胸腺五肽超分子水凝膠的制備及其免疫調(diào)節(jié)作用研究

任春華，高陽(yáng)，禇麗萍，劉鑒峰

胸腺五肽是一種人工合成的短肽，來源于含49個(gè)氨基酸的促胸腺生成素的第32～36片段，其氨基酸組成為Arg-Lys-Asp-Val-Tyr（RKDVY）。研究證實(shí)，RKDVY具有與促胸腺生成素相同的生物活性，能夠通過促進(jìn)胸腺細(xì)胞的分化以及調(diào)節(jié)成熟T細(xì)胞的功能來影響免疫系統(tǒng)［1］。作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，目前RKDVY已經(jīng)被臨床應(yīng)用于多種自身免疫性疾病的治療，包括慢性淋巴白血病、過敏性皮炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及獲得性免疫缺陷綜合征等［2-4］。但是，由于RKDVY本身較小的分子質(zhì)量以及極高的水溶性，導(dǎo)致其存在細(xì)胞膜滲透性差、半衰期短以及生物利用度低等缺陷［5-6］，從而使其臨床應(yīng)用受到較大的限制和挑戰(zhàn)。因此，對(duì)RKDVY進(jìn)行合理的結(jié)構(gòu)修飾以提高其穩(wěn)定性和生物活性具有重要的臨床價(jià)值和意義。本研究通過將RKDVY共價(jià)修飾到自組裝短肽上，以加熱-冷卻的方法制備RKDVY超分子活性水凝膠，探討其增強(qiáng)細(xì)胞攝取及免疫調(diào)節(jié)作用的效果，以期為RKDVY納米遞送系統(tǒng)的設(shè)計(jì)及改善其臨床療效提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）主要試劑：三苯基甲基氯樹脂購(gòu)自天津南開和成科技有限公司；N-9芴甲基羰基（Fmoc）氨基酸及RKDVY購(gòu)自上海吉爾生化有限公司；腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒購(gòu)自于美國(guó)Biolegend公司；小鼠巨噬細(xì)胞（RAW 264.7細(xì)胞）為本實(shí)驗(yàn)室保存。（2）主要儀器：高效液相色譜儀（HPLC，LC 2000，中國(guó)）；液質(zhì)聯(lián)用色譜儀（LC-MS，SHIMADZU 2020系統(tǒng)，日本）；透射電子顯微鏡（TEM，Tecani G2 F20系統(tǒng)，F(xiàn)EI，美國(guó)）；流變儀（AR 1500ex，TA，美國(guó)）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（VARIOSKAN FLASH，Thermo scientific，美國(guó)）；活細(xì)胞工作站（DMI6000B，Leica，德國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 自組裝多肽（NapGDFDFDYGRKDVY）合成、純化及表征分析 NapGDFDFDYGRKDVY的合成采用經(jīng)典成熟的Fmoc固相合成法，即每一個(gè)氨基酸的氨基都被Fmoc保護(hù)著。反應(yīng)過程中用堿性溶液（哌啶）脫除moc保護(hù)基，使之裸露出氨基并與已經(jīng)活化的下一個(gè)氨基酸的羧基交聯(lián)縮合，形成肽鍵。反應(yīng)過程中用苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽（O-Benzotriazole-N，N，N'，N'-tetraMethyl-uroniumhexafluorophosphate，HBTU）做為氨基酸羧基的活化劑，用N，N-二異丙基乙胺（N，N-DiisopropylethylaMine，DIEA）做催化劑。不斷重復(fù)縮合-洗滌-脫保護(hù)-洗滌的過程，使肽鏈從C端向N端依次延長(zhǎng)，待肽鏈全部完成時(shí)使用三氟乙酸將肽鏈從樹脂上切割下來。經(jīng)真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后除去多余液體，使用無(wú)水乙醚沉淀出固體多肽粗品。多肽粗品用二甲基亞砜（DiMethyl sulfoxide，DMSO）溶解后使用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行分離純化，經(jīng)冷凍干燥后得到目的多肽純品。通過液質(zhì)聯(lián)用色譜儀（LC-MS）對(duì)多肽純品的分子質(zhì)量和純度進(jìn)行表征分析。

1.2.2 FITC標(biāo)記肽的合成、純化及表征分析 異硫氰根FITC（FITC-NCS）上的異硫氰根基團(tuán)（-NCS）能夠與RKDVY的賴氨酸殘基（K）側(cè)鏈上的氨基在堿性條件下發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，生成FITC標(biāo)記肽。具體步驟：稱取適量RKDVY及NapGDFDFDYGRKDVY純品并分別溶于少量DMSO中，分別加入等摩爾量的FITC-NCS，用少量三乙胺調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液的pH值至8.0～9.0，室溫下反應(yīng)過夜。使用HPLC對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行分離純化，經(jīng)冷凍干燥后得到FITC標(biāo)記多肽純品，用LC-MS對(duì)多肽純品的分子質(zhì)量和純度進(jìn)行表征分析。

1.2.3 胸腺五肽超分子水凝膠的制備及表征分析 稱取2 mg NapGDFDFDYGRKDVY溶于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）中，并加入 2～3 mol的碳酸鈉調(diào)節(jié)pH 為7.4，最終配置成濃度為2 g/L的溶液。用移液器吸取500 μL溶液于玻璃小瓶中，在酒精燈上加熱使其充分溶解后靜置于桌面上，待其冷卻后通過瓶倒置的方法判斷其是否發(fā)生了溶液到凝膠的轉(zhuǎn)變。使用流變儀對(duì)其力學(xué)性能進(jìn)行分析測(cè)試，使用透射電鏡對(duì)其微觀形貌進(jìn)行表征分析。

1.2.4 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 將小鼠RAW 264.7細(xì)胞以2×105/孔的密度接種于24孔板中，每孔加入1 mL含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞全部貼壁且生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，分別加入含有0.02 mmol FITC標(biāo)記的游離胸腺五肽（RKDVY-FITC）及胸腺五肽納米纖維（NapGDFDFDYGRKDVY-FITC），分別孵育4 h后將孔內(nèi)液體吸出，用PBS洗3次，用新鮮配置的4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min。吸去固定液并用PBS洗3次后，再用5 mg/L的DAPI溶液染細(xì)胞5 min，吸去液體后PBS洗2次。置于熒光顯微鏡下通過觀察FITC熒光強(qiáng)度來分析RKDVY-FITC及NapGDFDFDYGRKDVY-FITC的細(xì)胞攝取情況。

1.2.5 體外免疫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn) 將小鼠RAW 264.7細(xì)胞以5×105/孔的密度接種于24孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)去除培養(yǎng)基。分別加入含有30 μmol/L的游離RKDVY及NapGDFDFDYGRKDVY的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，每組藥物設(shè)立5個(gè)平行孔并設(shè)立不含藥物的空白對(duì)照組。孵育24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液并在5 000×g轉(zhuǎn)速下離心5 min以分離出可能含有的細(xì)胞碎片。將離心得到的上清液取出后置于冰箱4℃保存。按照TNF-α試劑盒提供的使用說明，通過酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）及已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定不同溶液中TNF-α的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NapGDFDFDYGRKDVY合成、純化及表征 自組裝多肽NapGDFDFDYGRKDVY的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1A所示。固相合成1 mmol該多肽可以得到1 200 mg多肽粗品，粗品合成產(chǎn)率達(dá)到理想產(chǎn)率的85%以上；合成的100 mg NapGDFDFDYGRKDVY多肽粗品經(jīng)高效液相色譜分離純化后可以得到83 mg多肽純品，純化產(chǎn)率達(dá)到80%以上。純化后的NapGDFDFDYGRKDVY樣品用LC-MS對(duì)其純度和分子質(zhì)量進(jìn)行分析鑒定，見圖1B：質(zhì)譜結(jié)果顯示為1 421.65，與測(cè)算得到的多肽分子質(zhì)量1 420.58基本相符。色譜圖顯示純化后的多肽產(chǎn)品只有一個(gè)峰，純度達(dá)到95%以上，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的純度要求。

Fig.1 The chemical structure of NapGDFDFDYGRKDVY(A)and its LCMS spectra(B)圖1 NapGDFDFDYGRKDVY的化學(xué)結(jié)構(gòu)（A）及LC-MS譜圖（B）

2.2 FITC標(biāo)記肽的合成及表征 經(jīng)HPLC純化后，分別得到了RKDVY-FITC與NapGDFDFDYGRKDVYFITC。純化后的樣品用LC-MS對(duì)其純度和分子質(zhì)量進(jìn)行分析鑒定，見圖2A，RKDVY-FITC經(jīng)質(zhì)譜鑒定后分子質(zhì)量為1 069，與測(cè)算得到的分子質(zhì)量1 069相符，從色譜峰形可以看出其純度達(dá)到95%以上；同樣，NapGDFDFDYGRKDVY-FITC經(jīng)質(zhì)譜鑒定后分子質(zhì)量為1 809（圖2B），與測(cè)算得到的分子質(zhì)量1 809相符，純度達(dá)到95%以上，兩種標(biāo)記多肽的純度均符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

Fig.2 LC-MS spectrum of RKDVY-FITC(A)and NapGDFDFDYGRKDVY-FITC(B)圖2RKDVY-FITC（A）及NapGDFDFDYGRKDVY-FITC（B）的LC-MS譜圖

2.3 胸腺五肽超分子水凝膠的制備及表征 成膠測(cè)試結(jié)果表明，多肽分子NapGDFDFDYGRKDVY加熱冷卻后5 min內(nèi)即可形成透明的水凝膠，其最低成膠濃度為1 g/L（圖3A）；透射電鏡結(jié)果表明，形成的水凝膠內(nèi)部由密集交錯(cuò)的直徑約為20～30 nm的長(zhǎng)纖維構(gòu)成（圖3B）；流變測(cè)試結(jié)果表明，在0.1～100 rad/s的測(cè)試頻率范圍內(nèi)，該水凝膠的彈性模量G′始終大于其黏性模量G′′，表明該水凝膠具有良好的延展性（圖3C）。

Fig.3 The optical image(A),TEM image(B)and rheology property(C)of NapGDFDFDYGRKDVY supramolecular hydrogel圖3 NapGDFDFDYGRKDVY超分子水凝膠的光學(xué)照片（A）、透射電鏡照片（B）以及流變學(xué)表征（C）

2.4 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 小鼠RAW 264.7巨噬細(xì)胞對(duì)RKDVY-FITC及NapGDFDFDYGRKDVY-FITC的攝取結(jié)果，見圖4。孵育4 h后，RKDVY-FITC作用后的細(xì)胞內(nèi)能觀察到較弱的FITC熒光信號(hào)，表明游離狀態(tài)的RKDVY-FITC通過被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)少量滯留；而NapGDFDFDYGRKDVY-FITC作用后的細(xì)胞內(nèi)FITC熒光信號(hào)則明顯強(qiáng)于RKDVYFITC，表明細(xì)胞對(duì)NapGDFDFDYGRKDVY有較強(qiáng)的攝取性能。

2.5 體外免疫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn) 空白對(duì)照組、RKDVY組及NapGDFDFDYGRKDVY組作用后的細(xì)胞上清中TNF-α的濃度呈依次增加趨勢(shì)（F=644.1，P＜0.05），見圖5。

Fig.4 Cellular uptake of free thymopentin and thymopentin-containing nanofibers in RAW 264.7 cells after 4-hour incubation圖4 RAW 264.7細(xì)胞對(duì)游離胸腺五肽及胸腺五肽納米纖維在4 h后的攝取結(jié)果

Fig.5 The amount of TNF-α in RAW 264.7 cells stimulated by free thymopentin and thymopentin-containing nanofibers for 24 hours圖5 RAW 264.7細(xì)胞在游離胸腺五肽及胸腺五肽納米纖維刺激24 h后分泌TNF-α的含量

3 討論

基于多肽自組裝的超分子水凝膠由于具有容易設(shè)計(jì)合成、生產(chǎn)成本低以及生物相容性好等優(yōu)勢(shì)，近年來在藥物遞送、免疫佐劑、腫瘤治療等方面表現(xiàn)出了較大的應(yīng)用潛能［7-8］。Zhao等［9］發(fā)現(xiàn)包括活性肽在內(nèi)的藥物小分子經(jīng)共價(jià)修飾到特定的短肽上后，可自組裝形成納米纖維、納米粒子等自傳輸?shù)乃幬镞f送系統(tǒng)，從而能夠?qū)崿F(xiàn)提高藥物穩(wěn)定性和活性的目的。另外，Wang等［10-11］研究表明，疏水性五肽-NapGFFY/NapGDFDFDY具有較強(qiáng)的自組裝凝膠化性能，其本身并無(wú)免疫調(diào)節(jié)作用，但能夠作為抗原載體提高機(jī)體對(duì)特定抗原的免疫應(yīng)答。本研究設(shè)計(jì)合成的自組裝活性肽在分子結(jié)構(gòu)上主要由疏水性的NapGDFDFDY和親水性的RKDVY構(gòu)成，得到的衍生多肽-NapGDFDFDYGRKDVY能夠經(jīng)加熱-冷卻形成穩(wěn)定的水凝膠。其成膠原理為：化合物分子在加熱高溫下溶解，溫度降低后溶解度逐漸降低，當(dāng)溶解與析出達(dá)到平衡時(shí)，分子發(fā)生自組裝形成網(wǎng)狀納米纖維將水分子包裹住，從而形成肉眼可見的水凝膠。由于多肽中天然存在的L構(gòu)型氨基酸容易被活性蛋白酶快速降解［12］，因此本研究用D構(gòu)型的FFY取代L構(gòu)型的FFY，得到的自組裝多肽有望在一定程度上提高RKDVY的穩(wěn)定性和生物利用度。

RKDVY作為一種親水性短肽，具有極高的水溶性，其溶解度可達(dá)10 g/L以上。由于構(gòu)成細(xì)胞膜主要成分的磷脂雙分子層在結(jié)構(gòu)上是兩親性的，致使太親水及太疏水的活性小分子都不易穿過細(xì)胞膜屏障進(jìn)入細(xì)胞，存在細(xì)胞膜滲透性差的缺陷。Cai等［13］發(fā)現(xiàn)相較于游離小分子通過被動(dòng)擴(kuò)散的方式進(jìn)入細(xì)胞，形成納米結(jié)構(gòu)后的藥物分子則可以通過能量依賴的主動(dòng)運(yùn)輸途徑進(jìn)入細(xì)胞，從而極大提高細(xì)胞攝取率。本研究中，相較于游離RKDVY，RAW 264.7細(xì)胞對(duì)NapGDFDFDYGRKDVY的攝取量顯著增強(qiáng)，與上述文獻(xiàn)結(jié)論相一致，表明納米結(jié)構(gòu)的形成可以有效提高RKDVY的細(xì)胞攝取結(jié)果。

作為免疫調(diào)節(jié)功能的一部分，RKDVY已經(jīng)被證實(shí)能夠刺激未分化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，良好的細(xì)胞攝取滯留性能是其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其功能作用的基本保障。RKDVY由于極短的半衰期（30 s），在臨床應(yīng)用中需要不斷重復(fù)注射以維持其活性，從而給患者增加了額外的痛苦和負(fù)擔(dān)［5］。目前，已有報(bào)道采用納米制劑物理包裹的方式來提高RKDVY的半衰期和治療療效。如Yin等［14］利用修飾有凝集素的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（polylactic-co-glycolic acid，PLGA）納米粒子包載RKDVY以提高其口服給藥的效果。Zhang等［6］制備了生物可吸收的聚乳酸-聚 乙 二 醇 -聚 乳 酸［polylactide-poly（ethylene glycol）-polylactide，PLA-PEG-PLA］水凝膠，通過物理包裹的方式實(shí)現(xiàn)了對(duì)RKDVY的可控釋放。相比于物理包裹方法，本研究通過共價(jià)修飾制備得到的胸腺五肽自傳輸水凝膠，具有合成簡(jiǎn)單、可重復(fù)性好、載藥量高等優(yōu)勢(shì)。本研究體外細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相較于游離RKDVY，NapGDFDFDYGRKDVY具有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)性能，為下一步體內(nèi)研究提供了基礎(chǔ)。另外，有研究表明納米纖維經(jīng)物理打散后可通過靜脈注射的方式進(jìn)入體內(nèi)血液循環(huán)，進(jìn)一步通過增強(qiáng)的通透性和滯留性效應(yīng)（enhanced permeability and retention effect，EPR）富集到腫瘤等病灶部位［15］，因此，本研究制備的納米纖維有望極大提高RKDVY的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)效果。本研究為RKDVY結(jié)構(gòu)修飾及治療活性的提高提供了新的方法與思路。

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