棗果黑斑病對南疆紅棗品質的影響

許 瑛，姚兆群，王 蘭，趙思峰

(1.新疆綠洲農業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點實驗室/石河子大學 農學院，新疆石河子 832003；2.塔里木大學 植物科學學院，新疆阿拉爾 843300 )

紅棗(ZizyphusjujubeMill)富含維生素、氨基酸、糖類、蛋白質等多種營養(yǎng)成分，是集營養(yǎng)保健與醫(yī)藥療效為一體的優(yōu)質果品[1]。新疆南疆已成為中國重要的商品棗基地，紅棗種植對當地農民增收發(fā)揮重要作用[2]。近年來棗果黑斑病在南疆紅棗種植區(qū)普遍發(fā)生，輕者發(fā)病率達到10%左右，嚴重地塊甚至60%以上的果實發(fā)病，發(fā)病病果表面出現黑色斑塊，病組織深入果肉3～5 mm，易脫落，對紅棗產量和品質均造成較大影響[3-4]。消費者通常依據紅棗果品的大小、色澤、風味、營養(yǎng)、質地等特征來評價紅棗品質的優(yōu)劣，已有報道表明產地和年份對紅棗品質有較大影響[5]，而合理密植、合理的水肥管理[6-8]、合理修剪及適期采收[9-10]等措施均可有效提高棗果內在及外觀品質。目前，對新疆棗果黑斑病的研究已有很多，主要集中在危害情況、病原鑒定、發(fā)生規(guī)律調查以及防治方法等方面[3-4]，而紅棗感染黑斑病后的品質變化和食用安全性方面的研究則未見報道。棗果黑斑病的致病菌主要為鏈格孢菌(Alternariaalternata)[3-4]，已有大量文獻報道該菌可產生交鏈孢酚(Alternariol，AOH)、交鏈孢酚單甲醚(Alternariol monomethyl ether，AME)、交鏈孢烯(Altenuene，ALT)、交鏈孢菌酮酸(Tenuazonic acid，TeA)、AAL毒素(Alternariaalternatatoxin，AAL)、交鏈孢毒素(Altertoxin，ATXs)和騰毒素(Tentoxin，TEN)等70多種真菌毒素，其中AOH和AME對哺乳動物具有強致癌性，且存在協同效應[11-13]，而TeA已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，FDA)列入有毒化學物質，作為必須檢測對象[14]。2015年中國針對出口水果制訂鏈格孢菌毒素檢測標準，但對紅棗棗果感染鏈格孢菌后毒素檢測辦法和標準目前尚未見報道[15]。

本研究以南疆產量較大的‘駿棗’和‘灰棗’2個品種為研究對象，通過對健康棗果和被鏈格孢菌感染不同發(fā)病程度棗果的外觀、著色、營養(yǎng)價值、風味等內外品質指標進行比較，同時對不同發(fā)病程度果實中鏈格孢菌毒素種類及數量進行測定，最終評價棗果黑斑病對南疆紅棗品質和食用安全性的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

棗果：2016年在新疆阿拉爾市農科所實驗棗園采集，棗園樹齡6 a，老棗股結果，栽培密度為0.6 m×1.5 m，灌水方式為滴灌，常規(guī)管理，采集品種有‘駿棗’和‘灰棗’。在果實脆熟期，分別從不同品種棗園隨機選取樹冠外側2～3 a生棗股上健康和感病果實樣品，將采集的紅棗在低溫冷藏條件下帶回實驗室，備用。采集回來的‘駿棗’‘灰棗’棗果參考劉艷祥等[16]報道黑斑病病害分級標準并略作修改后分級。0級：果面光潔，無病斑；1級：果面病變面積占總面積20%以下；2級：果面病變面積占總面積21%～40%；3級：果面病變面積占總面積41%～60%；4級：果面病變面積占總面積61%以上。各等級棗果隨機混勻用于后續(xù)各種指標的測定。

試劑：交鏈格孢酚單甲醚(AME)和鏈格孢酚(AOH)標準品購于美國Sigma公司；細交鏈格孢菌酮酸(TeA)和交鏈孢烯(ALT)標準品購于北京萊耀生物公司；L-亮氨酸、蒽酮、乙酸乙酯、茚三酮、抗壞血酸、乙酸乙酯、3,5-二硝基水楊酸、考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白質、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、乙腈等試劑購于石河子市沃德生物試劑營銷部。Xevo TQ/MS超高效液相色譜串聯質譜儀(美國Waters公司)，配有AcquityUPLCBEH C18液相色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)。

1.2 方 法

1.2.1 外在品質測定 分別隨機選取20 顆不同病級的‘駿棗’和‘灰棗’棗果，用電子天平稱量單果質量、數顯電子游標卡尺測定果實縱經、橫經并計算其果形指數；使用GY4硬度計測定果肉硬度，每個果實去皮后隨機測定5次，取平均值；果皮色差使用色彩色差儀自動檢測，采用“CIE Lab”表色系統，在D65/10光源下測定L*(亮度)，a*(紅色飽和度)和b*(黃色飽和度)，根據測定結果分別計算其色澤比(CIE)、色飽和度、色差(NBS)，每個果實測定4個果面及果實胴部，共計測定5個面；將20個果實烘干至恒量計算質量含水量。

1.2.2 內在品質測定 分別隨機選取20 個黑斑病不同病級的‘駿棗’和‘灰棗’棗果，將單個紅棗去皮去核，果肉用混合冷凍球磨儀打碎，分別測定維生素C、蛋白質、游離氨基酸、可溶性糖、還原糖、可滴定酸的含量，每個樣品重復3次。其中維生素C采用紫外快速測定法[17]，蛋白質采用考馬斯亮藍G-205染色法，可溶性總糖采用蒽酮比色法，還原糖采用3,5二硝基水楊酸法，游離氨基酸采用茚三酮比色法[18-19]，可滴定酸采用酸堿滴定法測定[20]。

1.2.3 不同發(fā)病程度棗果中鏈格孢菌毒素檢測 毒素提?。悍謩e稱取上述各等級破碎果肉2 g，加入50 mL離心管中，加入φ=1%甲酸-乙腈溶液10 mL、冷水10 mL，旋渦震蕩10 min，繼續(xù)加4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉震蕩10 min，5 000 r/min 離心5 min，輕輕吸取4 mL上清液與15 mL離心管中，加入0.2 g PSA、0.6 g無水硫酸鎂震蕩提取30 min，4 000 r/min離心5 min，輕取2.5 mL上清液使用水浴氮吹儀濃縮干燥，之后使用0.2 mL甲醇溶解，過濾，取該提取液到超高效液相色譜-串聯質譜儀用于鏈格孢霉毒素檢測。

毒素檢測條件：超高效液相色譜-串聯質譜條件色譜柱：Acquity UPLC BEH C18液相色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)；流動相：乙腈-水(φ=0.1%甲酸)；離子化模式：電噴霧離子源，正離子模式(ESI+)；質譜掃描方式：多反應監(jiān)測(MRM)；毛細管電壓3.5 kV，錐孔電壓40 kV，離子源溫度150 ℃，霧化溫度500 ℃，脫溶劑氣流量1 000 L/h，錐孔氣流速50 L/h。4種鏈格孢霉毒素的監(jiān)測離子、錐孔電壓和碰撞電壓等質譜參數見表1。

1.3 數據處理

測定得到的數據采用Excel 2010處理，用SPSS 19.0進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)病嚴重度對果實外觀品質的影響

2.1.1 對物理性狀的影響 與健康棗果相比，‘駿棗’和‘灰棗’不同發(fā)病程度棗果大小、果形指數、硬度、質量含水量均存在顯著性變化(表2)。與健康‘駿棗’相比，隨著發(fā)病嚴重度的增加，駿棗單果質量下降幅度為5.33%～45.61%；果實橫經降低5.2%～13.4%，縱經間無顯著差異；果形指數增加1.39%～12.5%；硬度降低11.4%～56.0%；質量含水量降低1.43%～18.1%。與健康‘灰棗’相比，發(fā)病‘灰棗’鮮果質量略有增加，增加幅度為7.5%～20.0%；果實縱徑增加0.08%～15.40%，橫經無顯著變化；果形指數增加4.17%～10.42%；硬度下降13.88%～39.04%；質量含水量間也存在顯著差異，發(fā)病越嚴重質量含水量越低，1～4級灰棗分別減少11.05%～23.15%。

2.1.2 對果實色度的影響 紅棗感染棗果黑斑病后棗果色度也發(fā)生明顯變化(表3)。其中L*表示果皮色澤的明暗程度，L*越大，果實越亮，a*表示紅色與綠色相比的程度，a*值越大，果實紅色越深，b*表示黃色與藍色的相比程度，b*值越大，果實黃色越深，色澤比h是色調參數中的1個指標，當h>1說明果實偏紅偏暗，色飽和度C表示色彩的純潔性，C值越大，表示果實顏色越鮮艷，△Eab是L*、a*、b*綜合比較的體現，直觀的反應果實顏色差異。健康駿棗相比，發(fā)病駿棗L*值降低0.27%～15.13%；除1級病棗果a*值略有增加外，2級、3級、4級棗果a*值下降12.07%～32.91%；b*值下降2.26%～49.71%；色澤比h增加6.52%～45.65%；色飽和度C降低0.20%～34.06%；色差值降低0.19%～20.47%。與健康灰棗相比，發(fā)病灰棗L*值降低2.57%～12.74%；a*值除1級病棗果略有增加外，2級、3級、4級棗果a*值下降4.06%～8.28%；b*值下降5.79%～40.89%；色澤比h增加10.89%～63.28%；色飽和度C下降0.53%～18.29%；色差值降低1.43%～14.27%。

2.2 對果實內在品質的影響

紅棗感染棗果黑斑病以后，紅棗營養(yǎng)品質及口感等相關品質均會發(fā)生明顯改變(表4)。與健康‘駿棗’相比，發(fā)病‘駿棗’維生素C質量分數降低29.61%～75.99%；可溶性蛋白質質量分數增加4.05%～84.39%；游離氨基酸增加11.02%～85.040%；1～3級病果可溶性糖含量分別增加8.47%～20.34%，但4級降低33.19%；1～3級病果還原糖含量增加9.35%～27.94%，但4 級降低30.57%；可滴定酸含量降低8.77%～15.79%；1～3級病果糖酸比增加20.91%～44.21%，4級病果下降22.71%。與健康‘灰棗’相比，1～3級發(fā)病‘灰棗’中維生素C質量分數分別降低21.77%～86.31%，4級病棗果中則未檢測到維生素C；發(fā)病‘灰棗’中可溶性蛋白質質量分數增加2.77%～62.21%；游離氨基酸質量分數增加7.90%～76.32%；1～3級病果可溶性糖質量分數分別增加1.76%～16.19%，但4級降低26.91%；1～3級病果還原糖質量分數增加2.63%～33.68%，但4級降低3.62%；可滴定酸質量分數降低0%～18.52%；1～3級病果糖酸比增加5.39%～41.63%，4級病果下降24.21%。

表1 4種鏈格孢霉毒素的串聯質譜測定參數Table 1 MS/MS parameters for 4 Alternaria mycotoxins

表2 不同發(fā)病嚴重度棗果物理性狀比較Table 2 Comparison of different levels of physical propertie in Jujube fruits

2.3 不同發(fā)病程度棗果中毒素的檢測

棗果黑斑病發(fā)病后在病棗果中可以檢測到TeA、AME和AOH 3種鏈格孢菌產生的毒素，沒有檢測到ALT毒素(表5)。在檢測出的3種

表3 不同發(fā)病嚴重度棗果色度比較Table 3 Comparison of different levels of chroma in jujube fruits

表4 不同發(fā)病嚴重度棗果內在品質比較Table 4 Comparison of different levels of internal quality in jujube fruits

表5 不同發(fā)病嚴重度棗果毒素種類及數量Table 5 The type and amount of mycotoxins in different disease severity jujube fruit

毒素中，TeA毒素的檢出率最高且檢出量也最大，在發(fā)病級數為1～4級的‘駿棗’中，TeA毒素檢出量分別為6.72～217.42 mg/kg，‘灰棗’為28.58～135.40 mg/kg，在1份健康‘灰棗’檢測到TeA，可能是樣品污染所致；AOH毒素檢出率次之，其在發(fā)病‘駿棗’的檢出量分別為0.04～0.28 mg/kg，在發(fā)病‘灰棗’的檢出量為0.62～2.24 mg/kg；AME毒素在發(fā)病‘駿棗’中的檢出量為0.73～3.81 mg/kg，在‘灰棗’中的檢出量為0.68～3.06 mg/kg。3種毒素總體上呈現出隨著發(fā)病嚴重度的增加，對人體有害的鏈格孢菌毒素含量越來越高。

3 討 論

‘駿棗’和‘灰棗’作為南疆主栽品種，其具有風味獨特、營養(yǎng)價值高等優(yōu)點，深受消費者喜愛。而黑斑病近年來發(fā)生日益嚴重，棗果感染黑斑病之后嚴重影響產量和品質。本研究通過對不同發(fā)病級數的‘駿棗’和‘灰棗’果實外觀品質、內在品質、毒素種類及數量等指標進行測定分析。研究表明：發(fā)病‘駿棗’鮮果質量、硬度和質量含水量均降低，但果形指數增加；發(fā)病灰棗鮮果質量、果形指數增加，硬度和質量含水量降低。2種棗果發(fā)病后果皮L*(亮度)、C(色飽和度)和△Eab(色差)等指標均顯著降低，果實偏紅暗色。光照可以提高果皮的色度[21]，趙曉梅等[22]研究庫爾勒香梨萼端黑斑病對其品質的影響，發(fā)現同一地區(qū)感病梨L 值小于健康梨，果實硬度降低。

2種棗果發(fā)病后維生素C質量分數顯著降低，在4級‘灰棗’中未檢測到維生素C?？扇苄缘鞍踪|和游離氨基酸質量分數顯著加，其中2級棗果增加最多，可溶性蛋白質‘駿棗’增加84.4%，‘灰棗’增加62.2%，游離氨基酸‘駿棗’增加85% ‘灰棗’增加76.3%。病棗中可溶性糖和還原糖的質量分數存在顯著差異，‘駿棗’中1～3級顯著增加，4級顯著降低，‘灰棗’中1～2級顯著增加，4級顯著降低。病棗中可滴定酸含量降低，‘駿棗’糖酸比為：2級>1級>3級>0級>4級，‘灰棗’為：2級>1級>3級>0級>4級。糖酸比是風味指標的綜合體現，健康棗果小于病棗，可能與棗果成熟程度和采樣存在誤差有關。

在2種發(fā)病棗果中檢測到3種毒素，分別為TeA、AME、AOH，未檢測到ALE。在健康‘駿棗’中檢測到TeA，‘灰棗’中未檢測到毒素。陳月萌等[23]研究表明，鏈格孢霉毒素在有霉變的水果中存在較為普遍，在有霉變的蘋果中檢測到AOH和AME，在桃中檢測到ALT和AOH，但在新鮮蘋果、桃、梨中均未檢出鏈格孢毒素。而本試驗在1份健康棗果樣品中檢測到TeA，可能與采樣誤差或鏈格孢菌潛伏侵染產生毒素有關，其具體原因需要進一步研究確定。蔣黎艷等[24]研究表明，柑橘感染鏈格孢菌后各部位產生毒素含量會從發(fā)病部位擴散到健康部位累積，這與本試驗結果相一致，棗果發(fā)病越嚴重毒素含量越高，但病斑面積達到61%以上(4級病棗)毒素含量相對減少，這可能與毒素代謝有關。本試驗在病棗中檢測到TeA最大達217.42 mg/kg，AME為 3.81 mg/kg，AOH為 2.24 mg/kg，而Smith等[25]研究也發(fā)現，小鼠靜脈注射TeA鈉鹽時半致死劑量(LD50)為115～162 mg/kg。目前，暫未有棗果中鏈格孢毒素的檢測標準及含量限定，所以在鮮棗加工、采后干制儲藏等風險評估中應引起關注和重視。

4 結 論

本研究結果表明：與健康棗果相比，感病紅棗果實外形、硬度、質量含水量等物理品質均有不同程度的下降，棗果色度、色飽和度等外觀形態(tài)品質下降，與此同時棗果中的維生素C質量分數顯著降低，因鏈格孢菌代謝或病菌侵入后促進棗果加速老熟，導致游離氨基酸、可溶性糖、還原糖含量、糖酸比等指標顯著增加。在發(fā)病的‘灰棗’、‘駿棗’中均中檢測到TeA、AME和AOH 3種毒素。綜上所述，棗果黑斑病不僅僅造成減產，還可嚴重影響紅棗的外觀和內在果實品質，其致病菌鏈格孢菌產生的毒素對人體健康也有較大危害。為了減少黑斑病對紅棗產業(yè)的危害，增加果農的經濟效益，在生產上應該加強栽培管理和及時防治，減少該病害進一步擴展，同時在紅棗采收時應嚴格把住質量關，對發(fā)生黑斑病的棗果，要及時篩除掉，不能用于進一步的加工和銷售。

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7.2.12根腐?、偌訌姽芾恚３謽潴w生長健壯。多施有機肥，病樹可施入賽眾28微肥2～3公斤，使土壤透氣性良好，根系在生長良好的條件下抗病力強。盡量不用山洪等污水灌溉。②加強早期落葉病、腐爛病的防治，避免引起樹體衰弱，誘發(fā)根腐病。③對發(fā)病樹及周圍可被侵染的植株，用甲基硫菌靈800倍，硫酸銅300～400倍液灌根。連片發(fā)病時有必要挖深60厘米、寬20～30厘米的隔離溝，防止傳播蔓延。

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