短期玉米秸稈還田對(duì)冷涼地區(qū)土壤 真菌多樣性的影響

薩如拉，楊恒山，高聚林，張麗娟，張玉芹，范秀艷，李純燕

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 通遼 028000； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 包頭 014199)

秸稈還田能提高土壤養(yǎng)分含量、調(diào)節(jié)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性，微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)在一定程度上反映農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)基本情況。前人主要對(duì)森林[1-8]、退化草場(chǎng)[8-9]、荒漠草原[10-13]、保護(hù)地[14-17]、茶園[18]、果園[19-20]、旱田[21-24]、稻田[25-27]、藥用植物根際[28-29]、花卉根際[30-31]、煙草[32]、生物土壤結(jié)皮[33]、露天礦區(qū)復(fù)墾[34]、重金屬污染[35-37]和農(nóng)藥殘留[38]等土壤真菌結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行了研究，耕作方式有連作大豆[21]、黑土區(qū)玉米連作[23]、溝壟覆膜連作馬鈴薯[24]、稻田壟作免耕[25]、秸稈還田的稻田[27]和秸稈還田植煙田[32]等。研究方法為PCR-DGGE技術(shù)[2，9，17-18，32，34]，微生物純培養(yǎng)、鏡檢形態(tài)鑒定[13-16，22-23，25，28-30，38]，構(gòu)建真菌ITS克隆文庫(kù)[4-5]，構(gòu)建真菌18SrDNA文庫(kù)[11，33]，結(jié)合Biolog微平板分析-變性梯度凝膠電泳(DGGE)方法[21]和真菌ITS序列高通量測(cè)序[1，3，6，24]等；多數(shù)研究者采用形態(tài)學(xué)鑒定和18S rDNA-PCR-DGGE分子鑒定法。前人對(duì)冷涼地區(qū)秸稈還田的連作玉米田真菌多樣性研究較少，雖然18S rDNA-PCR-DGGE方法較純培養(yǎng)方法有很大進(jìn)步，但有局限性；DGGE僅反映有限優(yōu)勢(shì)微生物類群，在很大程度上極可能低估土壤微生物物種組成并高估其豐度；而高通量測(cè)序能較為全面和準(zhǔn)確反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[39]。為探索冷涼地區(qū)秸稈還田土壤真菌多樣性，于2014～2015年在冷涼地區(qū)設(shè)置秸稈粉碎深翻和旋耕還田試驗(yàn)，以常規(guī)耕作秸稈不還田為對(duì)照，運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)分析土壤真菌多樣性，描述短期玉米秸稈還田對(duì)冷涼地區(qū)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響。以期為正確評(píng)價(jià)冷涼地區(qū)秸稈還田生態(tài)效益提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)點(diǎn)地處西遼河平原(43°36′N、122°22′E)，海拔178 m，年均氣溫6.8℃，年均降水量399.1 mm，無(wú)霜凍期150 d左右，≥10℃年活動(dòng)積溫3 200℃。試驗(yàn)于2014—2015年在內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行，供試土壤為灰色草甸土，耕層土壤有機(jī)質(zhì)24.6 g·kg-1、全氮0.96 g·kg-1、堿解氮58.78 mg·kg-1、速效磷10.81 mg·kg-1、速效鉀79.92 mg·kg-1，土壤pH值8.3。試驗(yàn)地為連作多年的玉米地。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)3個(gè)處理，常規(guī)耕作秸稈不還田(CK)、秸稈深翻還田(SF)和秸稈旋耕還田(XG)，春播前玉米秸稈全量粉碎還田，旋耕還田采用旋耕機(jī)實(shí)施，作業(yè)深度15 cm，深翻方式為人工深翻，深度30 cm。分0～10、10～20 cm和20～30 cm土層，9個(gè)樣；標(biāo)記為CK1、CK2、CK3、SF1、SF2、SF3、XG1、XG2和XG3。

1.3 土壤樣品采集

春玉米吐絲期各處理分0～10、10～20、20～30 cm土層，“S”形15點(diǎn)混合取樣，混合均勻后，按四分法取部分土樣裝入已經(jīng)滅菌的無(wú)菌袋中。一部分鮮樣進(jìn)行土壤可培養(yǎng)真菌數(shù)量測(cè)定，一部分放入-70℃冷凍備用。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 土壤真菌計(jì)數(shù) 采用稀釋平板法，在改良馬丁氏培養(yǎng)基上分離土壤真菌并計(jì)數(shù)，每克干土中真菌數(shù)量(CFU·g-1)=(同一稀釋度樣品菌落數(shù)×稀釋倍數(shù))/(1-土壤含水率)；SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析。

1.4.2 高通量測(cè)序

(1)土壤微生物DNA提取 采用改良SDS高鹽緩沖液抽提法。

(2)DNA測(cè)序與數(shù)據(jù)處理過(guò)濾 對(duì)真菌ITS1區(qū)進(jìn)行測(cè)序，引物為ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和ITS1M：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′；對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，將拼接得到的序列進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，并去除嵌合體，得到高質(zhì)量的Tags序列。

(3)微生物組成和豐度計(jì)測(cè) 在相似性97%水平上對(duì)序列進(jìn)行聚類，以測(cè)序所有序列數(shù)的0.005%作為閾值過(guò)濾操縱分類單元(OTU)。物種注釋RDP Classifier置信度閾值為 0.8；鄰接法分析系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

(4)微生物多樣性計(jì)算 采用Mothur version v.1.30分析alpha指數(shù)。

2 結(jié)果分析

2.1 真菌數(shù)量差異分析

由表1可知，吐絲期SF和XG均與CK有極顯著差異，SF與XG間差異不顯著。各土層中真菌數(shù)為SF>XG>CK。

表1 不同秸稈還田方式對(duì)耕層土壤 真菌數(shù)量的影響/(105·g-1)

注：數(shù)據(jù)后不同字母表示同土層不同處理的差異顯著性(P<0.05)。

Note: Different letters indicate the significant difference between treatments of the same soil layer(P<0.05).

2.2 OTU分析

測(cè)序共獲得1800630對(duì)Reads，雙端Reads拼接、過(guò)濾后共產(chǎn)生1 681 670條Clean tags，獲得1062個(gè)OTU。表2可知，OTU數(shù)隨土層下移逐漸下降，CK1的OTU數(shù)最多，CK3的OTU數(shù)最少；同土層OTU為CK1>XG1>SF1，XG2>SF2>CK2，SF3>XG3>CK3；由圖1可知，3個(gè)處理共有OTU為630，SF與XG共有OTU為761，SF與CK共有OTU為740，XG與CK共有OTU為703；CK特有OTU為52，SF特有OTU為27，XG特有OTU為39。

表2 樣品OTU個(gè)數(shù)分布圖

圖1組間OTU Venn圖

Fig.1 OTU Venn map of each group

2.3 土壤真菌種類分析

由圖2可知，30%～70%為未知真菌；共屬4門，17綱，36目，81屬。在門分類水平上屬6個(gè)類群，包括：子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)和接合菌門(Zygomycota)。除XG2，子囊菌門為優(yōu)勢(shì)種群，其次為擔(dān)子菌門；各處理優(yōu)勢(shì)種群所占比例不同，0～20 cm處差異不顯著，CK3中子囊菌門相對(duì)豐度最高，XG2中擔(dān)子菌門相對(duì)豐度最高。在屬水平上，優(yōu)勢(shì)類群(相對(duì)豐度>1.0%)有14個(gè)，其中馬拉色氏霉菌屬(Malassezia)、被孢霉屬(Mortierella)、葡萄孢屬(Botrytis)、Pseudogymnoascus、隱球菌屬(Cryptococcus)為各樣品共有；Lachnella為CK1特有，曲霉屬為CK3特有，Ophiosphaerella為秸稈還田深層土壤特有；金孢子菌屬、Volvariella、Conocybe和青霉屬存在于CK和秸稈還田深層土壤中；CK1和CK2中優(yōu)勢(shì)屬有馬拉色氏霉菌屬、被孢霉屬和葡萄孢屬；而CK3中葡萄孢屬為優(yōu)勢(shì)屬；XG中被孢霉屬相對(duì)豐度比CK高，但馬拉色氏霉菌屬豐度較低，葡萄孢屬豐度更低；XG1和XG2中耐冷酵母是優(yōu)勢(shì)菌，其相對(duì)豐度比其它樣品高；SF中葡萄孢屬、Lachnella、曲霉屬和角擔(dān)菌屬菌種均未出現(xiàn)；SF1優(yōu)勢(shì)菌屬為被孢霉屬和耐冷酵母屬；SF2出現(xiàn)了Ophiosphaerella，其優(yōu)勢(shì)菌屬為被孢霉屬；SF3優(yōu)勢(shì)菌為葡萄孢屬。真菌物種數(shù)為CK1>SF1>XG1，CK2>XG2>SF2，XG3>SF3>CK3；CK真菌種類數(shù)多，但類群豐度均不高。

注：Others為豐度低于1%的部分，Unknown為未得到分類學(xué)注釋的OTU。
Note: Others were less than 1% of the abundance, Unknown were OTU that has not been annotated in taxonomy.

圖2在門(A)及屬(B)水平上土壤真菌種類和相對(duì)豐度

Fig.2 Soil fungal species and relative abundance at the level of the phylum (A) and the genus (B)

2.4 不同土層真菌分布

隨土層下移子囊菌門相對(duì)豐度逐漸上升，接合菌門相對(duì)豐度在CK中逐漸上升，而SF中有下降趨勢(shì)。隨土層下移XG中馬拉色氏霉菌屬、葡萄孢屬、Pseudogymnoascus和隱球菌屬相對(duì)豐度逐漸上升；SF中馬拉色氏霉菌屬相對(duì)豐度變化不明顯，而被孢霉屬和耐冷酵母相對(duì)豐度逐漸下降，葡萄孢屬和Conocybe相對(duì)豐度逐漸上升。真菌種類數(shù)為CK2>CK1>CK3，XG3>XG2>XG1，SF3>SF2>SF1；CK中隨土層下移馬拉色氏霉菌屬相對(duì)豐度減少；由圖3可知，馬拉色氏霉菌屬、被孢霉屬、Lachnella、Pseudogymnoascus、Volvariella和耐冷酵母菌屬與土壤深度呈負(fù)相關(guān)，葡萄孢屬、金孢子菌屬、隱球菌屬、Conocybe、青霉屬、曲霉屬、角擔(dān)菌屬和Ophiosphaerella與土壤深度呈正相關(guān)；土壤深度對(duì)金孢子菌屬、Lachnella、Ophiosphaerella和耐冷酵母菌屬的影響程度較大。XG1與SF1、XG2與SF2之間距離較近，說(shuō)明這兩對(duì)樣品微生物群落差異較小。

圖3 屬水平樣品間物種多樣性RDA分析Fig.3 RDA analysis of species diversity in the genus level

2.5 土壤真菌多樣性分析

由表3可知，各處理真菌群落豐度及多樣性存在差異，表征真菌豐富度的ChaoI指數(shù)和均勻度指數(shù)Ace為CK1>XG1>SF1，XG2>SF2>CK2，SF3>XG3>CK3；SF和XG 10～30 cm真菌優(yōu)勢(shì)類群豐度均增加，Shannon指數(shù)為CK1>SF1>XG1，CK2>SF2>XG2，XG3>CK3>SF3；秸稈還田后0～10 cm土層真菌群落豐富和多樣性均降低。

2.6 土壤真菌相似性分析

由圖4可知，各樣品聚為2簇，CK2、SF3和CK3真菌群落相似性大，聚為一簇；SF1和XG1與CK1先聚為第一小簇，SF2與XG2聚為第二小簇，再與XG3聚為另一大簇。

表3 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)

圖4 樣品UPGMA聚類樹(shù)Fig.4 UPGMA cluster tree of samples

3 討 論

真菌是有機(jī)物質(zhì)分解和土壤生物量的主要組成部分，在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中起著重要作用[24]；其區(qū)系結(jié)構(gòu)與多樣性是表征土壤肥力和健康的重要指標(biāo)。玉米秸稈還田改變環(huán)境因素，從而影響土壤真菌群落特性及生長(zhǎng)。本研究中，秸稈旋耕和深翻還田均能增加土壤可培養(yǎng)真菌數(shù)量；秸稈還田對(duì)10～30 cm土壤的影響尤為顯著，有可能是秸稈腐熟可降解成葡萄糖和木糖等，與拔節(jié)期追施的尿素共同有助于優(yōu)勢(shì)真菌群的增加[19]。郭梨錦等[27]研究表明，短期秸稈還田只提高表層土壤(0～5 cm)微生物群落的生物量，但不影響微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性，這與本研究結(jié)果不一致，這可能是研究對(duì)象和生態(tài)環(huán)境的不同導(dǎo)致。

4 結(jié) 論

冷涼地區(qū)玉米秸稈還田顯著提高土壤可培養(yǎng)真菌數(shù)量。秸稈還田后土壤真菌優(yōu)勢(shì)菌屬發(fā)生變化；秸稈深翻還田和旋耕還田0～20 cm土層真菌群落差異較小。秸稈深翻和旋耕還田均可增加10～30 cm土層真菌群落豐度。

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