維生素D3對博來霉素誘發(fā)小鼠肺纖維化的影響

王 熹，趙 卉，徐德祥，陳遠華

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一類慢性間質(zhì)性肺疾病，以肺泡上皮細胞損傷、成纖維細胞增生和細胞外基質(zhì)聚集增多為病理特征[1]。IPF是最常見的肺部疾病之一，其發(fā)病機制復(fù)雜，早期診斷較為困難，預(yù)后極差。博來霉素(bleomycin , BLM)是一種廣泛應(yīng)用的抗腫瘤藥物，常在實驗中用于誘導小鼠肺纖維化，BLM誘導的肺纖維化，與人類的特發(fā)性肺纖維化相類似，是最常用的研究特發(fā)性肺纖維化的模型[2]。由于尚無有效方法治療特發(fā)性肺纖維化，急需嘗試新的預(yù)防和治療性干預(yù)措施以預(yù)防特發(fā)性肺纖維化。越來越多研究[3-4]證明，活性氧可能在BLM誘導的肺纖維化中起關(guān)鍵作用，活性氮也參與其中，同時，大量研究[5]表明，抗氧化治療具有一定的抗肺纖維化作用。維生素D(Vitamin D，VitD)是脂溶性開環(huán)類固醇激素。人體維生素D主要通過光照由皮膚合成，少量由食物攝入[6]。傳統(tǒng)觀點認為，維生素D在鈣吸收和骨骼代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。最近研究[8]表明，維生素D也具有抗氧化劑作用。維生素D本身缺乏生物活性。維生素D在肝臟細胞色素P450(CYP)2R1作用下首先轉(zhuǎn)化為25-(OH)-D3，25-(OH)-D3在腎臟CYP27B1作用下進一步轉(zhuǎn)化成活性型1,25-(OH)2-D3(即骨化三醇)[9]。該研究旨在探討維生素D3對BLM誘發(fā)小鼠肺纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1化學試劑博來霉素和維生素D3購自美國Sigma Chemical公司；3-硝基酪氨酸抗體購自美國Santa Cruz Biottchnologies公司；TRIzol總RNA提取試劑購自美國分子研究中心；DNA酶和實時PCR擴增試劑盒購自美國Promega公司；化學發(fā)光(ECL)檢測設(shè)備購自皮爾斯生物技術(shù)公司；引物由美國Life Technologies公司合成。

1.2實驗動物成年的C57BL/6J雄性小鼠(8周大小，24～26 g)購自北京維通利華公司，實驗前動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲食，晝夜節(jié)律，環(huán)境溫度20～25 ℃，濕度(50±5)%。

1.3方法

1.3.1動物分組、處理 96只成年C57BL/6J雄性小鼠隨機分為如下8組：生理鹽水對照組(對照組)，單純維生素D3組(VitD3組)，博來霉素組(BLM 1 d組、BLM 7 d組和BLM 21 d組)，維生素D3+博來霉素組(VitD3+ BLM 1 d組、VitD3+BLM 7d組和VitD3+ BLM 21 d組)。BLM組和VitD3+ BLM組小鼠經(jīng)氣管內(nèi)注射給予單次博萊霉素(3.0 mg/kg)，對照組和VitD3小鼠經(jīng)氣管內(nèi)注射給予等量生理鹽水。VitD3+BLM組小鼠在BLM處理前30 min以及處理后每天經(jīng)腹腔給予1次1 μg/kg的1,25(OH)2D3(活性維生素D3)，對照組、BLM組和VitD3組給予等量的生理鹽水或1,25(OH)2D3。1,25(OH)2D3劑量參照文獻[10]。對照組、VitD3組于氣管內(nèi)生理鹽水注射后21 d剖殺，余組分別于BLM處理后1 d、7 d、21 d剖殺，取左肺組織做石蠟切片和HE染色，取右肺放置在-80 ℃冰箱內(nèi)用于RT-PCR。

圖1 肺臟的HE染色 ×100

1.3.2肺組織病理學 將留取的肺組織標本固定在4%福爾馬林中并按照標準的程序嵌入石蠟中包埋，用石蠟包埋的肺組織行連續(xù)切片，至少將5張連續(xù)的切片行HE染色。

1.3.3實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) 運用TRIzol總RNA提取試劑提取肺臟組織總RNA，在280 nm及260 nm波長下運用分光光度計測樣品的吸光度值，進行RNA完整性驗證及其濃度計算。稀釋總RNA樣品定量成0.5 μg/ml，進行DNA的消化、逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。將cDNA 1 μl，MIX 10 μg，模板鏈和隨從鏈引物各1 μl，無酶水7 μl，置入RT-PCR擴增儀，通過變性、退火、延伸3個步驟進行擴增，運用專用軟件計算目標基因的相對值。各基因引物序列見表1。

1.3.4肺組織免疫組化學檢測 隨機從每組肺臟組織切片中選取5張 ，烤箱烤片后二甲苯脫蠟，依次梯度濃度乙醇水化，然后滴加TritonX-100通透細胞，再滴加10%過氧化氫進行封閉，后枸櫞酸鈉緩沖液中微波修復(fù)抗原3次，每次5 min，間隔10 min。冷卻至室溫后滴入5%的羊血清濕盒內(nèi)靜置20 min，然后在組織表面滴注3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)一抗孵育，放置4 ℃冰箱孵育過夜。然后相應(yīng)進行二抗孵育，SP反應(yīng)，最后用DAB顯色，在光鏡下進行觀察顯色，顯色充分后進行復(fù)染、脫水、透明、封片。每張片子隨機取5個高倍鏡視野在光學顯微鏡下觀察，使用 Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件半定量分析各個視野下棕黃色區(qū)域占整個該視野面積的比例。

表1 各基因引物序列

2 結(jié)果

2.1維生素D3對博萊霉素所致小鼠肺纖維化的影響肺組織HE染色結(jié)果提示，與對照組對比，BLM組小鼠給藥7 d、21 d后肺泡正常結(jié)構(gòu)破壞嚴重，7 d開始出現(xiàn)肺泡間隔增厚，21 d肺間隔明顯增寬、成纖維細胞增生、膠原沉積。VitD3顯著減輕BLM引起的肺泡正常結(jié)構(gòu)破壞、肺間隔增寬和肺纖維化。見圖1。

圖2 肺臟的3-NT免疫組化染色 SP×400

A:對照組；B:VitD3組；C:BLM 1 d組；D:VitD3+ BLM 1 d組；E:BLM 7 d組；F:VitD3+ BLM 7 d組；G:BLM 21 d組；H:VitD3+ BLM 21 d組

2.2維生素D3對博萊霉素所致肺蛋白質(zhì)硝化的影響B(tài)LM組小鼠肺組織中棕黃色顯色區(qū)域定量較對照組明顯增多(P<0.01)，蛋白質(zhì)硝化隨時間延長而增加，其中7 d達到峰值，21 d時有所下降，而VitD3+BLM組小鼠肺組織中棕黃色區(qū)域定量與BLM組對比明顯減少(P<0.01)，說明維生素D3抑制了BLM所致的蛋白硝化反應(yīng)。見圖2、3。

圖3 3-NT 免疫組織化學染色相對表達量

1:對照組；2:VitD3組；3:BLM 1 d組；4:VitD3+ BLM 1 d組；5:BLM 7 d組；6:VitD3+ BLM 7 d組；7:BLM 21 d組；8:VitD3+ BLM 21 d組；與對照組比較:**P<0.01；與BLM組比較:##P<0.01

2.3維生素D3對博萊霉素上調(diào)小鼠肺NADPH氧化酶基因的影響與對照組對比，BLM組小鼠肺NADPH氧化酶基因p47phox在給藥后1、7 d上調(diào)(P<0.05)，p67phox在給藥后7、21 d明顯上調(diào)(P<0.01)。VitD3顯著減輕BLM引起的小鼠肺p47phox和p67phox基因的上調(diào)。單純維生素D3組與對照組比較氧化酶基因表達無明顯變化。見圖4。

圖4 各組小鼠肺臟NADPH氧化酶mRNA表達情況

A：p47phox；B：p67phox；1:對照組；2:VitD3組；3:BLM 1 d組；4:VitD3+ BLM 1 d組；5:BLM 7 d組；6:VitD3+ BLM 7 d組；7:BLM 21 d組；8:VitD3+ BLM 21 d組；與對照組比較:*P<0.05,**P<0.01；與BLM組比較:#P<0.05，##P<0.01

2.4維生素D3對博萊霉素下調(diào)小鼠肺抗氧化酶基因的影響與對照組比較，BLM組小鼠肺抗氧化酶基因超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，sod)1在給藥后1、7和21 d明顯下調(diào)(P<0.01)，sod2在1d明顯下調(diào)(P<0.01)，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，gshpx)在21 d明顯下調(diào)(P<0.01)，VitD3顯著對抗BLM引起的小鼠肺sod1、sod2、gshpx基因表達下調(diào)。BLM對谷胱甘肽還原酶基因(glutathione reductase，gshrd)表達影響很小，然而VitD3+BLM組gshrd基因表達明顯升高(P<0.01)。單純維生素D3組與對照組比較抗氧化酶基因表達無明顯變化。見圖5。

A：sod1；B：sod2；C：gshpx；D：gshrd；1:對照組；2:VitD3組；3:BLM 1 d組；4:VitD3+ BLM 1 d組；5:BLM 7 d組；6:VitD3+ BLM 7 d組；7:BLM 21 d組；8:VitD3+ BLM 21 d組；與對照組比較:**P<0.01；與BLM組比較:#P<0.05，##P<0.01

3 討論

肺纖維化是一種慢性肺部疾病，其病理機制仍不明確，目前暫無有效的治療藥物。目前研究肺纖維化多數(shù)運用BLM誘導的肺纖維化模型，本研究成功復(fù)制BLM肺纖維化模型，并給予VitD3進行干預(yù)。結(jié)果顯示，維生素D3明顯減輕了BLM處理后7 d、21 d肺泡正常結(jié)構(gòu)破壞、肺間隔增厚、纖維細胞增生以及膠原沉積。上述結(jié)果提示：維生素D3明顯減輕了BLM引起的肺纖維化，這與早前研究報道維生素D3能改善BLM誘發(fā)小鼠肺纖維化相一致[11]。

隨著氧化應(yīng)激研究的深入，目前有研究[3]表明氧化應(yīng)激在肺纖維化過程中起重要作用。另有研究[12]提示VitD3可以減輕LPS誘發(fā)的急性腎損傷中的氧化應(yīng)激，其主要機制是調(diào)節(jié)氧化酶和抗氧化酶基因的表達。因此設(shè)想VitD3保護BLM誘發(fā)肺纖維化的機制與抗氧化應(yīng)激相關(guān)。本研究結(jié)果顯示BLM所致肺纖維化模型中小鼠肺NADPH氧化酶p47phox和p67phox基因分別在給藥后1 d、7 d和7 d、21 d明顯上調(diào)，同時抗氧化酶sod1在給藥后1 d、7 d和21 d明顯下調(diào)，sod2基因在1 d明顯下調(diào)，gshpx基因在21 d明顯下調(diào)，上述結(jié)果表明BLM所致肺纖維化中存在氧化酶基因上調(diào)和抗氧化酶基因下調(diào)，各種酶基因表達調(diào)節(jié)時間及時限不同，抗氧化酶以sod為主。VitD3處理顯著減弱了BLM所致的肺NADPH氧化酶基因表達的上調(diào)和抗氧化酶基因表達的下調(diào)。此外，本研究免疫組化結(jié)果顯示BLM所致肺纖維化模型中蛋白質(zhì)硝化標志3-NT殘留定量明顯增多，而VitD3明顯減少了BLM所致3-NT殘留。綜上所述：維生素D3抑制BLM所致肺纖維化過程中氧化應(yīng)激，其可能的機制是下調(diào)氧化酶基因及上調(diào)抗氧化酶基因的表達。

目前，很多研究[13-14]顯示BLM誘發(fā)肺纖維化的機制可能與炎癥、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等領(lǐng)域相關(guān)。而前期研究[10,15]表明維生素D3抑制BLM誘導的肺部炎癥以及內(nèi)皮細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。本研究僅闡述維生素D3對BLM所致肺纖維化具有保護作用以及可能的機制是減輕其過程中的氧化應(yīng)激，但維生素D3是直接影響氧化應(yīng)激，還是通過改善炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等間接影響氧化應(yīng)激，抑或是作用三個機制共同起到保護作用，本研究暫未闡明，有待進一步的研究。總之本研究結(jié)果表明維生素D3對肺纖維化起保護作用及部分機制，并對臨床治療提出新的方向。

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