由上呼吸道感染誘發(fā)的急性點(diǎn)滴型銀屑病皮損生態(tài)微生物研究

張寶蘭，王曉萌，常貴珍，張理濤

銀屑病是皮膚科常見的自身免疫性疾病，病因尚不明確，但國(guó)際公認(rèn)感染為誘發(fā)點(diǎn)滴型銀屑病的主要原因。既往研究證實(shí)，點(diǎn)滴型銀屑病與上呼吸道感染鏈球菌相關(guān)［1-2］。銀屑病患者體內(nèi)存在對(duì)鏈球菌反應(yīng)特異的T淋巴細(xì)胞［3］，可促進(jìn)細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素（IL）-2、IL-6［4］和γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）等產(chǎn)生，進(jìn)一步誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞過度增生，但并不直接影響該細(xì)胞DNA的合成［5］。這些研究表明微生物菌群的變化可能與銀屑病發(fā)病存在因果關(guān)系。皮膚在體表微生物與非特異性免疫的共同作用下建立了適應(yīng)性免疫［6］，除其本身的物理屏障外［7］，還會(huì)分泌抗菌物質(zhì)如β-防御素、抗菌肽、S100蛋白等［8］來自我保護(hù)。本研究采用16SrDNA二代測(cè)序技術(shù)明確由上呼吸道感染誘發(fā)的急性點(diǎn)滴型銀屑病患者皮損處的微生物狀態(tài)，并與正常健康體檢者體表微生物比較，以明確2種人群的差異及其組間的物種差異。

1 對(duì)象及方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年5月—9月于天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院門診確診的急性點(diǎn)滴型銀屑病患者（銀屑病組）11例，男3例，女8例，平均年齡（30.18±8.03）歲，病程多為2～4周。同期健康體檢者11例為對(duì)照組，男3例，女8例，平均年齡（30.27±8.45）歲。研究對(duì)象的一般情況統(tǒng)計(jì)見表1。納入標(biāo)準(zhǔn)：2個(gè)月內(nèi)未口服、注射或靜脈滴注任何抗生素及免疫抑制劑等藥物，1周內(nèi)未使用外用型抗生素制劑，至少24 h內(nèi)未洗澡，無(wú)其他任何疾病、皮膚創(chuàng)傷或其他相關(guān)感染。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)且患者均簽署知情同意書。

1.2 樣本收集 使用無(wú)菌棉球經(jīng)無(wú)菌水處理后在靶點(diǎn)部位加壓擦拭取材，靶部位包括四肢伸側(cè)、腰骶部、腹部，順時(shí)針方向擦拭，每個(gè)部位至少30 s，收集完畢立即置于-80℃冰箱備用。

1.3 主要試劑及器材 DNA抽提試劑盒購(gòu)自賽默飛，Phusion?的高保真酶購(gòu)自新英格蘭生物公司，膠回收試劑盒，TruSeq?DNA PCR-Free樣本制備建庫(kù)試劑盒購(gòu)自凱杰公司，生物樣本均質(zhì)器、超聲波DNA破碎儀、Illumina測(cè)序平臺(tái)來自天津諾禾致源生物信息科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 樣本DNA抽提與質(zhì)檢 樣本經(jīng)液氮冷凍后進(jìn)行研磨，使用DNA抽提試劑盒按說明書抽提DNA。取1 g瓊脂糖加入100 mL 1×TAE［TAE是由三羥甲基氨基甲烷（Tris base）、乙酸（acetic acid）和乙二胺四乙酸（EDTA）組成的緩沖液］電泳緩沖液配置瓊脂糖凝膠，加入EB染色，取5 μL的DNA抽提液及1 μL的Loading Buffer于加樣孔，電壓100 V、40 min后在紫外燈下觀察。

1.4.2 PCR擴(kuò)增與文庫(kù)構(gòu)建 取抽提液1 μL，對(duì)16SrDNA（16SrRNA為核糖體RNA的一個(gè)亞基，16SrDNA就是編碼該亞基的基因，這里單指這個(gè)基因）的V4區(qū)測(cè)序，特異引物：515 F 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；806 R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。5 μL 10×Buffer、4 μL 2.5 mmol/L dNTP、1.6 μL Taq 酶、4 μL Primers、37 μL ddH2O，配成50 μL的PCR反應(yīng)體系。樣本DNA抽提液中最低體積為1 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸130 s，循環(huán)35次；72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物利用磁珠純化兩次后，產(chǎn)物置于2 mL的離心管中。使用Qubit 2.0儀器檢測(cè)純化后的PCR質(zhì)量，質(zhì)檢通過后委托天津諾禾致源生物信息科技有限公司測(cè)序。

Tab.1 Comparison of the general situation of two groups of patients表1 銀屑病患者與健康者的一般情況比較

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 （1）物種分布情況。利用Uparse軟件（v7.0.1001）對(duì)樣本有效序列進(jìn)行聚類，并使Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)［9-10］進(jìn)行物種注釋分析，了解物種分布情況。（2）樣本復(fù)雜度分析。QIIME（Version 1.9.1）計(jì)算α多樣性指數(shù)［Observed_species、香農(nóng)-威納指數(shù)（Shannonwiener diversity index）、辛普森多樣指數(shù)（Simpson diversity index）、chao1豐富度估計(jì)量（Chao1 richness estimator）、基于豐度的覆蓋估計(jì)（Abundance-based Coverage Estimator）］，使用SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析2組樣本的物種豐富性與分布情況。（3）微生物結(jié)構(gòu)β多樣性分析。使用R軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋性曲線、物種積累箱形圖，主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）圖，觀察2組間在物種多樣性與微生物群落結(jié)構(gòu)即微生物豐度是否存在差異。構(gòu)建 UPGMA（unweighted pair-group method with arithmetic mean）樣品聚類樹。PCoA與UPGMA直觀地描述了樣本間的差異，本研究目的為銀屑病組與對(duì)照組間的差異物種，因此選擇非加權(quán)距離（unweighted unifrac）進(jìn)行分析。（4）組間差異物種。用LEfSe軟件進(jìn)行分析尋找組間差異顯著的物種［11］，為尋找相對(duì)豐度較大，起主要作用的物種，把LED值設(shè)為4。尋找2組間差異顯著的物種，主要觀察屬水平的差異，利用相對(duì)豐度（某一物種豐度與全部微生物物種豐度的比值）進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 物種分布情況 按97%的相似性進(jìn)行聚類，共得到3 427條OTU序列，對(duì)OTU序列進(jìn)行生物注釋，門、綱、目、科、屬、種水平分別發(fā)現(xiàn)40、88、157、306、784、566個(gè)種類。按豐度排名前10位的物種繪制累加圖，發(fā)現(xiàn)各樣本組成相似，主要為變形菌門（proteobacteria）、放線菌門（actinobacteria）、厚壁菌門（firmicutes），見圖1。銀屑病組與對(duì)照組中上述3種菌門的相對(duì)豐度（某一菌門豐度/所有菌門豐度）分別為42.38%和34.34%、23.95%和31.44%、25.51%和27.35%。

全部樣本中編號(hào)為ZP16的樣本藍(lán)藻菌門（cynaobacteria）未分類的葉綠體屬相對(duì)豐度水平較其他銀屑病患者高，查看一般情況記錄發(fā)現(xiàn)提供此樣本的銀屑病患者為孕婦。為保證結(jié)果客觀真實(shí)，將處于妊娠期的患者樣本ZP16（很明顯較其他樣本多出許多橙色的條帶，為藍(lán)藻菌門）以及離散度較大的樣本N5（在β多樣性分析中，可看到該樣本距離較其他樣本十分遠(yuǎn)，且在距離矩陣的數(shù)值較其他離散）剔除，銀屑病組與對(duì)照組各剩10例樣本，主要物種未發(fā)生明顯變化，見圖2。

2.2 樣本復(fù)雜度分析 根據(jù)此20例樣本繪制的物種積累箱型圖顯示，箱形圖最后趨于平緩，表明樣本量足夠，測(cè)序數(shù)據(jù)合理（圖3）。銀屑病組與對(duì)照組的稀釋性曲線顯示，2組在物種多樣性上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。同時(shí)2組α多樣性指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

2.3 微生物結(jié)構(gòu)β多樣性分析 為了分析皮膚表面菌群的完整性對(duì)樣本的分類影響，使用PCoA非加權(quán)算法計(jì)算樣本分群情況（圖5）。如果不考慮預(yù)試驗(yàn)與正式試驗(yàn)的差別，銀屑病組與對(duì)照組之間存在明顯分群現(xiàn)象，差異較為明顯，患者組樣本聚集在一起（紅色點(diǎn)），對(duì)照組樣本聚集在一起（藍(lán)色點(diǎn)），整體事件解釋率為29.1%（一般整體解釋率大于20%，即可說明樣本間關(guān)系）。這說明在皮膚菌群完整性上，銀屑病組與對(duì)照組在皮膚菌相存在不同之處。對(duì)整體樣本構(gòu)建進(jìn)化樹（圖6），可見除個(gè)別樣本可能因?yàn)閭€(gè)體特異性聚類分散外，銀屑病組與對(duì)照組大部分是分別聚集在一起，樣本聚類情況理想，說明銀屑病皮損與正常皮膚表面微生物存在一定程度的差異。結(jié)合樣本一般情況，與聚類樹結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，ZP8與其他銀屑病患者距離較遠(yuǎn)，說明微生物分類與年齡有關(guān)，ZP26、ZP27與其他患者樣本分開，說明在男女樣本中年齡相對(duì)較小，病程短的患者微生物分布接近對(duì)照組。

Fig.3 The accumulation boxplot of species圖3 物種積累箱形圖

Fig.4 The sample rarefaction curves in the two groups圖4 2組樣本稀釋性曲線

Tab.2 Comparison of alpha diversity index between the two groups表2 2組α多樣性指數(shù)的比較 （n=10，±s）

Tab.2 Comparison of alpha diversity index between the two groups表2 2組α多樣性指數(shù)的比較 （n=10，±s）

＊P＜0.05；Shannon為香農(nóng)-威納指數(shù)，simpson為辛普森多樣指數(shù)，chao1為chao1豐富度估計(jì)量，ACE為基于豐度的覆蓋估計(jì)

組別銀屑病組對(duì)照組t Observed_species 1 088.10±233.57 1 034.00±161.98 0.602 Shannon 5.81±0.89 5.56±1.18 0.547 simpson 0.92±0.05 0.89±0.13 0.725 chao1 1 340.33±240.27 1 295.93±295.19 0.369 ACE 1 373.83±239.27 1 333.86±285.88 0.339

Fig.5 PCoA analysis based on Unweighted Unifrac distance for each sample圖5 各樣本基于Unweighted Unifrac距離的PCoA分析

2.4 組間差異物種 銀屑病組與對(duì)照組在屬水平主要物種的相對(duì)豐度分別為葡萄球菌屬13.02%、15.10%，棒狀桿菌屬9.66%、15.97%，棲水菌屬8.65%、4.89%，不動(dòng)桿菌屬9.82%、2.89%，未知的葉綠體0.27%、2.04%，鏈球菌屬3.38%、2.70%，副球菌屬2.34%、2.53%，丙酸桿菌屬3.16%、5.81%。LEfSe分析（LED閾值為4）在銀屑病組與對(duì)照組間篩選出具有顯著性差異的物種為不動(dòng)桿菌屬（圖7）。2組不動(dòng)桿菌屬和未分類的葉綠體這2種物種組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

Fig.7 The LEfSe analysis cladogram and the LDA value distribution histogram圖7 LEfSe分析進(jìn)化分支圖和LDA值分布柱狀圖

Tab.3 Comparison of significant different species in acinetobacter and unidentified chloroplast between two groups表3 銀屑病組與正常對(duì)照組具有顯著差異物種不動(dòng)桿菌屬與未分類葉綠體的相對(duì)豐度比較 ［n=10，M（P25，P75）］

3 討論

目前，有關(guān)尋常型銀屑病皮損微生物的研究尚無(wú)定論。有研究顯示，銀屑病與正常健康對(duì)照者存在鏈球菌、丙酸桿菌的顯著差異［12］。另有研究顯示，棒狀桿菌、丙酸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌在銀屑病組與對(duì)照組間存在相對(duì)豐度的差異，但僅限于描述性分析［13-14］。以上研究的銀屑病對(duì)象可能因人種、病程不同或在前期治療中使用抗生素制劑而使表皮菌群重新分布有關(guān)，但都表明銀屑病發(fā)病的確與皮損微生物的變化相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用16SrDNA測(cè)序技術(shù)對(duì)樣本分析，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行α多樣性分析發(fā)現(xiàn)銀屑病組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。β多樣性分析中，對(duì)樣本聚類分析示，PCoA與UPGMA聚類樹結(jié)果多數(shù)樣本都表現(xiàn)出銀屑病組與對(duì)照組在微生物群落結(jié)構(gòu)上有所不同。LEfSe分析與秩和檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)不動(dòng)桿菌在2組中有差異。不動(dòng)桿菌屬革蘭陰性桿菌，黏附力極強(qiáng)，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較低，廣泛分布于自然界、醫(yī)院環(huán)境及健康人的皮膚表面［15］。其黏附在皮膚上成為潛在的致病菌原因之一是可以產(chǎn)生神經(jīng)氨酸酶，后者在后續(xù)細(xì)菌黏附宿主的作用中發(fā)揮作用，可形成細(xì)菌生物膜，促進(jìn)細(xì)菌微生物的定植［16］。有研究證實(shí)，皮膚表面微生物菌種的變化無(wú)論個(gè)體差異多大，均受到不動(dòng)桿菌等相對(duì)豐度變化的影響，如金黃色葡萄球菌（SA）豐度隨不動(dòng)桿菌豐度升高而升高，丙酸桿菌則與之為負(fù)相關(guān)［17］。本研究檢測(cè)到銀屑病組不動(dòng)桿菌相對(duì)豐度升高即符合這一現(xiàn)象。筆者推測(cè)在上呼吸道感染時(shí)，機(jī)體免疫力降低可導(dǎo)致不動(dòng)桿菌感染，或因鏈球菌的作用致使體表微生物尤其不動(dòng)桿菌相對(duì)豐度發(fā)生了改變。由于本研究病例均為初發(fā)或復(fù)發(fā)的患者，病程較短，體表生態(tài)微生物一般正在發(fā)展到另一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)中。研究顯示，由于微生物間的相互作用持久，而且這種微生物間相互作用可正可負(fù)，不一定處在同一種穩(wěn)定狀態(tài)［18］；這種穩(wěn)態(tài)的改變就像陸地森林生態(tài)系統(tǒng)一樣，由一個(gè)物種的變化即可導(dǎo)致其他物種的生長(zhǎng)或消亡［19］，這種變化過程需要一定時(shí)間，且相互作用會(huì)持續(xù)存在。因此，短期病程內(nèi)物種菌群還未凸顯差異，皮損區(qū)與健康皮膚微生物在α多樣性分析中沒有太大差異，但β多樣性分析圖顯示2組間微生物菌相有所差異。

具有顯著差異的不動(dòng)桿菌在微生物菌群相對(duì)穩(wěn)態(tài)變化時(shí)可起到樞紐作用。不動(dòng)桿菌介導(dǎo)致病菌如SA形成新的生物膜，而SA的毒力作用使IL-17等炎癥因子釋放增加［20］；IL-17在T細(xì)胞炎癥軸線及角質(zhì)形成、細(xì)胞過度增生的過程中起到重要作用，可導(dǎo)致銀屑病加重［21］。另外，不動(dòng)桿菌本身具有致病性，可在上呼吸道感染期接收信號(hào)，作用皮膚，激活T淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞因子，并且刺激皮膚產(chǎn)生大量抗菌肽、防御素、S100蛋白等殺菌物質(zhì)，促使銀屑病的發(fā)生，此點(diǎn)也證實(shí)了微生物穩(wěn)態(tài)對(duì)宿主的健康十分重要。

前期物種數(shù)據(jù)比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，銀屑病組中有1例藍(lán)藻菌門，葉綠體豐度較高，此患者在確診銀屑病后檢查發(fā)現(xiàn)已妊娠，因此急性點(diǎn)滴型銀屑病妊娠患者與其他患者皮損微生物物種存在差異還是偶發(fā)情況有待考證。然而，剔除已妊娠患者的樣本后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，該物種在健康對(duì)照組中較銀屑病組相對(duì)豐度較高，藍(lán)藻釋放毒素對(duì)皮膚具有刺激性，卻在健康對(duì)照組中有較高的豐度，該結(jié)果具有什么意義，目前還不明了，需要進(jìn)一步研究論證。

本次實(shí)驗(yàn)突出的最主要問題是測(cè)序。筆者將預(yù)試驗(yàn)樣本的測(cè)序結(jié)果與后期樣本的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)一分析，發(fā)現(xiàn)因測(cè)序批次的不同，樣本聚類可能會(huì)有所偏差，如PCoA分析圖，預(yù)試驗(yàn)與正式試驗(yàn)樣本分離，但僅正式試驗(yàn)部分表示2組間是存在差異的。當(dāng)下，人們關(guān)注自身衛(wèi)生的同時(shí)存在“過度清潔”，濫用抗生素的現(xiàn)象，有可能導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。若發(fā)生此類與自身免疫性相關(guān)炎癥性疾病，可考慮應(yīng)用益生菌制劑來穩(wěn)定微生物穩(wěn)態(tài)，阻斷由微生物菌群變化導(dǎo)致皮膚免疫反應(yīng)的發(fā)生，以控制炎癥的發(fā)展。

（圖1、2、6見插頁(yè)）

Fig.1 The schematic diagram of mechanical loading for a mouse圖1 小鼠機(jī)械加載圖示

Fig.2 The schematic diagram of whole body composition analyzer for a mouse圖2 小鼠體成分分析圖示

Fig.3 The body sizes of mice before being sacrificed圖3 小鼠處死前體型

Fig.4 General observation of liver tissues in three groups of mice圖4 小鼠肝臟組織肉眼觀察

Fig.5 The changes of hepatic adipocytes under light microscopy in three groups(HE staining,×200)圖5 各組小鼠肝臟脂肪細(xì)胞光鏡下觀察（HE染色，×200）

Fig.6 The changes of liver tissues under light microscopy in three groups(Oil red O staining,×200)圖6 各組小鼠肝臟組織光鏡下觀察（油紅O染色，×200）

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