塊菌(松露)宿主可培養(yǎng)內(nèi)生菌群落結構與多樣性研究

葉 雷， 付 雨， 張笑萍， 孫 群， 張小平， 李小林

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學院 土壤肥料研究所，四川 成都 610066；2.四川大學 生命科學學院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川 成都 610065；3.四川農(nóng)業(yè)大學 資源學院，四川 成都 611130)

對于植物內(nèi)生菌的定義一直存在爭議，大致可以認為在植物體內(nèi)能夠引起植物病害的稱為病原菌，而不引起病害或有益于植株生長并引起明顯癥狀的微生物稱為內(nèi)生菌(Endophyte)[1-2]。植物內(nèi)生菌包括細菌、真菌、放線菌，由于它們生活在沒有外在感染癥狀的健康植物組織內(nèi)部，內(nèi)生菌的存在和作用長期以來一直被忽視[3]。事實上，在已經(jīng)研究到的植物中均發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌的存在，它們可存在于植物的根、莖、葉、果實、花等各個部分[4-5]。塊菌又稱松露(Truffle)，具有獨特的香味、口感和營養(yǎng)價值。在歐美等發(fā)達國家，塊菌被稱為“黑色金剛石”，是野生菌的極品，與魚子醬、鵝肝醬同被稱為三大珍品。華山松(PinusarmandiiFranch.)屬于松科(Pinaceae)、松屬(Pinus)的單維管亞束植物，為外生菌根型樹種，可與塊菌形成外生菌根，為四川省塊菌產(chǎn)區(qū)大眾宿主之一[6-9]。開展塊菌宿主華山松內(nèi)生菌群落差異研究，找出塊菌宿主華山松所特有的菌群及其種屬關系，探究塊菌與華山松共生的優(yōu)勢菌群，對加速塊菌的人工栽培及人工野外培育都具有積極影響。本文對四川會東塊菌產(chǎn)區(qū)華山松內(nèi)生菌的分離鑒定及遺傳多樣性進行研究，以明確塊菌宿主華山松可培養(yǎng)微生物的分類地位，將分離的微生物作為良好的種質資源用于人工塊菌菌根苗的開發(fā)和利用，推動塊菌菌根苗的人工培育進程。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣地信息 四川省涼山彝族自治州會東縣是中國西南地區(qū)重要的塊菌產(chǎn)區(qū)之一，2016年產(chǎn)塊菌40余噸。本研究所采集華山松樣品來自會東縣新田鄉(xiāng)、新云鄉(xiāng)、淌塘鎮(zhèn)、雪山鄉(xiāng)，經(jīng)緯度范圍為北緯N 26°22′57.85″～26°36′40.94″，東經(jīng)E 102°32′50.18″～102°54′56.40″，主要的植被類型為華山松和云南松混交林，所選華山松來自中華夏塊菌(Tubersinoaestivum)、印度塊菌(Tuberindicum)、假凹陷塊菌(Tuberpseudoexcavatum)菌塘，所選菌塘均有3年以上的產(chǎn)塊菌史，會東地區(qū)的年平均溫度為16.2 ℃，年降水量為1 099.7 mm，海拔范圍為2 506～2 624 m。

1.1.2 樣品采集及樣品預處理 每個地區(qū)選取3個點，每點采集實驗組(根、莖、葉)和對照組(根、莖、葉)各3個重復，每點按照5點取樣法取樣。對樣品傷口部位立即涂抹75%的酒精消毒并裝入無菌封口袋內(nèi)，放入冰盒低溫保存。采集的華山松根、莖、葉樣品立即帶回實驗室，用流動水洗掉植物表面的泥土和灰塵，軟毛刷輕輕刷洗，超聲波清洗(150 W)15 min，無菌水沖洗3遍，濾紙吸干表面水分。對不能及時處理的材料，進行消毒處理后，-20 ℃冰箱保存。預處理的樣品根、莖、葉部位各5 cm備用。

1.1.3 培養(yǎng)基 滅菌PDA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、Luria Bertani(LB)培養(yǎng)基、高氏一號合成培養(yǎng)基、ISP 4培養(yǎng)基。內(nèi)生放線菌的分離采用HV培養(yǎng)基(P1)和改良高氏一號培養(yǎng)基(P4)。P1：腐殖酸 1 g，Na2HPO40.5 g，KCl 1.7 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，CaCO30.02 g，瓊脂15 g，蒸餾水 1 000 mL;P4：可溶性淀粉 20 g，KNO31 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂20g，蒸餾水 1 000 mL。

1.1.4 材料與試劑 1%NaClO、吐溫-80、10% NaHCO3；分子鑒定采用Biomiga EZgene細菌DNA試劑盒、D3 350-00 E.Z.N.A. TM Bacterial DNA Kit、D3 590-01 E.Z.N.A. TM Fungal DNA Midi Kit；引物合成由成都擎科梓熙生物技術有限公司完成，其中27 F和1492 R兩段引物擴增細菌16S rDNA[10]，采用通用引物ITS 1和ITS 4[11]兩段引物擴增真菌ITS序列；DNA Maker購自天根生物公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品表面消毒及效果檢測 取預處理的樣品根、莖、葉各5 cm左右，用無菌水沖1遍后在超凈工作臺上晾干，75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗3次，1%的NaClO(有效氯)溶液中加入1～2滴吐溫-80，浸泡消毒20 min(不同的組織，根據(jù)情況酌情調整表面消毒時間以達到最佳的消毒效果)，無菌水淋洗樣品5次(取最后淋出的一次水，涂布平板作對照，28 ℃倒置培養(yǎng)，剩余部分作為PCR模板，以培養(yǎng)基上是否長出菌落為標準，用于檢測消毒效果，同時在工作臺四角各放置1個PDA平板檢測環(huán)境)，用10% NaHCO3溶液(滅菌)浸泡30 min，無菌濾紙吸干表面水分，將組織放入無菌研缽，加入10 mL無菌水，充分研磨成勻漿[1，12]。取少量勻漿液用無菌涂布器分別涂布于對應分離培養(yǎng)基平板上，28 ℃避光倒置培養(yǎng)，細菌培養(yǎng)3～5 d、真菌培養(yǎng)3～7 d、放線菌培養(yǎng)30 d后，挑選單克隆菌落進行劃線分離純化。

1.2.2 華山松內(nèi)生細菌、真菌、放線菌的分離和培養(yǎng) ①細菌培養(yǎng)：將上述研磨后的勻漿梯度稀釋，分別涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基，同時分別涂布最后一次洗滌液作為對照。涂布好的培養(yǎng)基于30 ℃培養(yǎng)，待有菌落形成時，依據(jù)菌落形態(tài)的差異，分別挑取不同的內(nèi)生細菌單菌落，純化后于LB斜面4 ℃保藏。主要依據(jù)的形態(tài)特征：菌落大小，菌落形狀，菌落邊緣是否齊整，菌落顏色，菌落透明度，菌落光澤度以及菌落表面是否光滑，是否存在特殊結構[13]。②真菌培養(yǎng)：將上述研磨后的勻漿梯度稀釋后涂布于加有抗生素的PDA培養(yǎng)基平板上，放置于25 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，定期觀察菌落生長情況，適時采用尖端挑取法轉接于PDA平板純化，最后在PDA斜面培養(yǎng)基中4 ℃保存?zhèn)溆?。③放線菌培養(yǎng)：將上述研磨后的勻漿梯度稀釋后涂布于改良高氏一號培養(yǎng)基(P4)，28 ℃黑暗倒置培養(yǎng)30 d。在放線菌菌落長出后，觀察描述其菌落形態(tài)(去重復形態(tài))及數(shù)量，進行計數(shù)統(tǒng)計。用HV培養(yǎng)基對菌落進行純化(單菌落純化3次以上)，并將純化后的內(nèi)生放線菌在HV斜面培養(yǎng)基(P1)4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 分子鑒定 華山松內(nèi)生細菌、內(nèi)生真菌的基因組DNA提取分別采用相應的omega細菌和真菌DNA提取試劑盒完成，內(nèi)生放線菌采用Biomiga EZgene 細菌DNA試劑盒提取，提取方法均按照試劑盒說明書進行。PCR反應體系均為50 μL，其中2 ×TaqPCR Master Mix 25 μL，10 μmol /L 的引物各1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O補齊至50 μL，PCR擴增程序如下：94 ℃預變性5 min，然后進入擴增循環(huán)，在每一個循環(huán)中先于94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，完成一個循環(huán)，共循環(huán)30次；最后72 ℃延伸10 min。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳對所收集的PCR產(chǎn)物進行檢測，電壓參數(shù)為100 V，通電時間為15 min。PCR產(chǎn)物送至成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序。

1.2.4 序列分析構建系統(tǒng)發(fā)育樹 將PCR擴增產(chǎn)物測序結果錄入GenBank中進行BLAST分析，再用DNAMAN 6.0進行序列相似性分析，以Neighbor-joining方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，用Bootstrap(1 000次重復)進行檢驗[14]。

2 結果與分析

2.1 內(nèi)生菌分離

經(jīng)過DNA分子鑒定，分離得到98株華山松內(nèi)生菌，其中細菌46株，真菌19株，放線菌33株。從根部分離到細菌11株，真菌11株，放線菌6株；從莖部分離到細菌13株，真菌5株，放線菌11株；葉部分離到細菌22株，真菌3株，放線菌16株(見表1)。從表1 可知，根部細菌和真菌所占比例較高，尤其是華山松根部真菌數(shù)所占比例占可培養(yǎng)真菌數(shù)的57.89%，且所分離可培養(yǎng)的真菌均為子囊菌門，與塊菌同屬一個門，細菌與塊菌的生長發(fā)育以及其特殊香味的形成也是密切相關的[15]。

分離出的細菌中歐文氏菌屬(Erwinia)5株，沙門氏菌屬(Salmonell)1株，桿菌屬(Bacillus)22株，葡萄球菌屬(Staphylococcus)2株，假單胞菌屬(Pseudomonas)2株，類芽胞桿菌屬(Paenibacillus)2株，布丘氏菌屬(Buttiauxella)2株，腸桿菌屬(Enterobacte)3株，愛文氏菌屬(Ewingella)1株，泛菌屬(Rahnella)1株，拉恩氏菌屬(RahnellaIzard)2株，其他屬1株。其中細菌菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹中基本分為3個大的分支，分別為桿菌屬、假單胞桿菌屬，以及含歐文氏菌屬的多種細菌屬，其中假單胞桿菌屬均分離自華山松葉部，其他細菌在華山松的根、莖、葉部，分布無明顯規(guī)律。

華山松的內(nèi)生真菌在系統(tǒng)發(fā)育樹中大致分為3個分支，以霉菌為主，而且所有的內(nèi)生真菌均為子囊菌門(Ascomycota)，其中青霉屬(Penicillium)4株，皰霉屬(Phoma)1株，子囊菌門未知菌1株，籃狀菌屬(Cladosporium)1株，分枝孢子菌屬(Sydowia)1株，曲霉屬(Aspergillus)1株，其他10株。放線菌中鏈霉菌屬(Streptomyces)22株，短小桿菌屬(Curtobacterium)2株，短桿菌屬(Brevibacterium)1株，其他屬19株。

2.2 內(nèi)生菌的系統(tǒng)進化地位

從NCBI數(shù)據(jù)庫選取下載與華山松內(nèi)生細菌和內(nèi)生真菌菌菌株16S rDNA和18S rDNA序列相似性可靠的14株細菌菌株和l4株真菌菌株，將它們的序列用ClustalX軟件進行比對，再用Mega 4.0程序中Neighbout-Joining方法建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結果表明內(nèi)生菌與其親緣關系近的菌株聚在一起(圖1、圖2)，相似性均達到了88%～99%。

2.3 序列分析構建系統(tǒng)發(fā)育樹

用Mega 4.0程序中Neighbout-Joining方法建立系統(tǒng)發(fā)育樹，掌握所分離菌之間的親緣關系。分離得到98株華山松可培養(yǎng)內(nèi)生菌，細菌46株，真菌19株，放線菌33株，如圖1和圖2，其菌株相似性均達到了88%～ 99%，對本研究所分離的青霉屬(Penicillium)、皰霉屬(Phoma)、籃狀菌屬(Cladosporium)、分枝孢子菌屬(Sydowia)、曲霉屬(Aspergillus)等，后續(xù)可用于探究華山松菌根形成是否與華山松內(nèi)生真菌群間的關系，以研發(fā)塊菌菌根接種微生物菌劑。

表1 內(nèi)生菌種類Table 1 Endophyte species

表2 塊菌宿主華山松不同部位內(nèi)生菌分離信息Table 2 Endophyte from Pinus armandii different parts

注：部分菌株信息重復，未在表中列出

圖1 塊菌宿主華山松內(nèi)生細菌進化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences of bacteria

從圖1和圖2可以看出，本研究所分離的可培養(yǎng)菌株可信度較高，分離的真菌在系統(tǒng)發(fā)育樹中大致分為3個分支，以霉菌為主，均為子囊菌門，并且本研究中分離到的來源于根部的子囊菌占較大比例(57.89%)，表明這些寄生于宿主華山松的子囊菌很可能主要來自菌塘土壤，并主要以根部進入植物內(nèi)，說明根部是植物內(nèi)生菌棲息的重要場所。

圖2 塊菌宿主華山松內(nèi)生真菌進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the ITS rDNA sequences of fungi

3 討 論

本研究分離得到98株華山松內(nèi)生菌，其中細菌46株，真菌19株，放線菌33株，分布于19個屬，從根部分離的可培養(yǎng)真菌均為子囊菌門，與塊菌同屬一門，這可能與塊菌的菌根形成有一定關系，在塊菌子囊果中單孢菌為印度塊菌的優(yōu)勢菌群，同時也是印度塊菌與云南松菌根的根際土壤常見優(yōu)勢菌群，這與本研究有觀點相同之處[16-17]。經(jīng)上述分析，可發(fā)現(xiàn)來自不同地點、不同植株部位、不同培養(yǎng)基分離得到的塊菌宿主華山松內(nèi)生菌分布存在差異，有一定的分布特征，如根部分離可培養(yǎng)菌均為子囊菌門，葉部分離的細菌種屬較多，其中華山松的根部可培養(yǎng)內(nèi)生真菌種類和數(shù)量最豐富，這與游見明對茶樹不同部位的內(nèi)生真菌分布研究結果一致[18]，可推測根部可能是植物內(nèi)生菌寄生或共生的主要部位。內(nèi)生菌與植物所形成的共生關系存在相互協(xié)調作用，內(nèi)生菌種類和數(shù)量可能會影響植物的生長，進而推測塊菌宿主植物內(nèi)生菌對塊菌在植物根部的形成或生長有所影響。

寄生于塊菌宿主華山松上的細菌種類較多，其中葉部的內(nèi)生細菌含量最多，占所分離可培養(yǎng)微生物的46.94%。占最大比例的細菌是桿菌屬，它們在華山松根莖葉均有分布且數(shù)量相當，桿菌屬在松樹中的存在之前已有報道，并發(fā)現(xiàn)該菌的存在與松樹的線蟲病相關，但對正常生長的松苗沒有作用，是一種弱致病菌[19]。桿菌屬的細菌在塊菌宿主華山松中的作用研究尚未見報道，它的存在是否對松樹的生長或對塊菌的生長具有抑制作用還需要進一步的研究。

塊菌與華山松之間屬于共生關系，塊菌的菌絲侵染植物根部形成外生菌根，形成真菌與植物的復合共生體。在本研究中，從華山松根部分離到的細菌、放線菌的菌落數(shù)目相當，有研究表明塊菌生長的菌塘土壤中含量最大的真菌類群屬于子囊菌門[20-21]，此外，富集于各類土壤的放線菌在華山松的根莖葉各部位中也占有一定比例，這反應了微生物與根系土壤、塊菌、宿主之間的關系密切，弄清它們之間的相互作用對于塊菌的人工種植具有十分重要的意義。本研究分離到的華山松內(nèi)生可培養(yǎng)真菌均屬于富含在塊菌菌塘土壤中的子囊菌，表明塊菌宿主華山松的植物內(nèi)生真菌的分布可能受塊菌存在的影響，關于塊菌宿主植物內(nèi)生菌群與塊菌產(chǎn)品、品種之間的關系，有待進一步研究。

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