基于基因芯片探索鼻咽癌的分子靶標(biāo)

劉玉智，門劍龍，李楊△

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一種鱗狀細(xì)胞癌，常見于鼻咽側(cè)壁咽鼓管口周圍［1］。作為頭頸部最常見的癌癥類型，NPC是中國(guó)南方和東南亞地區(qū)發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一［2］。放射治療和化學(xué)治療分別是早期和晚期NPC的主要治療方法。盡管早期、局部的NPC患者大多數(shù)情況下是可治愈的，但大多數(shù)患者在就診時(shí)已經(jīng)被診斷為晚期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移和局部病灶復(fù)發(fā)是晚期NPC患者預(yù)后不良的主要原因［3］。根據(jù)第七版美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）癌癥分期手冊(cè)，晚期NPC患者的5年生存率較低（Ⅲ期為62%，Ⅳ期為38%）［4］。研究發(fā)現(xiàn)病毒感染、遺傳因素和環(huán)境因素均與NPC的發(fā)病相關(guān)，但其潛在的分子機(jī)制仍不明確［5］。利用分子生物學(xué)手段研究疾病的發(fā)病機(jī)制與病理過程是當(dāng)前癌癥領(lǐng)域研究的發(fā)展趨勢(shì)；而通過表達(dá)譜芯片或轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，在mRNA水平分析基因的表達(dá)，是篩選疾病相關(guān)基因最有效的途徑。本研究利用生物信息學(xué)手段綜合分析兩套NPC表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot在mRNA水平和蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證，以期找到在NPC發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用的基因。

1 材料與方法

1.1 材料 TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega公司；PCR引物由華大基因公司合成；熒光定量PCR酶購(gòu)自諾唯贊公司；Western blot裂解液購(gòu)自天根公司；anti-CDC6、anti-CDK1購(gòu)自abcam公司；anti-CCNB1購(gòu)自LifeSpan BioSciences公司；anti-MCM2購(gòu)自CST公司、山羊抗兔二抗購(gòu)自CST公司。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理 以nasopharyngeal carcinoma為關(guān)鍵詞，在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）中篩選出2套符合條件的基因芯片數(shù)據(jù)（GSE12452和GSE13597）。數(shù)據(jù)GSE12452中包含10個(gè)鼻炎黏膜組織樣本和31個(gè)NPC樣本，數(shù)據(jù)GSE13597中包含3個(gè)對(duì)照鼻炎黏膜組織樣本和25個(gè)NPC樣本。原始數(shù)據(jù)采用R編程語言的affy包對(duì)芯片探針?biāo)缴系谋磉_(dá)值進(jìn)行背景校準(zhǔn)和Robust Multi-array Average（RMA）標(biāo)準(zhǔn)化；并且，利用芯片平臺(tái)的注釋包把探針符號(hào)轉(zhuǎn)化為基因符號(hào)，對(duì)于多個(gè)探針對(duì)應(yīng)同一個(gè)基因符號(hào)的情況，以這些探針表達(dá)值的平均值作為該基因的表達(dá)值。

1.3 基因差異表達(dá)分析 NPC組織與鼻炎黏膜組織基因表達(dá)差異采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；虻南鄬?duì)表達(dá)差異以“NPC/Control”表示，以P＜0.05并且|log2（NPC/Control）|＞1為閾值，篩選差異表達(dá)基因。

1.4 基因功能分析和信號(hào)通路分析 采用美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院（National Institutes of Health，NIH）的 DAVID（The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery）軟件平臺(tái)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析。以P＜0.05和至少富集10個(gè)基因?yàn)闂l件，篩選相關(guān)的GO（gene ontology）條目和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信號(hào)通路。

1.5 組織標(biāo)本 鼻咽癌石蠟標(biāo)本5例（NPC 1～NPC 5）來源于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理科，對(duì)照鼻炎黏膜組織新鮮標(biāo)本5例（Control 1～Control 5）來源于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院耳鼻喉科門診。全部組織標(biāo)本資料信息見表1。

1.6 總RNA提取與實(shí)時(shí)定量PCR（real-time PCR） 取50～100 mg組織樣品，利用TRIzol法提取總RNA，取2 μg總RNA經(jīng)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)成cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR引物序列見表2。PCR反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性：94℃5 min；循環(huán)反應(yīng)：（95 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s）×40；溶解曲線：95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s；95℃15 s?；蛳鄬?duì)表達(dá)水平采取2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算。

1.7 Western blot 分別選取NPC 1～4組織和Control 1～4組織，裂解液裂解組織，提取總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳。將蛋白從SDS-PAGE膠轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，利用5%脫脂奶粉封閉，然后分別加入一抗anti-CDC6、anti-CDK1、anti-MCM2、anti-CCNB1，在37℃箱孵育1 h；TBST漂洗5 min×4次；加山羊抗兔二抗（1∶1 000），37℃作用1 h；TBST 漂洗5 min×4次；暗室避光X線膠片曝光，用化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab.1 Information of tissue specimen表1 組織標(biāo)本資料信息

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因 本研究在數(shù)據(jù)GSE12452中找到1 701個(gè)差異表達(dá)基因，其中988個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，713個(gè)基因表達(dá)上調(diào)；數(shù)據(jù)GSE13597中找到869個(gè)差異表達(dá)基因，其中363個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，506個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。為了進(jìn)一步篩選在NPC發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用的基因，對(duì)兩套基因芯片數(shù)據(jù)的結(jié)果取交集，獲得了260個(gè)差異表達(dá)基因。

2.2 基因功能分析和信號(hào)通路分析 篩選出16個(gè)GO條目和4個(gè)KEGG信號(hào)通路，見表3、4。

2.3 Real-time PCR驗(yàn)證基因芯片結(jié)果 利用realtime PCR技術(shù)檢測(cè)18個(gè)細(xì)胞周期相關(guān)基因在NPC組織中和鼻炎黏膜組織中的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā) 現(xiàn) CDC6、CDK1、SKP2、TTK、CHEK1、MCM2、CDK4、MCM4、CCNB1、CDC45、MYC、CCNA2的表達(dá)水平在NPC組織中顯著上調(diào)，而MAD2L1、MCM7、CCNB2、CCND2、BUB1、BUB1B的表達(dá)水平在兩種組織中沒有明顯變化，見表5。

2.4 Western blot驗(yàn)證 Western blot檢測(cè)NPC組織中和鼻炎黏膜組織中CDC6、CDK1、MCM2和CCNB1蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDC6、CDK1、MCM2和CCNB1在NPC組織中表達(dá)顯著上調(diào)，見圖1。

Tab.2 Primer information表2 引物信息

Tab.3 GO analysis of differential expression genes表3 差異表達(dá)基因的GO分析

Tab.4 KEGG signal pathway analysis of differential expression genes表4 差異表達(dá)基因的KEGG信號(hào)通路分析

3 討論

病毒感染、遺傳因素和環(huán)境因素均與NPC的發(fā)病過程有關(guān)。例如，EB病毒編碼的LMP1蛋白可以通過抑制LKB1-AMPK通路促進(jìn)NPC上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化［6］。研究發(fā)現(xiàn)，基因LOC344967啟動(dòng)子區(qū)的單核苷酸多態(tài)性（32G/A）可以在其轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域形成一個(gè)AP-1蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而導(dǎo)致LOC344967的異常表達(dá)，并參與NPC的惡性轉(zhuǎn)化進(jìn)程［7］。此外，吸煙可以促進(jìn)EB病毒的復(fù)制，并誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Zta和Rta的異常表達(dá)，從而促進(jìn)NPC的發(fā)生發(fā)展［8］。因此，在分子水平上研究NPC的發(fā)病機(jī)制，找到NPC的潛在治療靶點(diǎn)尤為重要。

本研究在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出2套關(guān)于NPC的基因芯片數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)分析，找到了18個(gè)與細(xì)胞周期相關(guān)的基因在NPC組織中表達(dá)異常升高。這些基因中部分已經(jīng)被廣泛研究。例如，SKP2是F-box蛋白家族成員，該蛋白是cyclin A-CDK2 S期激酶的必要元件。SKP2在S期可以特異性地識(shí)別磷酸化的CDKN1B，并且可以與SKP1相互作用，參與細(xì)胞周期的調(diào)控［9-10］。Wang等［11］發(fā)現(xiàn)SKP2在NPC組織中表達(dá)顯著升高，而且與不良預(yù)后相關(guān)。敲低SKP2的表達(dá)可以抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞衰老，抑制細(xì)胞干性和自我更新能力。Feng等［12］發(fā)現(xiàn)，用姜黃素處理NPC細(xì)胞系CNE1和CNE2，可以通過上調(diào)miR-7的表達(dá)，進(jìn)而抑制其靶蛋白SKP2，并最終促進(jìn)NPC細(xì)胞周期停滯，抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。CHEK1基因編碼的蛋白屬于Ser/Thr蛋白激酶家族，該蛋白可以整合來自ATM和ATR（涉及DNA損傷反應(yīng)的兩種細(xì)胞周期蛋白）的信號(hào)，參與DNA損傷引起的細(xì)胞周期停滯。此外，CHEK1還可以通過誘導(dǎo)CDC25A蛋白磷酸酶的磷酸化，參與雙鏈DNA斷裂引起的細(xì)胞周期延滯［13］。Liu等［14］發(fā)現(xiàn)，用EA6（一種草藥提取物）處理NPC細(xì)胞系CNE1，可以使其細(xì)胞周期停滯在G2/M期。這種EA6誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯作用可以在CHEK1敲低后被逆轉(zhuǎn)，說明CHEK1可能是EA6抑制NPC細(xì)胞增殖的一個(gè)新的分子靶標(biāo)。Mak等［15］報(bào)道，用CHEK1的小分子抑制劑（AZD7762）和WEE1的小分子抑制劑（MK-1775）同時(shí)處理NPC細(xì)胞，可以誘導(dǎo)NPC細(xì)胞的有絲分裂障礙，進(jìn)一步說明CHEK1可能是NPC治療的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。CDK4基因編碼的蛋白屬于Ser/Thr蛋白激酶家族，是蛋白激酶復(fù)合物的催化亞單位。CDK4的活性由調(diào)節(jié)亞基D型細(xì)胞周期蛋白和CDK抑制劑p16（INK4a）調(diào)控，而且CDK4的生物學(xué)活性僅局限于G1/S期，對(duì)細(xì)胞周期G1期進(jìn)展至關(guān)重要［16］。Chen等［17］注意到CDK4可以通過破壞細(xì)胞周期來調(diào)控腫瘤的進(jìn)程，而且CDK4的高表達(dá)是NPC不良預(yù)后的潛在標(biāo)志物。Jiang等［18］注意到CDK4蛋白可以同時(shí)在細(xì)胞核與細(xì)胞漿中表達(dá)，而CDK4的核表達(dá)水平越高的患者（尤其是T1～2期、N2～3期以及臨床分期為Ⅲ期或Ⅳ期的NPC患者），其生存期越短。此外，抑制CDK4在NPC細(xì)胞中的表達(dá)可以觀察到癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞周期進(jìn)程受到抑制，與此同時(shí)，NPC細(xì)胞中CCND1、CDK6和E2F1的表達(dá)受到抑制，p21的表達(dá)上調(diào)［19］。

Tab.5 Real-time PCR analysis of mRNA expression levels of 18 genes in two kinds of tissues表5 Real-time PCR檢測(cè)18個(gè)基因在2種組織中的mRNA表達(dá)水平 （n=5，±s）

Tab.5 Real-time PCR analysis of mRNA expression levels of 18 genes in two kinds of tissues表5 Real-time PCR檢測(cè)18個(gè)基因在2種組織中的mRNA表達(dá)水平 （n=5，±s）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01

TTK 0.92±0.13 2.29±0.13 7.580＊＊1.55±0.22 1.29±0.33 0.672組別鼻炎黏膜組織NPC組織t鼻炎黏膜組織NPC組織t CDC6 0.95±0.15 3.98±0.44 6.491＊＊0.94±0.07 3.18±0.09 19.450＊＊CDK1 1.08±0.09 2.36±0.22 5.276＊＊0.89±0.12 2.38±0.34 4.086＊＊SKP2 1.17±0.07 3.69±0.78 3.203＊0.91±0.04 3.85±0.57 5.107＊＊CHEK1 1.03±0.06 2.94±0.60 3.180＊1.39±0.15 1.23±0.38 0.388 MCM2 0.83±0.05 2.89±0.54 3.755＊＊1.36±0.09 1.33±0.08 0.282 CDK4 0.89±0.04 2.41±0.18 8.056＊＊1.40±0.12 2.22±0.22 0.997 MCM4 1.13±0.13 3.01±0.60 3.028＊1.31±0.15 1.25±0.08 0.379 CCNB1 0.98±0.06 2.88±0.45 4.174＊＊1.39±0.17 2.90±0.90 1.634

Fig.1 Western blot analysis of protein expression levels of CDC6,CDK1,MCM2 and CCNB1 in two kinds of tissues圖1 Western blot檢測(cè)NPC組織和鼻炎黏膜組織中CDC6、CDK1、MCM2和CCNB1蛋白的表達(dá)水平

為了更進(jìn)一步研究這些基因與NPC發(fā)病機(jī)制的關(guān)系，筆者利用real-time PCR在mRNA水平上檢測(cè)18個(gè)細(xì)胞周期相關(guān)基因在NPC組織中與鼻炎黏膜組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示CDC6、CDK1、SKP2、TTK、CHEK1、MCM2、CDK4、MCM4、CCNB1、CDC45、MYC、CCNA2的表達(dá)水平在NPC組織中顯著上調(diào)。本研究在芯片和real-timePCR中同樣觀察到SKP2、CHEK1和CDK4這3個(gè)基因在NPC組織中的高表達(dá)，與前述研究一致［11,15,17］，說明本研究數(shù)據(jù)解讀和定量PCR的可靠性。由于SKP2［11］、TTK［27569188］、CHEK1［15］、CDK4［17］、MCM4［25973099］、CDC45［23584157］、MYC［28586063］、CCNA2［17689134］等基因已經(jīng)被廣泛研究，最終筆者選取CDC6、CDK1、MCM2和CCNB1作為研究對(duì)象，進(jìn)一步利用Western blot在蛋白水平上檢測(cè)其在NPC組織中與對(duì)照鼻炎黏膜組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CDC6、CDK1、MCM2和CCNB1蛋白在NPC組織中均有不同程度的表達(dá)上調(diào)，提示這4個(gè)基因可能是NPC發(fā)生發(fā)展的潛在致病因子或治療靶點(diǎn)。

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