三江黃牛DKK1、DKK4和MyoG基因遺傳多態(tài)性分析

郭 琳，柴志欣，鐘金城*，何世明，吳錦波，蹇尚林，冉 強(qiáng)

(1. 西南民族大學(xué) 青藏高原研究院，成都 610041；2. 阿壩州畜牧科學(xué)研究所，四川 汶川 623000;3. 阿壩州畜牧工作站，四川 汶川 623000)

三江黃牛主產(chǎn)于四川省汶川縣的三江、白石、水磨、映秀和漩口等鄉(xiāng)鎮(zhèn)，其中屬三江鄉(xiāng)數(shù)量最多，三江鄉(xiāng)位于汶川縣西南部，地勢開闊平坦，河流支流豐富，實(shí)屬天然牧場。三江黃牛是役肉兼用型地方優(yōu)良品種，屠宰率43%，凈肉率31%，被村民稱為“土拖拉機(jī)”，其體形大，身體長、腿粗大有力、性馴善、耐粗飼、耐高寒、抗病力和適應(yīng)性強(qiáng)、肉質(zhì)好、持久力好[1]，但也存在生長速度較慢、胴體率低等缺點(diǎn)。近年來，隨著當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)社會的發(fā)展和農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)型，以及汶川地震的發(fā)生，導(dǎo)致三江黃牛產(chǎn)區(qū)功能布局空間受限，使現(xiàn)有養(yǎng)殖規(guī)模萎縮、三江黃牛數(shù)量不斷下降，已瀕臨滅絕，做好三江黃牛的保種選育工作顯得尤為重要。

DKK1是Dickkopf蛋白家族(DKKs)成員之一，是1998年A.Glinka等首次在非洲爪蟾胚胎細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的[2]。DKK1蛋白是一種分泌型糖蛋白，能夠與細(xì)胞膜上 Wnt受體蛋白 5(LRP5)/LRP6和共受體Kremen1/Kremen2結(jié)合，形成三元內(nèi)吞小體，阻斷Wnt信號通路，從而參與動物骨骼發(fā)育及脂肪形成[3-4]。DKK4也是DKKs成員之一，含有兩個富含半胱氨酸區(qū)域的分泌型糖蛋白，也是構(gòu)成Wnt拮抗劑的重要成分之一，與DKK1蛋白的作用機(jī)制相似。肌細(xì)胞生成素(MyoG Myogenin)基因是MyoD基因家族中唯一在所有骨骼肌細(xì)胞中均可表達(dá)的基因，調(diào)控中胚層細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞、再由成肌細(xì)胞融合成肌纖維[5]，影響著骨骼肌的發(fā)育。三江黃牛作為優(yōu)良的地方品種，對其經(jīng)濟(jì)性狀的研究尚未見報道，而研究肉質(zhì)性狀和生長性狀是選育工作的重要參考指標(biāo)。相關(guān)研究顯示，DKK1、DKK4、MyoG基因在骨骼發(fā)育和骨平衡中也發(fā)揮重要作用，是骨再塑的重要調(diào)控因子。本研究選取即影響動物骨骼發(fā)育又對肉質(zhì)性狀具有顯著作用的DKK1、DKK4 、MyoG基因，以三江黃牛為研究對象，篩選候選基因的SNP位點(diǎn)，為開展三江黃牛資源的保存與利用、功能基因的定位提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

在四川省阿壩藏族羌族自治州汶川縣三江鎮(zhèn)選取健康成年三江黃牛共100頭，從中挑選年齡一致(3歲齡)、膘情相近的個體30頭用于試驗(yàn)，采集耳組織，75%乙醇保存帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取及檢測

采用動物組織基因組DNA提取試劑盒(天根生物技術(shù)有限公司)提取基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)分別檢測DNA的純度和濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

參考GenBank中牛DKK1基因(AC_000183)，牛DKK4基因(AC_000184)及牛MyoG基因(AC_000173)序列，采用交叉重疊原理，用Primer Premier6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物設(shè)計(jì)均覆蓋整個基因(表2)，引物由英濰捷基(上海)生物技術(shù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系(50 μL)， 其中DNA模板1 μL，上下游引物各2 μL，dd H2O 19 μL、Premix Ex Taq 聚合酶25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 變性30 s，(退火30 s，72 ℃延伸)具體見表1，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用10%凝膠電泳進(jìn)行檢測，用DNA膠回收試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行純化、回收，將純化產(chǎn)物送往英濰捷基(上海)生物科技有限公司進(jìn)行雙向測定。

表1 引物信息Table 1 Information of primer

1.4 SNP位點(diǎn)的篩查與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用BioEdit7.0.5軟件對擴(kuò)增序列與參考序列進(jìn)行比對。利用直接測序法檢測篩查的雙峰位點(diǎn)，利用以上軟件對所測序列進(jìn)行比對，篩查SNP位點(diǎn)，并交由公司測序判定基因型。根據(jù)檢測結(jié)果，統(tǒng)計(jì)不同基因型個體數(shù)量。利用PIC_CALC、Popgen32、SPSS17.0等軟件分析基因頻率、基因型頻率、多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)、基因純合度及雜合度。

2 結(jié)果與分析

2.1 DKK1、DKK4 、MyoG基因SNP位點(diǎn)

DKK1基因不同引物擴(kuò)增片段與預(yù)期長度一致。利用BioEdit 7.0.5生物軟件查找雙峰位點(diǎn)，對測序獲得SNP位點(diǎn)進(jìn)行校對。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果顯示，三江黃牛DKK1基因存在2個單核苷酸突變位點(diǎn)(A1051G、G1152T)均位于內(nèi)含子中，序列分析可知 A1051G位點(diǎn)包括AA、GA、GG三種基因型，G1152T位點(diǎn)基因型為GG、GT和TT(圖1)。DKK4基因存在2個單核苷酸突變位點(diǎn)，位點(diǎn)C1949T包括AG、GG和AA三種基因型，位點(diǎn)C1749T的兩種基因型分別為TC和CC基因型(圖2)。三江黃牛MyoG基因測序結(jié)果未檢測到SNP位點(diǎn)。

2.2 基因型頻率、基因頻率

三江黃牛DKK1、DKK4基因SNP位點(diǎn)基因型頻率和基因頻率見表2。由表2可以看出，在位點(diǎn)A1051G中， AA、GG和AG的基因型頻率分別為0.13、0.50和0.37，GG型為優(yōu)勢基因型；G1152T位點(diǎn)，GG和TT基因型頻率為0.33和0.17，GT型為0.50，為優(yōu)勢基因型。在兩個突變位點(diǎn)中等位基因G均為優(yōu)勢等位基因。

圖1 三江黃牛DKK1基因SNP篩查及基因分型圖Fig.1 SNP screening and genotyping of sequencing of DKK1 gene in Sanjiang Yellow Cattle

圖2 三江黃牛DKK4基因SNP位點(diǎn)測序及分型圖Fig.2 SNP screening and genotyping of sequencing of DKK4 gene in Sanjiang Yellow Cattle

表2 三江黃牛DKK1、DKK4基因SNP位點(diǎn) 基因型頻率和基因頻率Table 2 Genotype allele and frequencies of SNP sites in DKK1 and DKK4 gene

三江黃牛DKK4基因C1949T位點(diǎn)，CT、CC和TT基因型頻率為0.53、 0.27和0.20；位點(diǎn)C1749T，CC為優(yōu)勢基因型。C1949T和C1749T等位基因C均為優(yōu)勢等位基因，頻率分布分別為0.53和0.85。

2.3 群體多態(tài)性及χ2適合性檢驗(yàn)

對三江黃牛DKK1基因SNP位點(diǎn)進(jìn)行卡方適合性檢驗(yàn)，A1051G、G1152T位點(diǎn)卡方值為0.7001，0.0245，均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)，群體處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。三江黃牛DKK1基因SNP位點(diǎn)多態(tài)信息含量均為中度多態(tài)(0.25

三江黃牛DKK4基因多態(tài)位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，在長期進(jìn)化過程當(dāng)中達(dá)到了群體遺傳平衡。C1949T位點(diǎn)為中度多態(tài)(0.25

3 討 論

中國黃牛品種多且分布廣泛，主要分布于全國29個省、市、自治區(qū)和直轄市，分為北方黃牛和南方黃牛[6]。三江黃牛作為南方黃牛的一種，以其良好的役用性、優(yōu)質(zhì)的肉用性，作為優(yōu)良地方品種為當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)社會的發(fā)展發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)今，由于三江黃牛養(yǎng)殖規(guī)模萎縮，數(shù)量不斷下降，現(xiàn)存欄量僅2000多頭，已瀕臨滅絕，因此，開展三江黃牛種質(zhì)資源研究，做好保種工作顯得尤為重要。目前，對三江黃牛的研究主要集中在遺傳多樣性方面，而對其經(jīng)濟(jì)性狀的研究較少。陳智華等[7]通過對三江黃牛Bola-DRB3基因第2外顯子進(jìn)行PCR-RFLP 多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)三江黃牛該基因存在7種基因型，遺傳多樣性豐富。汪琦等[8-9]、宋娜娜等[10]通過對三江黃牛mtDNA D-loop、cytb、RAPD以及全基因組測序研究發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性豐富。相關(guān)研究顯示，DKK1、DKK4 及MyoG基因作為影響骨骼生長發(fā)育的重要候選基因，在調(diào)控肢體骨骼發(fā)育，影響生長發(fā)育及肉質(zhì)性狀等方面均發(fā)揮重要作用。高建斌等[11]通過對秦川牛DKK1基因SNP位點(diǎn)篩選及關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)其在內(nèi)含子及外顯子區(qū)共存在5個突變位點(diǎn)，且部分突變位點(diǎn)與秦川牛體尺性狀及肉質(zhì)性狀顯著相關(guān)。曹貴玲等[12]研究發(fā)現(xiàn)山羊DKK1基因全長3491 bp，有4個外顯子和3個內(nèi)含子構(gòu)成，位于啟動區(qū)的多態(tài)位點(diǎn)與其生產(chǎn)性狀無顯著關(guān)聯(lián)。高建斌等[11]報道顯示秦川牛DKK4基因外顯子區(qū)段共檢測到5個SNP位點(diǎn)，其中位于第二外顯子的G65A位點(diǎn)在體斜長、腰角寬、胸圍和坐骨端寬指標(biāo)存在極顯著差異(P<0.01)，尻長指標(biāo)存在顯著差異(P<0.05)。朱超杰等[13]利用PCR-SSCP技術(shù)對草原紅牛、延邊黃牛、紅安格斯×西門塔爾及利木贊×西雜牛4個群體的MyoG基因外顯子1進(jìn)行多態(tài)性比較分析，發(fā)現(xiàn)存在AA、AB及BB三種基因型，其中前兩種占多數(shù)，BB基因型數(shù)量較少。韓銀倉等[14]發(fā)現(xiàn)河南縣歐拉型藏羊、祁連縣高原型藏羊和貴南縣黑藏羊MyoG基因外顯子1存在SNP，關(guān)聯(lián)性分析顯示河南縣歐拉羊群體中CC基因型個體的體重、體高和體長顯著相關(guān)。

表3 三江黃牛DKK1、DKK4基因SNP位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性Table 3 Genetic polymorphism of SNP sites of DKK1 and DKK4 gene

本研究主要利用DNA池直接測序技術(shù)對三江黃牛DKK1、DKK4 及MyoG基因進(jìn)行SNP位點(diǎn)篩查。三江黃牛DKK1、DKK4基因均檢測發(fā)現(xiàn)2個SNP位點(diǎn)，其中DKK1、DKK4基因中SNP位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，說明位點(diǎn)受基因突變、人工選擇等因素影響較小，適應(yīng)性好，利于品種優(yōu)良基因的保存，以上位點(diǎn)在三江黃牛中的選擇空間較大，應(yīng)加大人工選擇的強(qiáng)度。且 SNP位點(diǎn)純合度均大于0.5，與高建斌等[11]對秦川牛DKK1基因SNP位點(diǎn)篩選分析結(jié)果一致。三江黃牛MyoG基因未檢測到多態(tài)位點(diǎn)，這與楊漫漫等[15]對皖東牛和廣豐牛MyoG基因PCR-RFLP檢測發(fā)現(xiàn)外顯子區(qū)域存在酶切多態(tài)位點(diǎn)的結(jié)果存在差異，皖東牛是2011年安徽省審定的地方黃牛品種，與三江黃牛均屬于優(yōu)良的地方黃牛品種，因皖東牛與三江黃牛生活環(huán)境存在較大差異，且遺傳基礎(chǔ)不同，也可能導(dǎo)致結(jié)果存在差異。通過宋娜娜等[16]對三江黃牛全基因組數(shù)據(jù)的分析，挖掘影響三江黃牛經(jīng)濟(jì)性狀、生長性狀的關(guān)鍵候選基因及SNPs位點(diǎn)。

目前，三江黃牛純種存欄數(shù)僅2000多頭，瀕臨滅絕，地方政府及畜牧工作站正在積極調(diào)整三江黃牛產(chǎn)區(qū)布局，實(shí)行獎補(bǔ)機(jī)制，鼓勵養(yǎng)殖戶擴(kuò)大養(yǎng)殖規(guī)模，建立健全三江黃牛遺傳資源保種選育機(jī)制，使該優(yōu)良地方品種數(shù)量得以恢復(fù)。同時，三江黃牛存在生長速度慢、胴體率低等缺點(diǎn)，依此本研究篩選了DKK1、DKK4 及MyoG與生長及骨骼發(fā)育相關(guān)基因進(jìn)行SNP位點(diǎn)篩查，但因采樣時為夏季，牛群在較遠(yuǎn)的夏季牧場，致使采樣數(shù)量較少不足以代表整個群體的發(fā)育情況，且沒有進(jìn)行體尺性狀指標(biāo)的測定及關(guān)聯(lián)性分析，在接下來的研究中要進(jìn)一步加大樣本量，并進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，為三江黃牛經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳改良提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

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