999感冒靈顆粒抗呼吸道合胞病毒的初步研究

孫 濤，程茂勝，袁曉玲，張曉燕，黃升海

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)屬于副黏病毒科肺炎病毒屬，是一種有包膜非節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，主要有3種包膜糖蛋白(F、G、SH)，其中G蛋白為吸附蛋白，可以與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，F(xiàn)蛋白為融合蛋白，感染細(xì)胞后會引起細(xì)胞融合病變，RSV感染主要是由這兩種蛋白引起的。有研究[1-4]表明，呼吸道合胞病毒是世界范圍內(nèi)嬰幼兒下呼吸道感染最常見的病毒病原體。70%的1歲兒童感染過RSV，2歲兒童幾乎均被RSV感染過，早產(chǎn)兒及其患有先天性心臟病的兒童更容易引起RSV相關(guān)的下呼吸道感染，特別是支氣管炎和細(xì)支氣管炎，是1歲以下兒童住院的最主要原因[5]。此外研究[5-6]表明，嬰幼兒感染RSV后不僅可以導(dǎo)致急性疾病，還可導(dǎo)致長期的不良后果，如誘發(fā)氣道高反應(yīng)性、誘發(fā)哮喘兒童出現(xiàn)反復(fù)的喘鳴等，導(dǎo)致病毒血癥，嚴(yán)重者會發(fā)生心力衰竭導(dǎo)致死亡。RSV感染的病理機(jī)制尚不明確，目前為止仍無有效的藥物和疫苗接種，曾有以福爾馬林滅活的RSV作為疫苗預(yù)防接種嬰幼兒，發(fā)現(xiàn)自然感染RSV后與其未接種疫苗的感染者相比會出現(xiàn)更為嚴(yán)重的支氣管痙攣性肺炎，并會造成死亡。臨床上治療RSV感染多采用抗病毒和抗炎聯(lián)合治療[7]。

999感冒靈顆粒主要成分為三叉苦、金盞銀盤、野菊花、崗梅、咖啡因、對乙酰氨基酚、馬來酸氯、苯那敏、薄荷油，輔料為蔗糖粉。主要功能是解熱鎮(zhèn)痛，用于感冒引起的頭痛、發(fā)熱、鼻塞、流涕、咽痛等。目前已有文獻(xiàn)[8-10]報(bào)道，野菊花和薄荷油均具有抗呼吸道合胞病毒的功效，而999感冒靈作為一種感冒藥對呼吸道合胞病毒的抗性作用卻未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此開展對999感冒靈顆粒的抗病毒研究，可為臨床有效地預(yù)防和治療RSV疾病提供一定的幫助。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及病毒HEp-2細(xì)胞(人喉癌上皮細(xì)胞)，呼吸道合胞病毒為國際標(biāo)準(zhǔn)Long株，以上均由安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室保存。

1.2主要試劑新生牛血清(杭州四季青公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；Hyclone胰酶(北京利維寧生物科技有限公司)；CCK-8試劑盒(500T；海門碧云天生物技術(shù)研所)；利巴韋林注射液(1 ml ∶0.1 g；濟(jì)寧辰欣藥業(yè)股份有限公司)；999感冒靈顆粒(每袋重10 g；華潤三九醫(yī)藥股份有限公司)；各種規(guī)格的培養(yǎng)板(美國Falcon公司)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的復(fù)蘇：從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管，立刻放入37 ℃水中進(jìn)行水浴，使其在1 min內(nèi)融化。然后將凍存管中的細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中加細(xì)胞培養(yǎng)液置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。8 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。傳代：打開已經(jīng)長成單層細(xì)胞的培養(yǎng)皿，用移液槍將廢液棄去；然后再用移液槍吸取1～2 ml滅菌的PBS清洗細(xì)胞表面的死細(xì)胞以及殘留血清，一般清洗2～3次；向培養(yǎng)皿中加入0.25%的胰酶1 ml進(jìn)行消化，在倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓、細(xì)胞間質(zhì)變大，立刻終止消化。加入4 ml細(xì)胞培養(yǎng)液，用移液器反復(fù)吹打細(xì)胞成為細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中4 ℃、1 000 r/min離心5 min。輕輕吸取上清后用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，把細(xì)胞一分為二轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中。將接種好的細(xì)胞置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4實(shí)驗(yàn)分組、病毒復(fù)蘇與病毒感染量的測定實(shí)驗(yàn)分組為:① 直接滅活組；② 抑制吸附組；③ 抑制增殖組；④ 阻斷作用組。病毒的復(fù)蘇：從-80 ℃冰箱取出病毒管，用細(xì)水流沖洗管壁，使其緩慢融化。4 ℃、1 000 r/min離心5 min，將病毒上清液接種至已長成單層的HEp-2細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行增殖，然后放在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h。之后加入細(xì)胞維持液再進(jìn)行培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長情況以及病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)?！?”為無細(xì)胞病變，細(xì)胞病變<25%為“+”，細(xì)胞病變25%～50%為“”，細(xì)胞病變50%～75%為“”，細(xì)胞病變>75%為“”。等細(xì)胞病變效應(yīng)達(dá)到“”時(shí)，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集上清液分裝后放入-80 ℃冰箱備用。病毒滴度測定：將增殖后的病毒用維持液進(jìn)行10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13不同濃度梯度稀釋，依次接種于已長成單層的96孔HEp-2細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，每孔0.1 ml。37 ℃吸附2 h后，棄上清液，加維持液后放在37 ℃、5 % CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀察細(xì)胞病變，按Reed-Muench法計(jì)算病毒的半數(shù)感染量(tissue culture infective dose，TCID50)。

1.5999感冒靈顆粒的毒性測定將999感冒靈顆粒用含DMEM培養(yǎng)液稀釋成400 mg/ml,再用含3%血清的培養(yǎng)液進(jìn)行1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512、1/1 024倍比稀釋，將稀釋后的藥液加到已長成單層的HEp-2細(xì)胞96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl，每個(gè)濃度梯度做4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)正常HEp-2 細(xì)胞作為空白對照組。重復(fù)3次試驗(yàn)。然后將96孔板放在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，并且每天觀察細(xì)胞病變。3 d后計(jì)算細(xì)胞不出現(xiàn)病變(999感冒靈顆粒對HEp-2細(xì)胞的毒性作用)的最高稀釋倍數(shù)，即為其最大無毒濃度(maximum non-toxic concentration，TC0)，即對HEp-2細(xì)胞的最大無毒濃度，再按Reed-muench 法計(jì)算其50%毒性濃度(median toxic concentration，TC50)。

1.6陽性對照利巴韋林注射液的細(xì)胞毒性測定將利巴韋林注射劑用含DMEM培養(yǎng)液初步稀釋，再用含3%血清的培養(yǎng)液進(jìn)行1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512、1/1 024倍比稀釋，將稀釋后的藥液加到已長成單層的HEp-2細(xì)胞96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl，每個(gè)濃度梯度做4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)正常HEp-2 細(xì)胞作為空白對照組。重復(fù)3次試驗(yàn)。然后將96孔板放在37 ℃、5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，并且每天觀察細(xì)胞病變。3 d后計(jì)算細(xì)胞不出現(xiàn)病變(利巴韋林注射液對HEp-2細(xì)胞的毒性作用)的最高稀釋倍數(shù)，即為其TC0，即對HEp-2細(xì)胞的最大無毒濃度，再按Reed-muench 法計(jì)算其TC50。

1.7對病毒復(fù)制增殖的抑制作用將已長成單層的HEp-2 細(xì)胞96孔培養(yǎng)板吸棄培養(yǎng)液，用PBS 洗3次，加入100 TCID50的RSV病毒液，100 μl/孔，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h，使病毒進(jìn)入細(xì)胞；棄去多余病毒液，用PBS洗2次，洗去游離的病毒，再加入999感冒靈顆粒溶液從TC0濃度開始作連續(xù)2 倍系列稀釋的6個(gè)濃度稀釋液(維持液稀釋)，100 μl/孔，每個(gè)濃度均重復(fù)4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照組和病毒對照組以及陽性對照組(陽性對照組濃度為利巴韋林最大無毒劑量)。重復(fù)3次試驗(yàn)。當(dāng)病毒對照組病變達(dá)到75%以上時(shí)，每孔加入10 μl的CCK-8試劑，培養(yǎng)4 h以后測定波長在450 nm的吸光度(absorbance，A)值。計(jì)算藥物的抑制百分率，評價(jià)抗病毒效果。根據(jù)各組之平均吸光度值，計(jì)算抑制百分率，再按Reed-Muench法計(jì)算藥物半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)，求出治療指數(shù)(therapeutic index，TI)。

抑制百分率(%)=(實(shí)驗(yàn)組平均A值-病毒對照組平均A值)/(細(xì)胞對照組平均A值-病毒對照組平均A值)×100%，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。TI=TC50/IC50進(jìn)行計(jì)算。

1.8對病毒的直接滅活以TC0濃度開始作連續(xù)2倍系列稀釋的8個(gè)濃度稀釋液(維持液稀釋)，分別與100 TCID50的RSV病毒液等量混合，37 ℃作用2 h，然后接種到已長成單層的HEp-2細(xì)胞96孔培養(yǎng)板中，放在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中吸附2 h，棄上清液，加維持液200 μl。同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照組和病毒對照組以及陽性對照組(陽性對照組濃度為利巴韋林最大無毒劑量)。其余同1.6。

1.9抑制病毒的吸附以TC0濃度開始作連續(xù)2倍系列稀釋的8個(gè)濃度稀釋液(維持液稀釋)，分別與100 TCID50的RSV病毒液等量混合，直接接種到已長成單層的HEp-2細(xì)胞96孔培養(yǎng)板中，放在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中吸附2 h，棄上清液，加維持液200 μl。同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照組和病毒對照組以及陽性對照組(陽性對照組濃度為利巴韋林最大無毒劑量)。其余同1.6。

1.10對病毒的阻斷作用以TC0濃度開始作連續(xù)2倍系列稀釋的8個(gè)濃度稀釋液(維持液稀釋)，加入到已長成單層的HEp-2 細(xì)胞96孔培養(yǎng)板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，用PBS洗2次，然后加入100 TCID50的RSV病毒液，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h，棄上清液，加維持液200 μl。同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照組和病毒對照組以及陽性對照組(陽性對照組濃度為利巴韋林最大無毒劑量)。其余同1.6。以上每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)立4 ～ 8個(gè)復(fù)孔進(jìn)行。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Reed - Muench法計(jì)算藥物TC50和IC50及TI，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1RSV病毒半數(shù)感染量的滴定病毒TCID50的滴定結(jié)果為：1×10-6.23/0.1 ml。

2.2999感冒靈顆粒的細(xì)胞毒性測定按Reed-muench 法計(jì)算，可得知TC50=2-4；TC0=2-5。因?yàn)?99感冒靈顆粒原液濃度為400 mg/ml，所以TC50=25 mg/ml；TC0=12.5 mg/ml。利巴韋林的細(xì)胞毒性測定TC50=93.1 mg/ml，TC0=5.0 mg/ml。

2.3999感冒靈顆粒在HEp-2細(xì)胞的抗呼吸道合胞病毒實(shí)驗(yàn)

2.3.1對病毒復(fù)制增殖的抑制作用 RSV感染HEp-2細(xì)胞出現(xiàn)CPE的特征主要為細(xì)胞圓縮、腫脹以及細(xì)胞之間的融合。在藥物的TC0的范圍內(nèi)，藥物濃度的越高，細(xì)胞出現(xiàn)CPE的程度會越低。病毒的抑制百分率與藥物的濃度具有量效關(guān)系且與病毒對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.56、17.71、6.98、7.99、5.51、13.21，P<0.01)，見表1。其對呼吸道合胞病毒的IC50為4.42 mg/ml,TI為5.66；利巴韋林陽性對照組IC50為1.30 mg/ml，TI為71.6(F=54.44，P<0.01)，見圖1。說明999感冒靈顆粒對RSV的復(fù)制增殖有抑制作用。

2.3.2對病毒的直接滅活 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，999感冒靈對病毒有直接滅活的作用，主要表現(xiàn)在隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞的CPE特征隨之降低，細(xì)胞的存活率也隨之上升且與病毒對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.32、8.63、5.56、6.71、13.1、9.33，P<0.01)，見表1。其對呼吸道合胞病毒的IC50為7.43 mg/ml,TI為3.36；利巴韋林陽性對照組IC50為1.12 mg/ml，TI為83.1(F=7.51，P<0.05)。見圖2。

2.3.3抑制病毒的吸附 結(jié)果可見，在TC0以下的不同濃度實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞均出現(xiàn)腫脹、圓縮以及細(xì)胞融合等典型的CPE癥狀。細(xì)胞的抑制百分率與細(xì)胞對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.31，P>0.05)，利巴韋林陽性對照組IC50為1.53 mg/ml，TI為60.1(F=239.46，P<0.01)，見表1。所以999感冒靈顆粒并沒有抑制病毒吸附的作用。

2.3.4對病毒的阻斷作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，999感冒靈顆粒對病毒并無阻斷作用，對呼吸道合胞病毒的感染無預(yù)防作用。具體表現(xiàn)在不同藥物濃度下細(xì)胞均出現(xiàn)典型的CPE癥狀，CCK-8結(jié)果顯示細(xì)胞的抑制百分率與病毒對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.12，P>0.05)，利巴韋林陽性對照組IC50為1.44 mg/ml，TI為64.7(F=103.23，P<0.01)，見表1。

圖1 CCK-8法測定不同濃度藥物抑制病毒增殖作用

圖2 CCK-8法測定不同濃度藥物直接滅活病毒結(jié)果

組別濃度(mg/ml)CPE細(xì)胞對照-病毒對照 陽性對照+實(shí)驗(yàn)組 抑制增殖12.50+??##6.250 ??##3.125 ??##1.563 ?##0.782 ??##0.391 ?## 直接滅活12.50 ?##6.250 ?##3.125 ?##1.563 ?##0.782 ?##0.391 ?## 抑制吸附12.50 6.250 3.125 1.563 0.782 0.391 阻斷作用12.50 6.250 3.125 1.563 0.782 0.391

與陽性對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與病毒對照組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

在臨床疾病譜中，由病毒引起的感染性疾病比例高達(dá)75%以上，一直威脅人類的生命與健康，其中最常見的是呼吸道合胞病毒引起的感染[11]。但目前并沒有行之有效的抗RSV治療手段，唯一用于治療的是廣譜抗病毒藥物利巴韋林，由于其具有很強(qiáng)的毒副作用，所以僅限于病情嚴(yán)重和高危患兒，在臨床實(shí)踐運(yùn)用中效果并不理想。人類單克隆抗體-palivizumab(Synagis)和靜脈用免疫球蛋白己經(jīng)注冊使用，療效較好，但是其一個(gè)周期治療所需費(fèi)用很高，不能普遍應(yīng)用于臨床。因此，尋找有效廉價(jià)的防治RSV感染的藥物意義非凡。

國內(nèi)已有相關(guān)文獻(xiàn)[12]報(bào)道證實(shí)，野菊花、薄荷油等天然藥物成分具有一定的抗RSV和其他種類病毒的作用與功效。而本實(shí)驗(yàn)所使用的999感冒靈作為一種常見的感冒藥其主要有效成分為野菊花、薄荷油，但其對RSV的抗性作用卻未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此開展對999感冒靈顆粒的抗病毒研究，為其可能的預(yù)防RSV感染提供了一定的依據(jù)。本文設(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對999感冒靈顆?？筊SV作用進(jìn)行了體外研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，999感冒靈顆粒對RSV也有明顯抑制作用。這將可能為開發(fā)高效、特異的防治RSV感染的藥物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為臨床處方的配伍提供線索。同時(shí)國外文獻(xiàn)[12-13]也有相關(guān)的報(bào)道，野菊花對流行性感冒病毒、乙型肝炎病毒等有一定殺滅作用，其也被應(yīng)用對治療各種瘟疫、癰腫病證，療效確切，也能與其他西藥抗生素藥物結(jié)合使用。近年來，國內(nèi)外學(xué)者運(yùn)用現(xiàn)代理論知識進(jìn)行了全面分析和研究，作了大量的藥理臨床工作，從科學(xué)的角度證實(shí)了野菊花具有抗病毒、廣譜抗菌、抗腫瘤等多種藥理作用[14]。

熊建文 等[15]研究表明，CCK-8法檢測細(xì)胞活性，最佳的檢測時(shí)間是在加入CCK-8試劑細(xì)胞培養(yǎng)4 h后，最佳檢測波長為450 nm。與傳統(tǒng)的MTT比色法檢測細(xì)胞活性相比，CCK-8法具有操作更加簡便，結(jié)果更加準(zhǔn)確可反復(fù)進(jìn)行測量等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)的MTT比色法在檢測細(xì)胞活性時(shí)，需要加入裂解液(如DMSO)溶解沉積在細(xì)胞中的甲臜晶體，在此過程中可能會出現(xiàn)晶體顆粒不完全溶解以及在吸取上清夜過程中容易吸走部分細(xì)胞，而且加入的裂解液對A值也有一定的影響，所以在吸光度測定時(shí)誤差很大，重復(fù)性欠佳。而CCK-8法中出現(xiàn)的甲臜晶體是水溶性的，并不需要加入裂解液，也不用吸取上清液，不會造成細(xì)胞的流失。而且可以進(jìn)行反復(fù)測量，重復(fù)性好，數(shù)據(jù)穩(wěn)定，科學(xué)性強(qiáng)。所以本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法測定細(xì)胞的吸光度值。

本文初步研究了999感冒靈顆粒抗RSV的作用效果，TC50為25 mg/ml，最大無毒濃度TC0為12.5 mg/ml。CCK-8結(jié)果表明999感冒靈顆粒對RSV有直接滅活的作用，并且隨著藥物濃度的升高，滅活的效果也增強(qiáng)。說明999感冒靈顆?？赡軐SV有直接殺滅的作用，或者有可能藥物中的某種化合物與病毒的某一特異性受體結(jié)合，從而使病毒直接滅活，并與陽性對照組作用效果相似。同樣地，999感冒靈顆粒對抑制病毒在細(xì)胞中的復(fù)制增殖有顯著效果，并在12.5 mg/ml濃度下與陽性對照組相比有著相似作用效果，其作用機(jī)制可能是藥物進(jìn)入細(xì)胞抑制了相關(guān)蛋白的生物合成或者抑制了核酸的復(fù)制。但999感冒靈顆粒對病毒的進(jìn)入并無阻斷作用，也沒有抑制病毒吸附的作用。說明999感冒靈顆粒并不能阻止病毒侵入細(xì)胞與吸附細(xì)胞表面，所以并沒有預(yù)防的作用。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)999感冒靈顆粒體外具有抗RSV感染的作用，而且安全性亦較高。但具體是什么成分具有抗病毒作用還需進(jìn)一步探究。后期也將采用動物模型對999感冒靈的抗病毒作用以及作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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