過表達miR-218增強食管鱗狀細胞癌對順鉑敏感性

黃云龍，張仁泉，方炎鑫，姚 龍，吳開明

食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是東亞發(fā)展中國家較為常見的惡性腫瘤[1]，盡管各種治療策略已經(jīng)明顯改善并提高患者的預后及生存率，但ESCC仍然是最具侵襲性和預后較差的惡性腫瘤之一，其5年總生存率低于15%。以鉑類為基礎的化療仍是食管癌患者姑息性治療的常見治療方案，而部分患者對鉑類藥物的敏感性較差。因此，迫切需要一種新的治療靶點，可以應用于判定抗癌藥物敏感性高的細胞或機體，也可以用于提高存在藥物抵抗性個體對藥物的敏感性。微小RNAs(micro ribonucleic acids，miRNAs or miRs)是一類內(nèi)生的、長度約為20～24個核苷酸的單非編碼小分子RNA，可通過調(diào)節(jié)基因的表達影響腫瘤發(fā)生發(fā)展。最近，越來越多的研究[2]表明miRNAs藥物抵抗中發(fā)揮重要作用，已有研究[3-5]證實在有鉑類藥物抵抗的細胞中miR-218呈低表達，而恢復miR-218的表達可以增加鉑類化療藥的敏感性。因此揭示miR-218在鉑類耐藥的食管鱗癌細胞中的生物學特性和miR-218異常表達在調(diào)控食管鱗癌細胞對鉑類耐藥的分子機制顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1材料與試劑食管鱗癌細胞Eca109購自上海生物科學院細胞庫；順鉑購自美國Sigma公司；RPMI-1640及胎牛血清購自美國Gibco公司；CCK8 試劑盒購自上海碧云天公司；AnnexinV-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；RNA提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司；實時熒光定量試劑盒購自南京Vazyme公司；相關蛋白抗體購自英國Abcam公司。本實驗中涉及的基因及引物序列見表1。

表1 基因和引物序列

1.2方法

1.2.1細胞系及培養(yǎng) 食管鱗癌細胞Eca109采用含10%胎牛血清，1%青鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基，耐藥細胞Eca109/CisR用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基， 在37 ℃恒溫，含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)期狀態(tài)良好的細胞用于實驗。

1.2.2耐藥株構(gòu)建 采用遞增藥物濃度、間歇沖擊作用的方法構(gòu)建耐藥細胞株[6]。取狀態(tài)良好并處于對數(shù)生長期的Eca109 細胞，從濃度為0.5 μmol/L 的 Cisplatin 開始培養(yǎng)，24 h后更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，觀察到細胞恢復正常生長，再次用初始濃度的 Cisplatin 培養(yǎng)基培養(yǎng) Eca109 細胞，發(fā)現(xiàn)有細胞死亡后換為新鮮的完全培養(yǎng)基，細胞穩(wěn)定生長并傳代3次，測定半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。隨后提高 Eca109濃度反復作用直至細胞能在10 μmol/L Cisplatin 的培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)并連續(xù)傳代3次，最后測 Eca109 的 Cisplatin 耐藥細胞株 IC50為(18.68±0.94) μmol/L，命名為 ECA109/CisR。

1.2.3RNA提取 定量即時聚合酶鏈鎖反應(quantitative real time polymerase chain reaction ，qRT-PCR) 采用TRIzol方法提取細胞總RNA,并使用微量分光光度計測濃度及純度(一般要求OD260/OD280為1.8～2.2之間)。按照Vazyme實時熒光定量試劑盒說明書具體步驟，進行反轉(zhuǎn)錄、擴增，同時以U6作為內(nèi)參進行擴增，miR-218的表達量為其與該樣本中內(nèi)參U6的相對表達量，由公式Folds=2-ΔΔCt檢測ECA109/ECA109-CisR、miRNA-218 mimics/ Negative Control miR-218的差異性表達。

1.2.4細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的細胞進行試驗，6孔板細胞數(shù)：3×105/孔；96孔板細胞數(shù)3×103個/孔分別均為種于每孔，培養(yǎng)12 h至細胞密度達80%，應用轉(zhuǎn)染試劑siRNA-Mate(上海吉瑪公司)進行瞬時轉(zhuǎn)染法并參照產(chǎn)品說明書，將miRNA-218 mimics、Negative Control(NC)(終濃度50 nmol/L)與 Si-Mate按比例加入每孔。轉(zhuǎn)染miRNA-218 mimics作為實驗組，Negative Control(NC)作為對照組。

1.2.5CCK8法檢測細胞增殖 將實驗分為兩組：miRNA-218 mimics轉(zhuǎn)染組，NC對照組。每組在轉(zhuǎn)染后不同時間點0、24、48、72 h分別取3個重復孔進行實驗。棄原培養(yǎng)基后加入含有10% CCK-8的完全培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標儀檢測各孔450 nm波長處的吸光度(optical density，OD)值。同樣的方法作瞬時轉(zhuǎn)染，24 h后，給予兩組細胞不同終濃度順鉑處理，每個濃度梯度分別設置3個重復孔，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，同樣方法檢測各孔450 nm波長的OD值。以上每組實驗操作重復3次，并取重復孔平均值。細胞抑制率=(0 h藥物濃度OD值-任意h藥物濃度OD值)/(0 h藥物濃度OD值)×100%，IC50值是指導致細胞抑制率為50%時的藥物濃度。

1.2.6流式細胞儀檢測細胞凋亡 取6孔板作Eca109/CisR細胞瞬時轉(zhuǎn)染，miRNA-218 mimics為轉(zhuǎn)染組，NC為對照組，48 h后，參照AnnexinV-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒說明書，收集細胞(注意保留培養(yǎng)基)，500 r/min低速離心5 min后，用預制冷的1×PBS洗滌兩遍，加入300 μl 的1×Binding Buffer 制成細胞懸液；加入5 μl的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min，上機前5 min再加入5 μl的PI染色并補加200 μl的1×Binding Buffer混勻，上機檢測凋亡比率。同樣的方法做細胞轉(zhuǎn)染，48 h后，兩組加入含有終濃度5 μmol/L順鉑的完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱48 h，上機檢測凋亡比率。

1.2.7Western blot檢測細胞中蛋白的表達 收集經(jīng)不同方法處理的Eca109/CisR細胞，分為四組：NC組，miRNA-218 mimic組，NC+ Cisplatin組， miRNA-218 mimics+ Cisplatin組。用RIPA/PMSF(100 ∶1)冰上裂解30 min，14 000 r/min 離心15 min，收集上清液用 BCA法測定總蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度計算上樣體積，30 μg蛋白樣品在10% SDS-PAGE 凝膠中電泳分離、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST 10 min/次搖床洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫搖床孵育1 h，TBST 10 min/次搖床洗膜3 次后顯色。

1.3統(tǒng)計學處理采用 SPSS 18.0 軟件進行分析，組間比較采用t檢驗分析。以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1Eca109/CisR耐藥株及耐藥測定CCK8法檢測結(jié)果證實，Eca109、Eca109/CisR細胞在不同Cisplatin濃度處理后，與食管鱗癌細胞Eca109比較，Eca109/CisR細胞增殖受明顯抑制；根據(jù)公式測算兩組細胞IC50值分別為(4.9±1.04) μmol/L和(18.88±0.94) μmol/L，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1)。

2.2miRNA-218在細胞株Eca109和Eca109/CisR細胞中表達實時熒光定量PCR法檢測結(jié)果顯示：與Eca109細胞比較，Eca109/CisR細胞中miRNA-218表達下調(diào)；與NC組比較，miR-218 mimics組Eca109/CisR細胞中miRNA-218表達明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)。

2.3CCK8檢測不同方式處理后耐藥細胞Eca109/CisR增殖活性轉(zhuǎn)染miRNA-218 mimics，CCK8法檢測兩組不同時段(0、24、48和72 h)Eca109/CisR細胞增殖能力，miRNA-218抑制Eca109/CisR細胞增殖能力；轉(zhuǎn)染miRNA-218 mimics 24 h后， 用不同終濃度的Cisplatin(0、2.5、5、10、20和40 μmol/L)處理，與NC組相比，miRNA-218 mimics組Eca109/CisR 的OD值明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3)。

圖1 CCK8法檢測Cisplatin對Eca109和Eca109/CisR細胞的增殖抑制效應

A：CCK8測兩組細胞增殖能力；B：兩組細胞IC50值；與食管鱗癌細胞Eca109/CisR比較：*P<0.05，**P<0.01；與食管鱗癌細胞Eca109比較：##P<0.01

圖2 實時熒光定量PCR檢測miRNA-218的表達量

A：Eca109細胞與Eca109/CisR細胞中miRNA-218的表達；B：NC組與miR-218 mimics組Eca109/CisR細胞中miRNA-218表達；與 Eca109細胞比較：**P<0.01；與NC組比較：##P<0.01

2.4流式細胞術法檢測過表達miRNA-218對Eca109/CisR細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測結(jié)果表明， 轉(zhuǎn)染miRNA-218 mimics組和NC組Eca109/CisR 細胞凋亡率分別為5.33%和2.05%；轉(zhuǎn)染miRNA-218 mimics組和NC組Eca109/CisR 細胞后給予濃度5 μmol/L的Cisplatin處理 ，細胞凋亡率分別為28.8%和7.42%(圖4)。

2.5轉(zhuǎn)染miRNA-218mimics和Cisplatin處理后Eca109/CisR細胞中抗凋亡蛋白Survivin、Mcl-1和Bcl-2的表達Western blot 法結(jié)果顯示，與NC組細胞比較，miR-218 mimics 組和miRNA-218 mimics+Cisplatin組Eca109/CisR細胞中抗凋亡蛋白Survivin、Mcl-1和Bcl-2表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖5)。

圖3 miRNA-218 mimics 和Cisplatin對Eca109/CisR細胞增殖抑制效應

A：miR-218 mimics抑制Eca109/CisR細胞增殖；B：miR-218 mimics增加Eca109/CisR細胞對Cisplatin的敏感性；與NC組比較：**P<0.01；與NC+Cisplatin組比較：#P<0.05

圖4 流式細胞術檢測對Eca109/CisR細胞凋亡率的影響

A:NC組；B：miRNA-218 mimics組；C：NC+Cisplatin組；D：miRNA-218 mimics+Cisplatin組

圖5 抗凋亡蛋白Survivin、Mcl-1和Bcl-2表達量的變化

A:NC組；B：miRNA-218 mimics組；C：NC+Cisplatin組；D：miRNA-218 mimics+Cisplatin組

3 討論

以藥物順鉑為基礎的化療藥物耐藥性仍然是食管鱗狀細胞癌治療的主要難題，大量的microRNAs被證實參與食管鱗癌細胞順鉑耐藥性調(diào)控機制[7]，而miR-218也被證實在多種癌癥的耐藥性的形成起到重要作用[8]，甚至部分學者認為通過檢測miRNA的表達，預測腫瘤患者對藥物治療的敏感性[9]。miR-218增加口腔癌對順鉑的耐藥性[7]，異于本研究中證實的miR-218與順鉑耐藥性之間的關系，本研究證實miR-218在順鉑耐藥的食管鱗癌細胞中呈低表達，而過表達miR-218可以促進耐藥細胞藥物敏感性，進而可以認為miR-218調(diào)控食管鱗癌細胞對順鉑的敏感性。

Survivin基因是一個細胞凋亡抑制基因，具有強大的凋亡抑制功能，同時也參與部分腫瘤耐藥性的調(diào)節(jié)[10]。而在乳腺癌細胞中[11]，miR-218抑制survivin基因表達以調(diào)節(jié)起對化療的耐藥性，與此同時，學者Lin et al[12]也提出相似觀點，miR-218通過作用于survivin基因的表達促進食管癌細胞對順鉑藥物的敏感性?？沟蛲龌駼cl2家族參與調(diào)控基因介導的細胞的多要耐藥性MDR，諸如上調(diào) miR-15b 和表達可以增加 SGC7901/VCR 細胞由長春新堿誘導凋亡的敏感性,這種改變就是通過作用于靶基因Bcl-2 來實現(xiàn)的[13]。本研究中miR-218介導的Bcl2蛋白實現(xiàn)食管癌耐藥性降低的原因，可能是基于miR-218抑制Wnt/β-catenin信號通路[14]，抑制Bcl-2的表達。同時Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因中包括有細胞周期相關基因Cyclin, 原癌基因C-myc、Survivin、Mcl-1,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)基因等，Survivin、Mcl-1是凋亡抑制因子，二者表達水平下降，會啟動主要依賴于Caspase 途徑的凋亡程序, 導致細胞線粒體膜電位下降和Caspase-3的活化。同樣miR-218也可以抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路[4]，而PI3K/AKT/mTOR信號通路可以通過抑制Bcl-2的表達[15]，促進細胞凋亡，進而間接增加食管癌細胞對順鉑的敏感性。Mcl-1是 Bcl-2家族的一個重要成員，在凋亡的調(diào)控中起著重要作用。已有研究[5]證實，在肺癌細胞中，miR-205/miR-218促進對卡鉑耐藥的肺癌細胞的凋亡，通過抑制Mcl-1的表達得以實現(xiàn)。因此，在本研究中，通過過表達miR-218實現(xiàn)食管癌對順鉑敏感性的增加，其中具體分子機制可能是通過調(diào)節(jié)抗凋亡基因survuvin、mcl-1、bcl-2表達，促進耐藥細胞的凋亡，而是否存在分子信號通路如Wnt/β-catenin、PI3K/AKT/mTOR的參與來影響藥物敏感性，有待進一步研究證實。

本研究證實，miRNA-218在食管鱗狀細胞癌對順鉑藥物的敏感性和耐藥性方面具有潛在的調(diào)控作用, 而這些調(diào)控機制可能涉及直接或間接作用于凋亡基因的表達。鑒于未做臨床病例血清學和(或)者組織學miRNA-218表達的差異性對比，miRNA-218是否可以作為有用的生物標記物,用來預測患者對化療的敏感度及生存預后，尚待進一步研究佐證?？偟膩碚f,上調(diào)miRNA-218表達可以提高耐藥的食管鱗狀細胞癌細胞對順鉑藥物的敏感性，miRNA-218可作為設計靶向藥的分子靶點，應用于對順鉑耐藥的食管鱗狀細胞癌患者的臨床靶向治療。

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