼蝦(M.rosenbergii)無論通過肌肉注射還是經(jīng)口注射，WSSV都不能使其感染[8-9]。WSSV存在多種分離株，不同分離株對同一宿主的毒力也有差異。對兩種不同的對蝦(L.vannamei、Farfantepenaeusduorarum)分別注射6種不同WSSV毒株(中國株、印度株、泰國株、美國德克薩斯株、美國南卡羅來納州株、美國國家公園螯蝦分離株)，結果發(fā)現(xiàn)這6種分離株對L.vannamei的毒力存在差異[10]。美國國家公園螯蝦分離株表現(xiàn)出毒力最弱，而德克薩斯株毒力最強。研究結果還表明，與L.vannamei相比F.duorarum(juveniles)對這6種分離株有一定的抗性[10]。2005年，Marks等[11]研究發(fā)現(xiàn)，針對對蝦(Penaeusmonodon)，WSSV-TH (293 kb)型比WSSV-TH-96-II (312 kb)型毒力更強。本研究從克氏原螯蝦(P.clarkii)中分離出一種新的WSSV分離株(WSSV-CN-Pc)，采用肌肉注射和經(jīng)口注射分析其對克氏原螯蝦和羅氏沼蝦的毒力。研究結果有助于認識不同WSSV分離株的毒力差異以及WSSV的環(huán)境傳播機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 克氏原螯蝦(P.clarkii)由江蘇省蘇州市養(yǎng)殖戶提供；沼蝦(M.rosenbergii)由上海市浦東新區(qū)新城鎮(zhèn)當?shù)仞B(yǎng)殖戶提供；WSSV-TW病毒液由臺灣成功大學羅竹芳教授提供；WSSV-CN-Pc病毒液由本實驗室純化獲得；WSSV檢測的標準質(zhì)粒由本實驗室制備[12]。

1.1.2 試劑與儀器 1 mL無菌注射器(29號針頭)(生工生物工程(上海)股份有限公司)；海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(DP324)(天根生化科技(北京)有限公司)；SYBR Green qPCR Mix(羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司)；Tris、鹽酸、MgSO4(生工生物工程(上海)股份有限公司)；ABI 7500 Fast qPCR儀。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物養(yǎng)殖 250只克氏原螯蝦(體長(13±0.1) cm，重量(35±0.5) g)在50 cm×38 cm×25 cm規(guī)格的塑料箱中養(yǎng)殖,箱中加20 L曝過氣的自來水，保持水溫為25 ℃，每天投喂相當于體重5%的飼料,持續(xù)暫養(yǎng)2周。在養(yǎng)殖前隨機抓取20只克氏原螯蝦取其附肢，用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取附肢DNA，利用WSSV特異性引物VP28-140引物[12]進行WSSV的qPCR檢測。250只沼蝦(體長13～15 cm；重量30～45 g)在50 cm×38 cm×25 cm規(guī)格的塑料箱中養(yǎng)殖，箱中加30 L曝過氣的自來水，保持水溫為20 ℃，每天投喂相當于體重5%的飼料，持續(xù)暫養(yǎng)2周。在養(yǎng)殖前隨機抓取20只沼蝦取其附肢，用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取附肢DNA，利用WSSV特異性引物VP28-140引物進行WSSV的qPCR檢測。

1.2.2 攻毒實驗 ①克氏原螯蝦肌肉注射實驗：挑選60只活力高，身體無損傷，體長相似的克氏原螯蝦分為3組，每組20只。一組肌肉注射(無菌注射器29號針頭注射健康克氏原螯蝦的第三腹節(jié))WSSV-CN-Pc病毒液(107copy/μL)，另一組注射WSSV-TW病毒液(107copy/μL)，最后一組作為對照組注射TM病毒緩沖液。每組每只克氏原螯蝦注射200 μL，每天觀察2次，收集死亡的克氏原螯蝦，計算累計死亡率。持續(xù)7 d。重復實驗2次。②克氏原螯蝦經(jīng)口注射實驗：挑選60只活力高，身體無損傷，體長相似的克氏原螯蝦分為3組，每組20只。采用經(jīng)口注射的方法[13]，一組注射WSSV-CN-Pc病毒液(107copy/μL)，另一組注射WSSV-TW病毒液(107copy/μL)，最后一組作為對照組注射TM病毒緩沖液。每組每只克氏原螯蝦注射200 μL，每天觀察2次，收集死亡的克氏原螯蝦，計算累計死亡率。持續(xù)18 d。重復實驗2次。③沼蝦肌肉注射實驗：挑選40只活力高，身體無損傷，體長相似的沼蝦分為2組，每組20只。一組肌肉注射WSSV-CN-Pc病毒液(107copy/μL)，另一組作為對照組注射TM病毒緩沖液。每組每只沼蝦注射200 μL，每天觀察2次，收集死亡的沼蝦，計算累計死亡率。持續(xù)7 d。WSSV-TW肌肉注射實驗與其過程完全相同，只是在注射時使用WSSV-TW病毒液。④沼蝦經(jīng)口注射攻毒實驗：挑選40只活力高，身體無損傷，體長相似的沼蝦分成2組，每組20只。采用經(jīng)口注射的方法，一組注射WSSV-CN-Pc病毒液(107copy/μL)，另一組作為對照組注射TM病毒緩沖液。每組每只沼蝦注射200 μL。每天觀察2次，收集死亡的克氏原螯蝦，計算累計死亡率。持續(xù)18 d。WSSV-TW經(jīng)口注射實驗與其過程完全相同，只是在注射時使用WSSV-TW病毒液。

1.2.3 攻毒實驗死亡數(shù)量統(tǒng)計 每天觀察2次,單獨收集每個攻毒組中死亡的克氏原螯蝦和沼蝦，并統(tǒng)計各組中死亡克氏原螯蝦和沼蝦數(shù)量，利用Excel軟件作圖，計算每個攻毒組的累計死亡率,以證實WSSV-CN-PC毒株的毒力特點。

1.2.4 qPCR檢測 攻毒實驗中死亡的每只克氏原蟄蝦和每只沼蝦分別取其30 mg肌肉，步驟完全按照天根海洋動物組織基因組提取試劑盒的操作步驟提取肌肉總DNA；對于實驗中未死亡的克氏原螯蝦和沼蝦取其30 mg肌肉，按照天根海洋動物組織基因組提取試劑盒的操作步驟進行肌肉總DNA提取。采用羅氏公司的SYBR Green qPCR Mix試劑盒與ABI 公司的7500 Fast Real-time PCR 系統(tǒng)進行實時熒光定量PCR反應進行WSSV定量。將提取的肌肉總DNA經(jīng)梯度稀釋至終濃度為0.1～1.0 ng/μL，再將WSSV標準質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，選擇108～10 copy/μL 濃度梯度的標準質(zhì)粒用于熒光定量PCR反應中繪制標準曲線。熒光定量PCR反應體系為20 L，包含2.0 L模板、0.01 mol/L引物VP28-F和VP28-R[12]各0.6 L、10 μL 2×SYBR Green qPCR Mix、6.8 μL ddH2O。qPCR擴增程序：預變性95 ℃10 min；變性94 ℃15 s，40個循環(huán)； 60 ℃ 60 s。每個樣品3個平行，重復3次。反應結束后，從軟件生成的標準曲線中讀取并換算出對應樣品WSSV基因拷貝數(shù)。

2 結果與分析

2.1 克氏原螯蝦攻毒實驗

根據(jù)克氏原螯蝦攻毒實驗每天死亡數(shù)量的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，利用Excel作圖，得到圖1和圖2,克氏原螯蝦肌肉注射實驗中注射TM緩沖液的陰性對照組在實驗觀察期內(nèi)無死亡。注射WSSV-TW病毒液組在實驗第2天開始死亡，第6天死亡率達到100%。第一次實驗中，注射WSSV-CN-Pc病毒液組實驗第2天開始死亡，第6天死亡率達到100%；第二次實驗中注射WSSV-CN-Pc病毒液組在實驗第3天開始死亡，第6天死亡率達到100%(圖1)。

圖1 WSSV-CN-Pc克氏原螯蝦肌肉注射實驗Fig.1 Intramuscular injection bioassay of the WSSV-CN-Pc using the crayfish

克氏原螯蝦經(jīng)口注射實驗中陰性對照組在實驗觀察期內(nèi)并無死亡。而注射WSSV-TW病毒液組在實驗第9天開始死亡，第16天死亡率達到100%。第一次實驗注射WSSV-CN-Pc病毒液組在實驗第8天開始死亡，第16天死亡率達到100%；第二次實驗注射WSSV-CN-Pc病毒液組在實驗第9天開始死亡，第16天死亡率達到100%(圖2)。

圖2 WSSV-CN-Pc克氏原螯蝦經(jīng)口注射實驗Fig.2 Oral injection bioassay of the WSSV-CN-Pc using the crayfish

2.2 沼蝦攻毒實驗

根據(jù)沼蝦攻毒實驗每天死亡數(shù)量的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，利用Excel作圖，得到圖3。沼蝦肌肉注射實驗中陰性對照組在實驗觀察期內(nèi)并無死亡，而注射WSSV-CN-Pc病毒液組在實驗第4天開始死亡，第9天死亡率達到100%。

沼蝦經(jīng)口感染實驗中陰性對照組在實驗觀察期內(nèi)并無死亡，而注射WSSV-CN-Pc病毒液組在實驗第12天開始死亡，第19天死亡率達到100%(圖3)。

圖3 WSSV-CN-Pc沼蝦肌肉注射和經(jīng)口實驗Fig.3 Intramuscular and oral injection bioassay of the WSSV-CN-Pc using the M. rosenbergii

2.3 qPCR檢測結果

2.3.1 克氏原螯蝦攻毒實驗檢測結果 克氏原螯蝦肌肉注射實驗中，對陰性對照組中20只活的克氏原螯蝦進行WSSV檢測， 20只均未檢測到WSSV。對WSSV-TW組中所有死亡克氏原螯蝦進行WSSV檢測，20只克氏原螯蝦均檢測到WSSV，含量在1.1×107～1.5×108copy/mg。對所有死亡克氏原螯蝦進行WSSV檢測，40只克氏原鰲蝦均檢測到WSSV，且含量在1.2×107～1.7×108copy/mg?？耸显r經(jīng)口注射實驗中對20只活的克氏原螯蝦進行WSSV檢測，20只均未檢測到WSSV。對WSSV-TW組中所有死亡克氏原螯蝦進行WSSV檢測，20只克氏原螯蝦均檢測到WSSV，且含量在2.2×107～4.5×107copy/mg。對所有死亡克氏原螯蝦進行WSSV檢測，40只克氏原螯蝦均檢測到WSSV，且含量在1.3×107～1.1×108copy/mg。

2.3.2 沼蝦攻毒實驗檢測結果 沼蝦肌肉注射實驗中對20只活的沼蝦進行WSSV檢測，20只均未檢測到WSSV。對所有死亡沼蝦進行WSSV檢測，20只沼蝦均檢測到WSSV，且含量在1.8×106～1.2×107copy/mg。沼蝦經(jīng)口注射實驗中對20只活的沼蝦進行WSSV檢測， 20只均未檢測到WSSV。對所有死亡沼蝦進行WSSV檢測，20只沼蝦均檢測到WSSV，且含量在1.4×106～1.1×107copy/mg。對沼蝦進行的WSSV-TW病毒液肌肉注射和經(jīng)口注射陰性對照組和實驗組均未死亡，對所有活蝦進行的WSSV檢測，除18只實驗組沼蝦檢測到少量的WSSV外，其余均未檢測到WSSV。

3 討 論

本研究中羅氏沼蝦無論是經(jīng)口或者肌肉注射WSSV-TW在實驗觀察期內(nèi)均未出現(xiàn)死亡，這與之前的研究結論相符[8-9]。但從克氏原螯蝦中分離到的WSSV新株型WSSV-CN-Pc無論是肌肉或經(jīng)口注射均能造成羅氏沼蝦100%的死亡。這表明羅氏沼蝦對特定的WSSV株型表現(xiàn)出很強的抗性。例如，研究表明羅氏沼蝦存在自身的某些抗性機制可以降低WSSV的VP28蛋白表達，從而對WSSV產(chǎn)生抗性[14]。有趣的是，WSSV-CN-Pc對羅氏沼蝦表現(xiàn)出強的毒力。后續(xù)工作中，通過比較基因組分析WSSV-TW和WSSV-CN-Pc，找到與病毒毒力差異性相關的遺傳信息，進一步探索羅氏沼蝦對WSSV的免疫機理。

值得注意的是，運用qPCR對上海浦東對蝦養(yǎng)殖場采集的50只羅氏沼蝦樣品進行WSSV-CN-Pc定量檢測。結果表明，50個樣品中35個樣品(70%)檢測出WSSV-CN-Pc，15個樣品未給出信號(數(shù)據(jù)未公開)，說明羅氏沼蝦很有可能是WSSV-CN-Pc水平傳播的一個重要媒介。鑒于WSSV-CN-Pc對羅氏沼蝦表現(xiàn)的強毒力特征，在羅氏沼蝦的養(yǎng)殖過程中也應該采取WSSV的預防措施，防止WSSV-CN-Pc的大規(guī)模流行爆發(fā)。

致謝感謝臺灣成功大學羅竹芳教授為本研究提供WSSV-TW病毒。

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