葶藶子雌激素樣活性篩選及其作用機(jī)制研究

韓杜菀，鄭曉珂，趙瑩瑩，陳 燕， 楊勝利，孫亞萍，克迎迎

(河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

植物雌激素是天然存在的一種植物成分，因其與雌激素受體(estrogen receptor，ER)特異性結(jié)合的不同，可產(chǎn)生雌激素或抗雌激素雙向活性[1]。相對于合成的雌激素，植物雌激素因具有不良反應(yīng)小、安全性高、生物活性廣泛等特點(diǎn)而備受關(guān)注[2]。

葶藶子為十字花科植物播娘蒿Descurainiasophia(L) Webb. ex Prantl.的干燥成熟種子，稱“南葶藶子”；或者獨(dú)行菜LepidiumapetalumWilld.的干燥成熟種子，稱“北葶藶子”。葶藶子記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被歸為下品，藥味辛、苦；性大寒；歸肺、膀胱經(jīng)。文獻(xiàn)報道，其主要有止咳平喘[3]、利尿[4]、強(qiáng)心[5]等作用。但是葶藶子是否具有雌激素樣活性，卻未見報道。本研究篩選了葶藶子水提物(SemenDescurainiaeaqueous extracts，SD-ae)的雌激素樣活性，并研究其有效雌激素樣化學(xué)拆分組分及其作用機(jī)制，同時對比人工合成的雌激素和葶藶子雌激素作用分子機(jī)制的異同，為植物雌激素類新藥的研發(fā)及臨床用藥提供理論支撐。

1 材料

1.1藥物葶藶子購自河南省鄭州市中藥材市場，經(jīng)過河南中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)科董誠明教授鑒定為十字花科植物播娘蒿DescurainiaSophia(L)Webb ex Prantl.的干燥成熟種子。稱取葶藶子(SD)1 kg包煎，10倍量水煎煮3次，每次1 h，濾液過濾合并，減壓干燥濃縮即得SD-ae，提取率為11.4%。SD經(jīng)水蒸氣蒸餾得到揮發(fā)油拆分組分(SD-VO)，提取率為0.04%；SD用石油醚萃取得到石油醚組分[脂肪油拆分組分(SD-FO)]，提取率為27.17%；SD-ae濃縮后，上DiaionHP-20柱，依次用水、20%乙醇、80%乙醇洗脫，即得到低聚糖拆分組分(SD-ae-Oli)、多糖拆分組分(SD-ae-Pol)、黃酮苷拆分組分(SD-ae-FG)、黃酮苷元拆分組分(SD-ae-FA)，提取率分別為5.12%、2.61%、0.98%、0.60%。陽性藥戊酸雌二醇(estradiol valerate，EV，拜耳醫(yī)藥)，將其制成蒸餾水混懸液，按0.33 mg·kg-1·d-1給藥。

1.2試劑Steady-Glo穩(wěn)定熒光素酶檢測系統(tǒng)試劑盒(Cat.No.253B)、閃亮裂解緩沖液(Cat.No.E266A)均購自Promega公司；超純RNA提取試劑盒(Cat.No.CW0597)、Ultra SYBR Mixture(Cat.No.CW0956)均購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；第一鏈cDNA合成試劑盒(Cat.No.k1622)、無酚紅高糖DMEM(Cat.No.SH30211.15)購自Thermo公司；胎牛血清(Cat.No.SH30068.03)購自Hyclone公司；17β-雌二醇(17β-estrogen，17β-E2，Cat.No.E2758)、雌激素受體拮抗劑Fulvestrant(ICI182,780，Cat.No.14409) 購自Sigma公司。

1.3儀器Mastercycler ep realplex實時熒光定量PCR儀(Eppendorf公司)；iMarkTM型酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)；紫外分光光度計(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.4實驗動物、細(xì)胞株及質(zhì)粒SPF級♀昆明種小鼠，剛斷乳(21 d)，體質(zhì)量9～12 g，購自河南省實驗動物中心，許可證號：SCXK(豫)2010-0002。人乳腺癌細(xì)胞MCF-7購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；人胚胎腎細(xì)胞株(HEK293)源于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。pCXN2-hERα、pCXN2-hERβ、pβgal-Control、pERE-TAL-luc由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所葉棋濃博士惠贈。

2 方法

2.1小鼠子宮增重實驗小鼠稱重后，以均重隨機(jī)分組，給藥7 d。正常組按0.02 mL·g-1·d-1灌胃蒸餾水；陽性組隔日灌胃戊酸雌二醇(0.33 mg·kg-1·d-1)。首先對葶藶子水提物進(jìn)行雌激素樣活性篩選，實驗分組為:正常組(NC)、陽性組(EV)、葶藶子低劑量組(2015版藥典規(guī)定人用藥量的20倍量×提取率)、葶藶子高劑量組(2015版藥典規(guī)定人用藥量的40倍量×提取率)，按0.02 mL·g-1·d-1灌胃。然后對葶藶子各化學(xué)拆分組分進(jìn)行雌激素樣活性篩選，實驗分組為：正常組(NC)、陽性組(EV)、黃酮苷拆分組分組(SD-ae-FG)、黃酮苷元拆分組分組(SD-ae-FA)、低聚糖拆分組分組(SD-ae-Oli)、多糖拆分組分組(SD-ae-Pol)、脂肪油拆分組分組(SD-FO)、揮發(fā)油拆分組分組(SD-VO)、葶藶子低劑量組(SD-ae-L，葶藶子各拆分組分按人用藥量的20倍量×提取率計算，劑量為0.02 mL·g-1·d-1)。最后一次給藥后，禁食12 h后稱重，脫頸椎處死小鼠，即刻摘取子宮稱重，計算子宮系數(shù)：子宮系數(shù)=子宮濕重×(體質(zhì)量)-1×100%。實驗獨(dú)立平行重復(fù)3次。

2.2E-SCREEN實驗無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基加入5%經(jīng)活性炭-葡聚糖處理的胎牛血清，用于培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞。培養(yǎng)1周以消除細(xì)胞中內(nèi)源性雌激素的干擾，待細(xì)胞長至約90%，調(diào)整細(xì)胞密度為6×107·L-1，以每孔200 μL接種于96孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，給藥培養(yǎng)48 h，MTT法檢測各藥物對細(xì)胞活力的影響，結(jié)果以平均吸光度(A)值和增殖率(proliferation rate, PR)表示，實驗獨(dú)立重復(fù)3次。17β-E2為陽性藥，按照說明書要求稀釋至所需實驗濃度。

2.3ICI182,780干預(yù)阻斷實驗實驗方法同“2.2”，其中給藥培養(yǎng)時，ICI182,780干預(yù)阻斷組在給藥前2 h加入ICI182,780(10-8mol·L-1)。

2.4雌激素反應(yīng)元件(estrogenresponsealements，ERE)調(diào)控的報告基因在HEK293細(xì)胞中的瞬時表達(dá)檢測調(diào)整HEK293細(xì)胞濃度為3.2×108·L-1，每孔0.5 mL細(xì)胞懸液接種于24孔板，在含10%的胎牛血清(經(jīng)活性炭-葡聚糖處理)無酚紅DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至90%時，把已構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pERE-TAL-Luc、pβgal-Control、pCXN2-hERα、pCXN2-hERβ以陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法共同轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞，6 h后給藥干預(yù)，24 h后計算標(biāo)準(zhǔn)化Luc活性。

2.5實時熒光定量PCR檢測ERα、ERβ、孕激素受體(progesteronereceptor，PR)mRNA的表達(dá)小鼠子宮保存于-80 ℃冰箱中，按說明書以超純RNA提取試劑盒操作，提取的RNA用瓊脂糖凝膠電泳法檢測完整性。參照第一鏈cDNA合成試劑盒說明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。選取β-actin作為內(nèi)參基因，ERα、ERβ、β-actin基因序列參照文獻(xiàn)[6]。PR基因由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，引物序列：PR引物上游5′-CATGGTCCTTGGAGGTCGTA-3′，下游5′-CTCTCGTTAGGAAGGCCCAC-3′。參照Ultra SYBR Mixture 試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火/延伸1 min，40個循環(huán)。熔解曲線分析：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s。按照2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1小鼠子宮增重實驗結(jié)果

3.1.1SD-ae對小鼠子宮系數(shù)的影響 如Tab 1所示，與正常組相比，SD-ae低、高劑量組與陽性藥戊酸雌二醇均能明顯增加小鼠子宮系數(shù)(P<0.01或P<0.05) 。說明SD-ae在體內(nèi)具有雌激素樣作用。

Tab 1 Effect of SD-ae on uterus index of

*P<0.05,**P<0.01vsNC

3.1.2葶藶子各化學(xué)拆分組分對小鼠子宮系數(shù)的影響 如Tab 2所示，與NC組相比，SD-ae-Oli組、SD-ae-Pol組、EV組小鼠子宮系數(shù)明顯升高(P<0.01，P<0.05)，說明SD-ae-Oli和SD-ae-Pol是發(fā)揮雌激素樣活性的有效化學(xué)拆分組分。SD-ae-FG、SD-ae-FA、SD-FO、SD-VO組與NC組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

Tab 2 Effect of chemical separation components of SD on uterus index of immature female n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsNC

3.2MCF-7細(xì)胞增殖實驗結(jié)果

3.2.1SD-ae對MCF-7細(xì)胞的促增殖作用 與NC組相比，SD-ae濃度為10-7、2×10-8、4×10-9、8×10-10mg·L-1時，對MCF-7細(xì)胞有明顯的促增殖作用(P<0.01)。說明SD-ae在體外具有雌激素樣作用。見Tab 3。

Tab 3 Effect of SD-ae on proliferation of

**P<0.01vsNC

3.2.2SD-ae-Oli對MCF-7細(xì)胞的促增殖作用 SD-ae-Oli(2×10-3、10-3mg·L-1)能明顯促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖(P<0.01)，說明SD-ae-Oli在體外具有雌激素樣活性(Tab 4)。

Tab 4 Effect of SD-ae-Oli on proliferation of

**P<0.01vsNC

3.2.3SD-ae-Pol對MCF-7細(xì)胞促增殖作用 SD-ae-Pol(2×10-3、10-3mg·L-1)能明顯促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖(P<0.01)，說明SD-ae-Pol在體外具有雌激素樣活性(Tab 5)。

Tab 5 Effect of SD-ae-Pol on proliferation of

**P<0.01vsNC

3.3ICI182,780干預(yù)阻斷實驗結(jié)果

3.3.1ICI182,780對SD-ae促M(fèi)CF-7細(xì)胞增殖的影響 與NC組相比，SD-ae各劑量組均可明顯促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖(P<0.01)。當(dāng)SD-ae與ICI182,780共同處理MCF-7細(xì)胞時，SD-ae的促增殖作用消失，與NC組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Tab 6)。說明SD-ae對MCF-7細(xì)胞的促增殖作用是通過雌激素受體途徑發(fā)揮的。

3.3.2ICI182,780對SD-ae-Oli促M(fèi)CF-7細(xì)胞增殖的影響 當(dāng)加入ICI182,780后，SD-ae-Oli對MCF-7細(xì)胞的促增殖作用消失(Tab 7)，說明SD-ae-Oli的促增殖作用是通過雌激素受體途徑發(fā)揮的。

Tab 6 Effects of ICI182, 780 on proliferation of

**P<0.01vsNC

Tab 7 Effects of ICI182, 780 on proliferation of MCF-7 cells in SD-ae-Oli n=6)

**P<0.01vsNC

3.3.3ICI182,780對SD-ae-Pol促M(fèi)CF-7細(xì)胞增殖的影響 當(dāng)加入ICI182,780后，SD-ae-Pol對MCF-7細(xì)胞的促增殖作用消失(Tab 8)，說明SD-ae-Pol的促增殖作用是通過雌激素受體途徑發(fā)揮的。

Tab 8 Effects of ICI182, 780 on proliferation of MCF-7 cells in SD-ae-Pol n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsNC

3.4ERE調(diào)控的報告基因在HEK293細(xì)胞中的瞬時表達(dá)檢測結(jié)果

3.4.1SD-ae對ERE調(diào)控的報告基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用 由ERα介導(dǎo)時，SD-ae各組標(biāo)準(zhǔn)化Luc活性與正常組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；由ERβ介導(dǎo)時，SD-ae(5×10-5mg·L-1)標(biāo)準(zhǔn)化Luc活性明顯高于正常組(P<0.01)，見Tab 9。說明SD-ae可經(jīng)過ERβ途徑激活基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮雌激素樣作用。

Tab 9 Inductive effects of SD-ae on ERE-regulated reporter gene of transient expression when mediated by ERα, n=3)

**P<0.01vsNC

3.4.2SD-ae-Oli對ERE調(diào)控的報告基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用 如Tab 10所示，由ERα介導(dǎo)時，SD-ae-Oli各濃度標(biāo)準(zhǔn)化Luc活性與NC組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明SD-ae-Oli不是通過ERα發(fā)揮雌激素樣作用的。由ERβ介導(dǎo)時，SD-ae-Oli(2×10-3mg·L-1)標(biāo)準(zhǔn)化Luc活性明顯高于NC(P<0.05)，說明SD-ae-Oli是通過ERβ途徑激活基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮雌激素樣作用。

Tab 10 Inductive effects of SD-ae-Oli on ERE-regulated reporter gene of transient expression when mediated by ERα, n=3)

*P<0.05,**P<0.01vsNC

3.4.3SD-ae-Pol對ERE調(diào)控的報告基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用 如Tab 11所示，由ERα介導(dǎo)時，SD-ae-Pol各濃度標(biāo)準(zhǔn)化Luc活性與NC組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明SD-ae-Pol不是通過ERα發(fā)揮雌激素樣作用的。由ERβ介導(dǎo)時，SD-ae-Pol(2×10-3、10-3mg·L-1)標(biāo)準(zhǔn)化Luc活性明顯高于NC組(P<0.01)。說明SD-ae-Pol是通過ERβ途徑激活基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮雌激素樣作用。

3.5SD-ae-L對ERαmRNA、ERβmRNA、PRmRNA表達(dá)的影響Fig 1的實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，與NC組相比，EV可明顯降低子宮中ERα mRNA、ERβ mRNA的表達(dá)(P<0.01)，明顯升高孕激素受體PR mRNA表達(dá)(P<0.01)，SD-ae-L能明顯升高子宮中ERβ mRNA的表達(dá)(P<0.01)。

Tab 11 Inductive effects of SD-ae-Pol on ERE-regulated reporter gene of transient expression when

**P<0.01vsNC

Fig 1 Effects of SD-ae-L on ERα mRNA, ERβ mRNA,

**P<0.01vsNC

4 討論

靶器官子宮中富含ER，具有雌激素活性的化合物與ER結(jié)合后，會使子宮增重[7]。本研究采用小鼠子宮增重實驗對SD-ae及其化學(xué)拆分組分進(jìn)行體內(nèi)雌激素樣活性的篩選。研究結(jié)果表明，SD-ae能夠明顯增加小鼠子宮系數(shù)，首次發(fā)現(xiàn)SD-ae在體內(nèi)具有雌激素樣作用。為了進(jìn)一步明確SD-ae中的有效組分，本研究將SD-ae按照組分間互不交叉的原則，進(jìn)行化學(xué)拆分[8]，并采用小鼠子宮增重實驗，篩選有效雌激素樣活性組分。研究發(fā)現(xiàn)，SD-ae-Oli和SD-ae-Pol可明顯增加小鼠子宮系數(shù)，在體內(nèi)具有雌激素樣作用，推測葶藶子的雌激素樣活性成分可能是低聚糖和多糖成分。動物實驗選用天然雌二醇的戊酸鹽EV作為陽性藥，其在體內(nèi)代謝后生成天然雌激素17β-雌二醇，與內(nèi)源性雌激素結(jié)構(gòu)相同。其作為一種外源性雌激素，因具有易吸收、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)，優(yōu)于人工合成的雌激素己烯雌酚[9]。

E-SCREEN實驗是目前國內(nèi)外較為常用的體外檢測雌激素的方法，因高靈敏度、高效率、快速簡便，廣泛應(yīng)用于體外雌激素活性篩選[10]。實驗常選用ER陽性細(xì)胞株MCF-7和T47D細(xì)胞，雌激素樣活性物質(zhì)通過與ER結(jié)合，可使ER陽性細(xì)胞增殖。因此，本研究選用MCF-7細(xì)胞增殖實驗對SD-ae及其化學(xué)拆分組分進(jìn)行體外雌激素樣活性評價，并在ER拮抗劑ICI182,780干預(yù)下，初步探討其雌激素樣活性是否通過ER途徑而發(fā)揮。結(jié)果表明，SD-ae、SD-ae-Oli和SD-ae-Pol都能明顯促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖，說明其在體外具有雌激素樣活性，且ICI182,780能分別阻斷SD-ae、SD-ae-Oli、SD-ae-Pol對MCF-7細(xì)胞的增殖作用，表明SD-ae、SD-ae-Oli、SD-ae-Pol的雌激素樣活性是通過ER途徑發(fā)揮的。

經(jīng)典的ER有兩種亞型，即ERα、ERβ[11]。為了進(jìn)一步研究SD-ae、SD-ae-Oli、SD-ae-Pol通過何種受體發(fā)揮雌激素樣作用，本研究以pERE-TAL-Luc構(gòu)建報告基因載體，同時和ERα、ERβ表達(dá)載體轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞中，以Luc活性來評判SD-ae、SD-ae-Oli、SD-ae-Pol對ERα和ERβ親和力的大小。結(jié)果顯示，SD-ae、SD-ae-Oli、SD-ae-Pol與ERβ的親和力大于ERα，說明其可通過ERβ介導(dǎo)激活基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮雌激素樣作用。這也再次印證了植物雌激素似乎對ERβ具有更高的親和力，與文獻(xiàn)報道一致[12]。

植物雌激素和雌激素對下游靶基因轉(zhuǎn)錄具有激活或抑制的作用。因此，本研究通過實時熒光定量PCR技術(shù)對小鼠子宮中ER、PR mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測，探討EV與SD-ae在小鼠體內(nèi)發(fā)揮雌激素樣作用的分子機(jī)制的異同。本研究中，EV能明顯降低小鼠子宮ERα、ERβ mRNA的表達(dá)，且能夠明顯增加PR mRNA的表達(dá)；SD-ae能明顯升高小鼠子宮中ERβ mRNA的表達(dá)，但對ERα、PR mRNA的表達(dá)卻沒有明顯影響。這就表明雌激素和植物雌激素通過不同的作用靶點(diǎn)使子宮中的靶蛋白含量增加，從而使小鼠子宮增重。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)SD-ae具有雌激素樣活性，其有效拆分組分為SD-ae-Oli和SD-ae-Pol，為進(jìn)一步研究葶藶子中雌激素樣活性成分奠定了基礎(chǔ)。人工合成的雌激素副作用大，而植物雌激素不良反應(yīng)少、安全性高，這可能與其作用機(jī)制的不同有關(guān)，本研究證實，SD-ae通過ERβ介導(dǎo)激活基因轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮雌激素樣作用，這與人工雌激素有很大不同。這一結(jié)果為開發(fā)安全、有效的雌激素類新藥提供了理論依據(jù)。

(致謝: 本文實驗是在河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥活性成分篩選實驗室完成，謹(jǐn)此致謝。)

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