飼用緩釋尿素對(duì)模擬瘤胃體外發(fā)酵的影響

張嬌嬌，李珊珊，白彥福，閆 琦，丁路明*

(1.蘭州大學(xué) 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州730000；2.蘭州大學(xué) 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué) 草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州730000)

我國是一個(gè)人口大國，畜禽產(chǎn)品需求量大，然而我國人均耕地面積少，蛋白質(zhì)資源缺乏，遠(yuǎn)不能滿足畜禽的需要，所以合理利用已有的蛋白資源和尋找新型蛋白替代飼料顯得尤為重要，自從1891年首次Zumts發(fā)現(xiàn)非蛋白氮(NPN)能代替日糧中的粗蛋白，NPN作為反芻動(dòng)物添加劑已經(jīng)受到動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)家的廣泛關(guān)注[1-3]。NPN類物質(zhì)主要有三大類：尿素及其衍生物、氨及銨鹽、酰胺化合物，因其為化工產(chǎn)品，能夠大批量生產(chǎn)，成本較低，可節(jié)約部分蛋白飼料，降低飼料成本，因而逐漸在生產(chǎn)中推廣使用，尿素因其經(jīng)濟(jì)性和有效性而被更廣泛應(yīng)用。為防止反芻動(dòng)物氨中毒，提高尿素利用的安全性和有效性，目前尿素主要以緩釋尿素的形式應(yīng)用于反芻動(dòng)物日糧中，本試驗(yàn)研究所用的NPN即是糊化淀粉緩釋尿素。目前我國對(duì)各類反芻動(dòng)物日糧中NPN的添加量尚未有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，為防止反芻動(dòng)物氨中毒，肉牛日糧中NPN的飼喂量可以為日糧干物質(zhì)的1.0%～1.5%[4]，而尿素在成年牛日糧中的比例一般不能超過2%[5]，本試驗(yàn)中緩釋尿素的添加比例參照此標(biāo)準(zhǔn)，旨在利用人工瘤胃體外發(fā)酵法探究不同緩釋尿素添加比例的體外發(fā)酵特點(diǎn)和差異，選擇出最適宜的緩釋尿素添加比例及其各項(xiàng)瘤胃發(fā)酵指標(biāo)間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與日糧

試驗(yàn)選取2頭12月齡，體重220 kg的健康秦川?！廖鏖T塔爾雜交肉牛(西雜牛)作為瘤胃液供體。瘤胃液供體牛栓系飼養(yǎng)，每日7:00 h和18:00 h飼喂，自由飲水。瘤胃液供體牛日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 飼料樣品處理

本試驗(yàn)以緩釋尿素添加水平分別為0%、1%、1.5%和2%，試驗(yàn)用緩釋尿素為糊化淀粉緩釋尿素(興牧，河北)，精粗比為30∶70的全混合日糧為試驗(yàn)材料，四種日糧組成及營養(yǎng)水平見表2，飼料樣品風(fēng)干后粉碎過1 mm網(wǎng)篩備用。準(zhǔn)確稱取(0.4 g±5 mg)飼料樣品于長5 cm、寬2 cm的自制尼龍袋(300目)中，每組4個(gè)重復(fù)。發(fā)酵72 h后，將裝有底物的尼龍袋放進(jìn)冰水中終止發(fā)酵反應(yīng),采集完所有的尼龍袋后,在25～39 ℃的溫水中洗滌尼龍袋,用玻璃棒不斷攪拌,不斷換水直至洗滌用水無色為止,晾干,帶回實(shí)驗(yàn)室分析體外干物質(zhì)發(fā)酵降解率(IVDMD)。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物飼糧組成及營養(yǎng)水平Table 1 Diet composition and nutrition level of experimental animals

1.3 體外培養(yǎng)產(chǎn)氣法

體外培養(yǎng)的人工瘤胃液配置方法參考Menke[6]的方法進(jìn)行，使用西德生產(chǎn)的100 mL的玻璃注射培養(yǎng)管，最小分度1 mL。注射培養(yǎng)管前端連接有5 cm左右的乳膠管，乳膠管上配套有止水夾，起到密封的作用。采用智能恒溫水浴箱作為體外發(fā)酵的恒溫控制裝置。體外發(fā)酵試驗(yàn)前一天將注射培養(yǎng)管在39 ℃預(yù)熱的狀態(tài)下，給注射器活塞涂抹適量的凡士林以便密封。并將涂抹好凡士林的注射培養(yǎng)管39 ℃恒溫過夜備用。將尼龍袋送入注射器前端，并將不加飼料樣的注射器作為空白對(duì)照。于上午09:00使用自制瘤胃軟導(dǎo)管分別采集兩頭瘤胃液供體牛瘤胃液300 mL，經(jīng)四層紗布過濾后一部分分裝入3個(gè)10 mL離心管中投入液氮罐帶回實(shí)驗(yàn)室低溫儲(chǔ)存，測定瘤胃液原樣指標(biāo)，一部分過濾到39 ℃預(yù)熱的保溫瓶中，并混合均勻。將瘤胃液與人工唾液以2∶1的比例混合均勻，用磁力攪拌器攪拌，同時(shí)通入無氧CO2。體外培養(yǎng)操作步驟參照米見對(duì)[7]的方法進(jìn)行。培養(yǎng)發(fā)酵開始后記錄0、2、4、6、8、10、12、24、48 h和72 h的產(chǎn)氣量，并于12、24、48 h和72 h用10 mL注射器從發(fā)酵注射器前端乳膠管處采集發(fā)酵氣體于5 mL真空采血管中，用于測定發(fā)酵氣體中甲烷含量。采集氣體后從注射器前端將氣體推出，為下一時(shí)間段發(fā)酵氣體騰出空間。72 h發(fā)酵結(jié)束后，立即測定瘤胃液pH，并將瘤胃液分裝于10 mL離心管中，投入液氮罐帶回實(shí)驗(yàn)室低溫保存，以備測定其銨態(tài)氮(NH3-N)和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量。發(fā)酵液中NH3-N的測定使用次氯酸鈉-苯酚分光光度計(jì)(日立，日本)比色法，VFA的測定使用氣相色譜儀測定(北分瑞麗，北京)。

1.4 產(chǎn)氣量計(jì)算

每個(gè)樣品各時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量由以下公式計(jì)算：0～12 h的產(chǎn)氣量計(jì)算公式為：GP=(V-V0-GP0)/M。式中：GP 為某個(gè)樣品在t時(shí)刻的產(chǎn)氣量(mL/g，DM)；V為t時(shí)刻樣品培養(yǎng)管讀數(shù)(mL)；V0為0時(shí)刻樣品培養(yǎng)管讀數(shù)(mL)；GP0為t時(shí)刻空白培養(yǎng)管產(chǎn)氣量平均值(mL)；M為絕干基礎(chǔ)樣品質(zhì)量；12、24、48 h和72 h采集并放空氣體后，記錄注射器刻度，產(chǎn)氣量計(jì)算方法與上面相同。

1.5 產(chǎn)氣規(guī)律擬合

采用Orskov等[8]提出的數(shù)學(xué)模型dp=a+b(1-e-ct)對(duì)0～72 h產(chǎn)氣規(guī)律進(jìn)行擬合。式中：dp(mL)是t時(shí)刻的產(chǎn)氣量，a(mL)是快速降解部分的產(chǎn)氣量，b(mL)是慢速降解部分的產(chǎn)氣量，c(%/h)是慢速降解部分的產(chǎn)氣速率，a+b(mL)是理論總產(chǎn)氣量，t(h)是發(fā)酵的時(shí)間。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS20.0進(jìn)行ANOVA方差分析和LSD多重比較，數(shù)據(jù)表示為平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同緩釋尿素添加比例對(duì)體外發(fā)酵產(chǎn)氣的影響

由表3可知，發(fā)酵后2 h，2%添加組產(chǎn)氣量顯著低于0%添加組(P<0.05)，而1%和1.5%添加組與各組差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵后4～8 h，0%和1%添加組產(chǎn)氣量顯著高于1.5%和2%添加組(P>0.05)，而0%和1%添加組及1.5%和2%添加組差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵后10 h，1%添加組產(chǎn)氣量顯著高于其余各試驗(yàn)組(P<0.05)，0%添加組顯著高于2%添加組(P<0.05)，而1.5%添加組與0%和2%添加組差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵后12 h，1%添加組產(chǎn)氣量顯著高于其余各試驗(yàn)組(P<0.05)，而0%、1.5%和2%添加組間差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵后24 h，1%添加組顯著高于0%添加組(P<0.05)，而1.5%和2%添加組與各組之間差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵后48和72 h，0%添加組顯著低于其余各試驗(yàn)組(P<0.05)，而其余各試驗(yàn)組差異不顯著(P>0.05)。0%添加組的快速降解部分的產(chǎn)氣量(a)顯著高于2%部分的產(chǎn)氣量(P<0.05)，而1%和1.5%添加組與各組差異不顯著(P>0.05)。0%添加組的慢速降解部分的產(chǎn)氣量(b)和理論最大產(chǎn)氣量(c)顯著低于其余各試驗(yàn)組(P<0.05)，而其余各試驗(yàn)組間差異不顯著(P>0.05)。

表2 體外發(fā)酵日糧組成及營養(yǎng)成分Table 2 Diet composition and nutrient composition

表3 不同緩釋尿素添加比例對(duì)體外發(fā)酵累計(jì)不同時(shí)間產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣系數(shù)的影響Table 3 Effect of different proportion of slow release urea on gas production rate and gas production coefficient of in vitro fermentation

2.2 不同緩釋尿素添加比例對(duì)體外發(fā)酵產(chǎn)甲烷的影響

由表4可知，發(fā)酵后0～12 h的產(chǎn)氣中，隨著緩釋尿素添加比例的升高，甲烷產(chǎn)氣量呈現(xiàn)先顯著升高后顯著降低的趨勢，1.5%添加組甲烷產(chǎn)量顯著高于其余各試驗(yàn)組(P<0.05)。發(fā)酵后12～24 h，1.5%添加組顯著高于2%添加組(P<0.05)，而0%和1%添加組與各組差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵后24～48 h，1%添加組顯著低于1.5%和2%添加組(P<0.05)，而0%添加組與各組間差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵后48～72 h，2%添加組顯著高于各試驗(yàn)組(P<0.05)，1.5添加組顯著高于1%添加組(P<0.05)，而0%添加組與1%和1.5%添加組差異不顯著(P>0.05)。1%添加組總甲烷產(chǎn)量顯著低于1.5%添加組(P<0.05)，而0%和2%添加組與各組間差異不顯著(P>0.05)。

表4 發(fā)酵不同階段的甲烷產(chǎn)氣量Table 4 Methane production at different stages of fermentation

2.3 不同緩釋尿素添加比例對(duì)日糧消化率及72 h后發(fā)酵液指標(biāo)的影響

由表5可知，1%添加組的日糧降解率顯著高于0%和2%添加組(P<0.05)，1.5%和2%添加組的消化率顯著高于0%添加組(P<0.05)，而1.5%添加組與1%和2%添加組間差異不顯著(P>0.05)。1%添加組pH顯著低于其余各試驗(yàn)組(P<0.05)，而其余各試驗(yàn)組間差異不顯著(P>0.05)。各處理組間NH3-N濃度、乙酸、丙酸、丁酸差異不顯著(P>0.05)。1%添加組的異丁酸顯著高于其余各試驗(yàn)組(P<0.05)，0%添加組顯著高于2%添加組(P<0.05)，而1.5%添加組與其差異不顯著(P>0.05)。

表5 不同日糧消化率及72 h后發(fā)酵液指標(biāo)Table 5 Digestibility of different diets after fermentation

3 討 論

3.1 不同緩釋尿素添加比例對(duì)體外發(fā)酵產(chǎn)氣的影響

體外發(fā)酵產(chǎn)氣量是評(píng)價(jià)反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵的重要指標(biāo)，它綜合反映飼料的可發(fā)酵程度，表現(xiàn)了瘤胃微生物活動(dòng)的總體趨勢，是反映飼料營養(yǎng)價(jià)值的綜合指標(biāo)，飼料的可發(fā)酵程度越強(qiáng)，瘤胃微生物的活性越高，產(chǎn)氣量就越多[9]。本試驗(yàn)結(jié)果中，1%添加組產(chǎn)氣量始終顯著高于其余試驗(yàn)組，這表明1%添加組飼料的可發(fā)酵程度、蛋白價(jià)值、微生物的活性較高，這是因?yàn)槲肝⑸锘钚允茱暳夏芰亢偷鞍拙C合影響，是能氮平衡的反應(yīng)。底物的可降解程度越高，瘤胃微生物的活性也越高，對(duì)底物的降解程度增加，產(chǎn)氣量也越大，底物的降解率與產(chǎn)氣量呈正比。故1%添加組底物較其余各組有較高的降解率和產(chǎn)氣量。0%添加組在發(fā)酵后前8 h產(chǎn)氣量顯著高于1.5%和2%添加組，而發(fā)酵24 h后0%添加組產(chǎn)氣量顯著低于1.5%和2%添加組，此結(jié)果與使用方程dp=a+b(1- e-ct)擬合出來的結(jié)果一致，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵初始階段1.5%和2%添加組緩釋尿素具有較高的pH，抑制了瘤胃微生物的活性，進(jìn)而抑制了飼料中可溶性營養(yǎng)成分的降解，所以產(chǎn)氣較少，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，緩釋尿素在瘤胃微生物脲酶的作用下釋放出的NH3-N被瘤胃微生物利用，提高了瘤胃微生物的活性并促進(jìn)了飼料氮與能量的協(xié)同利用，所以呈現(xiàn)出本試驗(yàn)的產(chǎn)氣量變化規(guī)律。

3.2 不同緩釋尿素添加比例對(duì)體外發(fā)酵產(chǎn)甲烷的影響

甲烷是除CO2外最主要的溫室氣體之一，反芻動(dòng)物呼吸和飼料發(fā)酵排放的甲烷在溫室氣體清單中占較大的比重[10-11]，緣于反芻動(dòng)物瘤胃中的產(chǎn)甲烷菌能有效地將細(xì)菌和真菌分解飼料有機(jī)物產(chǎn)生的H2和甲酸、甲醇、甲胺及乙酸等含有甲基的初級(jí)發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為甲烷，并以此獲得其生長所需要的能量。本試驗(yàn)中各組甲烷產(chǎn)氣量隨發(fā)酵時(shí)間的延長，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這是因?yàn)殡S著發(fā)酵的進(jìn)行，底物產(chǎn)氣速率降低，產(chǎn)氣量減少。反芻動(dòng)物胃腸道產(chǎn)生甲烷是必須的過程，不能被完全清除，但是可以通過改善飼料消化率和均衡營養(yǎng)等方式減少甲烷排放[12]，本試驗(yàn)中試驗(yàn)各組能氮相同，但1%添加組在各時(shí)間階段的甲烷產(chǎn)氣量和總甲烷產(chǎn)氣量較其余各試驗(yàn)組低，表明1%添加組后備奶牛對(duì)日糧具有較高的利用率，攝入的能量以甲烷形式損失的較少。

3.3 不同緩釋尿素添加比例對(duì)日糧消化率及72 h后發(fā)酵液指標(biāo)的影響

飼料降解率是反映飼料利用效率的重要指標(biāo)，譚支良等[13]在用體外法研究不同來源的氮和碳水化合物對(duì)體外干物質(zhì)降解率的影響研究中發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)比例的尿素添加能夠顯著提高體外干物質(zhì)降解率，而過量補(bǔ)充尿素會(huì)抑制體外干物質(zhì)的降解率，本試驗(yàn)結(jié)果中1%添加組飼料降解率顯著高于其余各試驗(yàn)組，之后隨著緩釋尿素添加比例的增加，飼料降解率降低，此結(jié)果與其研究結(jié)果一致。瘤胃液pH值是反映瘤胃發(fā)酵狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)，正常成年反芻動(dòng)物瘤胃pH維持在6～7之間，pH低于6.0時(shí)將嚴(yán)重抑制日糧纖維的消化，本試驗(yàn)中pH變化范圍在6.79～6.89，屬于正常變化范圍。馬陜紅等[14]對(duì)非蛋白氮的模擬瘤胃體外發(fā)酵的研究發(fā)現(xiàn)，日糧中瘤胃可消化蛋白水平能夠顯著提高瘤胃內(nèi)pH，本試驗(yàn)結(jié)果中1%添加組的pH顯著低于其余各試驗(yàn)組，這是因?yàn)?%添加組飼料消化率高，碳水化合物以甲烷形式浪費(fèi)的較少，產(chǎn)生更多的揮發(fā)性脂肪酸所致(表5)。瘤胃液中NH3-N濃度是反映瘤胃氮代謝的重要指標(biāo)之一，NH3-N除了是瘤胃內(nèi)氮代謝過程中外源(日糧)蛋白質(zhì)以及內(nèi)源含氮物質(zhì)降解的主要產(chǎn)物，還是能量和碳源存在的條件下，合成瘤胃微生物菌體蛋白的原料，其濃度高低可反映日糧蛋白降解情況和微生物合成菌體蛋白的效率[15-16]。本試驗(yàn)中各組瘤胃液NH3-N濃度差異不顯著，但各組間NH3-N濃度呈現(xiàn)和pH相同的變化趨勢，這是因?yàn)?%添加組NH3-N在能量和碳源存在的條件下合成微生物菌體蛋白的效率較高，降低了發(fā)酵液中的NH3-N濃度。瘤胃液VFA是有機(jī)物在瘤胃中發(fā)酵的主要產(chǎn)物，是反芻動(dòng)物維持其正常新陳代謝的主要能源物質(zhì)和體內(nèi)進(jìn)行脂肪合成的重要底物，其含量及組成比例是反映瘤胃消化代謝活動(dòng)的主要指標(biāo)之一，本試驗(yàn)結(jié)果中各試驗(yàn)組TVFA、乙酸、丙酸、丁酸含量差異不顯著，但是TVFA有隨緩釋尿素添加先升高后降低的趨勢，并在1%添加組達(dá)到最大值，表明1%緩釋尿素添加組發(fā)酵管中消化代謝活動(dòng)最活躍，能夠?yàn)榉雌c動(dòng)物育肥提供豐富的脂肪合成底物。

尿素是脲酶的誘導(dǎo)物，進(jìn)入瘤胃中的尿素越高，脲酶活性就越高，在瘤胃中釋放的氨越多，而氨溶于水呈堿性，所以會(huì)使瘤胃液pH升高[5,17]，在以往的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)隨著日糧天然蛋白含量和日糧中非蛋白氮用量的增加，會(huì)使瘤胃中NH3-N的濃度和pH升高，同時(shí)使非蛋白氮利用率降低[5,14]，而本試驗(yàn)隨著緩釋尿素添加比例的升高，在緩釋尿素添加比例為1%時(shí)發(fā)酵液NH3-N的濃度和pH都出現(xiàn)了降低的趨勢，同時(shí)底物降解率、產(chǎn)氣量、揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量都在1%添加組達(dá)到最大值，而甲烷產(chǎn)量在1%添加組最低，這是因?yàn)樵?%緩釋尿素添加組在脲酶作用下底物中釋放的氮與能量利用的同步性較高，瘤胃微生物增殖和發(fā)酵活動(dòng)活躍，產(chǎn)生更多的微生物蛋白，底物能量以甲烷形式浪費(fèi)的較少，所以底物降解率、產(chǎn)氣量和揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量都在此時(shí)達(dá)到最大值。

4 結(jié) 論

用體外發(fā)酵法對(duì)日糧中添加不同比例緩釋尿素的研究發(fā)現(xiàn)，1%的緩釋尿素添加能夠顯著提高底物降解率和發(fā)酵液揮發(fā)性脂肪酸含量，并顯著降低甲烷產(chǎn)量，減少溫室氣體排放。綜合經(jīng)濟(jì)利益和環(huán)境角度考慮，實(shí)際生產(chǎn)中西雜牛日糧中緩釋尿素的添加比例為日糧干物質(zhì)的1%最合適。

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