豐富環(huán)境干預(yù)對(duì)小鼠梨狀皮層錐體神經(jīng)元興奮性的影響

陳昌鋒，陳 磊，江 勤，尹艷艷,2

豐富環(huán)境(enriched environment，EE)是多種外環(huán)境有益刺激和多信息交流的綜合體，與常規(guī)環(huán)境(standard environment，SE)相比，前者擁有更為寬大的活動(dòng)場(chǎng)所和多樣的生活場(chǎng)景以提供豐富的各類有益刺激，同類動(dòng)物數(shù)量的增加可提供更多的動(dòng)物之間的信息交流。豐富環(huán)境作為一種經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)干預(yù)方法，主要研究復(fù)雜多樣的外環(huán)境刺激對(duì)神經(jīng)元發(fā)育的影響以及對(duì)疾病的治療效果等，已有研究[1]提示豐富環(huán)境對(duì)老年癡呆、腦卒中和自閉癥等動(dòng)物模型具有一定的治療效果。豐富環(huán)境所產(chǎn)生的良性應(yīng)激刺激對(duì)哺乳類動(dòng)物大腦的結(jié)構(gòu)和功能有重要影響，外環(huán)境的復(fù)雜感覺刺激對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)元的生長(zhǎng)和發(fā)育也至關(guān)重要。

小鼠等多數(shù)嚙齒類動(dòng)物屬夜行動(dòng)物，主要通過(guò)嗅覺和觸覺探索周圍環(huán)境，嗅覺功能在小鼠的整個(gè)生命活動(dòng)中顯得尤為重要，梨狀皮層是小鼠嗅覺的腦部投射區(qū)，小鼠生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中各種外環(huán)境刺激對(duì)小鼠梨狀皮層的生長(zhǎng)和發(fā)育都有著重要作用。以往的研究[2-3]主要集中在豐富環(huán)境對(duì)視皮層和聽覺皮層的影響，梨狀皮層作為嚙齒類動(dòng)物重要的感覺皮層卻鮮有報(bào)道，同時(shí)錐體神經(jīng)元是哺乳類動(dòng)物大腦皮層重要的興奮性神經(jīng)元，其電生理特性的變化對(duì)梨狀皮層的功能可能產(chǎn)生重要影響。該實(shí)驗(yàn)運(yùn)用離體腦片電生理的實(shí)驗(yàn)方法，通過(guò)全細(xì)胞模式記錄錐體神經(jīng)元電生理指標(biāo)，以期闡明豐富環(huán)境干預(yù)下，小鼠梨狀皮層錐體神經(jīng)元興奮性的變化特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)選用出生后15 d的C57BL/6小鼠30只，雌雄不限，體重(8.0 ± 5)g，隨機(jī)分成兩組：豐富環(huán)境組(EE組)和常規(guī)環(huán)境組(SE組)各15只。

1.1.2藥品與試劑 NaH2PO4購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑廠；dextrose購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MgSO4、HEPES 和Tris-GTP均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；切腦液(mmol/L)： NaH2PO41.2、HEPES 5、CaCl20.5、NaCl 124、MgSO45、KCl 3、NaHCO426和dextrose 10，pH 7.4；人工腦脊液(灌流液，mmol/L)：NaH2PO41.25、CaCl22、NaHCO426、MgSO42、NaCl 126、dextrose 25、KCl 2.5和HEPES 5，pH 7.4；全細(xì)胞記錄電極內(nèi)液(mmol/L)：葡萄糖酸鉀 155、EGTA 0.5、Mg-ATP 4、NaCl 4、HEPES 10和Tris-GTP 1，pH 7.35。

1.1.3器材 Axoclamp-200B放大器(美國(guó)Axon公司)；震蕩切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)，Sutter P-97電極拉制儀和玻璃微電極(美國(guó)SUTTER公司)等。

1.2方法

1.2.1不同飼養(yǎng)范式的干預(yù)方法 EE組小鼠在豐富環(huán)境箱中飼養(yǎng)，豐富環(huán)境飼養(yǎng)箱的規(guī)格是70 cm×40 cm×35 cm，內(nèi)部包含管道、小屋、木質(zhì)玩物以及小鼠筑巢的一些材料如棉花等，除常規(guī)墊料外，額外添加一些碎紙、卷紙以及布?jí)K等其他一些不同觸感的材料。每天固定時(shí)間調(diào)整飼養(yǎng)箱內(nèi)各物體的位置一次，每天更換墊料一次，每個(gè)箱內(nèi)飼養(yǎng)小鼠10只。SE組小鼠按照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行喂養(yǎng)，普通飼養(yǎng)箱，箱內(nèi)無(wú)其他物品，常規(guī)墊料，每個(gè)箱內(nèi)飼養(yǎng)4只小鼠。動(dòng)物房?jī)?nèi)保持正常的晝夜節(jié)律，溫度適宜，無(wú)雜音干擾。所有小鼠給予充足的水和食物。

1.2.2腦片的制備方法 不同飼養(yǎng)范式干預(yù)結(jié)束后，取小鼠麻醉，斷頭取腦，剪開頭部皮膚，暴露顱骨，將顱骨沿中間剪開，左右分開顱骨，使腦組織充分暴露，用挖腦勺迅速將小鼠腦組織取出置于冰水混合的切腦液中，切腦液應(yīng)預(yù)先通氧(95% O2+ 5% CO2)。將取下的腦組織稍作修整，用膠水將小鼠腦固定在振蕩切片機(jī)的平臺(tái)上，切片機(jī)的槽內(nèi)應(yīng)預(yù)先放入切腦液的冰水混合物，進(jìn)行冠狀切片，切片厚度為350～450 μm，切好的腦片放入充分氧合的人工腦脊液中，25 ℃條件下持續(xù)通氧孵育1 h。

1.2.3細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)方法 孵育結(jié)束后將腦片置于顯微鏡平臺(tái)的浴槽內(nèi)，輔以U形蓋網(wǎng)固定，人工腦脊液持續(xù)通氧灌流。根據(jù)小鼠腦圖譜提示的皮層位置關(guān)系，在顯微鏡下找到梨狀皮層區(qū)。根據(jù)錐體神經(jīng)元的形態(tài)呈現(xiàn)錐形這一特點(diǎn)，且與其他神經(jīng)元相比錐體神經(jīng)元的頂樹突比較容易觀察到，同時(shí)結(jié)合記錄到的神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放規(guī)律來(lái)確定錐體神經(jīng)元。玻璃電極內(nèi)充灌電極內(nèi)液，手指輕彈排空氣泡，入液前給予一定正壓，以防灌流液中雜質(zhì)堵塞玻璃電極尖端，利用顯微操作系統(tǒng)將玻璃電極尖端貼住神經(jīng)元，釋放正壓的同時(shí)給予負(fù)壓吸引，待形成兆歐封接后，用嘴給予負(fù)壓破膜，利用Axonclamp-200B放大器，在電流鉗模式下對(duì)梨狀皮層錐體神經(jīng)元進(jìn)行全細(xì)胞紀(jì)錄，玻璃微電極的入液電阻是5～7 MΩ。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)選用的標(biāo)準(zhǔn)是錐體神經(jīng)元的靜息電位負(fù)值超過(guò)-60 mV且動(dòng)作電位的振幅超過(guò)90 mV。

2 結(jié)果

2.1錐體神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢婚g距(inter-spikeintervals,ISI)的變化在全細(xì)胞記錄模式下，通過(guò)電極給予細(xì)胞一段去極化脈沖刺激，調(diào)整該刺激脈沖大小，使其達(dá)細(xì)胞閾刺激，誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位，動(dòng)作間距即為閾刺激下相鄰動(dòng)作電位峰值之間的時(shí)間間隔，其值的大小表示細(xì)胞將興奮性信號(hào)輸入轉(zhuǎn)換為編碼動(dòng)作電位的能力的大小。EE組記錄的數(shù)值分別是ISI1-2～I(xiàn)SI4-5(ms)：(14.28±1.1)、(22.34±2.3)、(28.2±1.73)和(31.83±1.82)，SE組的數(shù)值分別是ISI1-2～I(xiàn)SI4-5(ms)：(18.3±1.33)、(28.52±2.67)、(33.83±2.43)和(38.23±2.31)(圖1A、B和C)。EE組的動(dòng)作電位間距與SE組相比均減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2錐體神經(jīng)元能障(energybarrier,Vts-Vr)的變化細(xì)胞的興奮性受閾電位和靜息電位的影響。如圖1A所示，閾電位(threshold potentials, Vts)是動(dòng)作電位的起始點(diǎn)，其與靜息電位(resting potentials, Vr)之間的差值(Vts-Vr)記為神經(jīng)元的能障，其含義表示神經(jīng)元受到興奮性刺激越過(guò)能級(jí)障礙產(chǎn)生動(dòng)作電位的能力。EE組各能障值分別是Vts-Vr1～Vts-Vr5(mV)：(26.52±1.34)、(31.34±1.54)、(32.51±1.2)、(31.73±1.76)和(33.53±1.62)，SE組各能障值分別是Vts-Vr1～Vts-Vr5(mV)：(30.93±1.15)、(36.92±1.98)、(37.3±2.16)、(38.81±1.21)和(38.34±1.33)(圖1A、B和D)。EE組與SE組相比能障均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3錐體神經(jīng)元絕對(duì)不應(yīng)期(absoluterefractoryperiods,ARP)的測(cè)定實(shí)驗(yàn)通過(guò)軟件Clampex 10.0連續(xù)向神經(jīng)元輸入2個(gè)相同的去極化脈沖刺激，通過(guò)調(diào)整這兩個(gè)脈沖刺激之間的間隔時(shí)間，使第2個(gè)脈沖刺激誘導(dǎo)神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位的幾率正好是50%，此時(shí)產(chǎn)生第2個(gè)動(dòng)作電位的時(shí)間點(diǎn)即為第1個(gè)動(dòng)作電位絕對(duì)不應(yīng)期的臨界點(diǎn)，定義此時(shí)2個(gè)脈沖刺激的時(shí)間間隔為絕對(duì)不應(yīng)期，其值的大小表示細(xì)胞的興奮程度。圖2 A顯示的是EE組與SE組錐體神經(jīng)元的ARP的軌跡圖，由圖2B得知EE組的ARP要小于EE組，EE組ARP數(shù)值是：(3.682 ± 0.583)ms，SE組數(shù)值是：(4.45 ± 0.862)ms，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

豐富環(huán)境除了包含了新奇多樣的飼養(yǎng)元素，同時(shí)為了模擬同類的社交活動(dòng)在同一環(huán)境中還增加了共同飼養(yǎng)的動(dòng)物數(shù)目。豐富環(huán)境中所布置的物品會(huì)定期進(jìn)行位置重設(shè)和更新，以增加環(huán)境新奇性，激發(fā)小鼠的探索行為，模擬小鼠的自然生活習(xí)性。已有的研究[4-5]顯示，豐富環(huán)境可促進(jìn)海馬齒狀回神經(jīng)元前體細(xì)胞的存活，并增加海馬區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量，早期的豐富環(huán)境干預(yù)還可增加海馬區(qū)GABA能神經(jīng)元的傳遞效率，促進(jìn)突觸的發(fā)育成熟。近來(lái)的研究[6]還表明，豐富環(huán)境可以促進(jìn)視覺系統(tǒng)的發(fā)育，可見豐富環(huán)境刺激在神經(jīng)回路的形成和功能中起著至關(guān)重要的作用，本實(shí)驗(yàn)則研究嗅覺系統(tǒng)在早期豐富環(huán)境干預(yù)下的發(fā)育特點(diǎn)。

圖1 不同飼養(yǎng)環(huán)境對(duì)小鼠梨狀皮層錐體神經(jīng)元ISI和Vts-Vr的影響

A：全細(xì)胞模式下記錄的EE組ISI的軌跡圖；B：全細(xì)胞模式下記錄的SE組ISI的軌跡圖；C：ISI的統(tǒng)計(jì)圖；D：Vts-Vr的統(tǒng)計(jì)圖；與SE組相比較：*P<0.05

圖2 不同飼養(yǎng)環(huán)境對(duì)小鼠梨狀皮層錐體神經(jīng)元ARP的影響

小鼠嗅覺系統(tǒng)可對(duì)來(lái)自外環(huán)境的上萬(wàn)種不同氣味進(jìn)行識(shí)別，這種識(shí)別過(guò)程主要由分布于嗅黏膜上的氣味受體、嗅小球和梨狀皮層共同完成，嗅小球?qū)⒉煌臍馕缎盘?hào)處理后，傳遞到更高級(jí)的梨狀皮層。實(shí)驗(yàn)選取了能障、動(dòng)作電位間距和絕對(duì)不應(yīng)期作為評(píng)價(jià)梨狀皮層錐體神經(jīng)元內(nèi)在特性的指標(biāo)[7-9]。實(shí)驗(yàn)中，豐富環(huán)境對(duì)小鼠梨狀皮層錐體神經(jīng)元電生理特性的影響主要表現(xiàn)在,豐富環(huán)境可使錐體神經(jīng)元的Vts-Vr降低、ISI減小和ARP的縮短。Vts-Vr降低表明錐體神經(jīng)元在受到去極化刺激后由靜息狀態(tài)到形成動(dòng)作電位的能力增加，對(duì)興奮性刺激更加敏感，在受到相同去極化刺激下，豐富環(huán)境組錐體神經(jīng)元更容易爆發(fā)出動(dòng)作電位。ISI體現(xiàn)的是在神經(jīng)元輸入一段興奮性刺激后所爆發(fā)出的動(dòng)作電位的密度，ISI減小表明相同的刺激輸入能誘導(dǎo)出更多的動(dòng)作電位，即動(dòng)作電位的發(fā)放頻率增加。ARP的縮短提示神經(jīng)元在特定的刺激時(shí)間內(nèi)爆發(fā)的動(dòng)作電位數(shù)量增加，即動(dòng)作電位的發(fā)放容量增加，這與ISI的減小是相符的，進(jìn)一步證明了豐富環(huán)境組小鼠梨狀皮層錐體神經(jīng)元興奮性提高。

本實(shí)驗(yàn)研究主要集中在錐體神經(jīng)元的電生理特性的改變，從神經(jīng)元的角度揭示了豐富環(huán)境對(duì)梨狀皮層的影響，可提高錐體神經(jīng)元的興奮性。以往的研究[10]顯示豐富環(huán)境刺激對(duì)小鼠大腦的影響可能是多方面的，其中還包括神經(jīng)元的樹突棘密度及突觸形態(tài)的改變，甚至一些突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)都可能受到影響。本實(shí)驗(yàn)選取了小鼠大腦發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期進(jìn)行差別化的干預(yù)飼養(yǎng)，但前人的研究[11]提示豐富環(huán)境對(duì)小鼠大腦不同時(shí)期可能同樣存在影響，這些還有待于后續(xù)的進(jìn)一步研究。

[1] Li G, Gan Y, Fan Y, et al. Enriched environment inhibits mouse pancreatic cancer growth and down-regulates the expression of mitochondria-related genes in cancer cells [J]. Sci Rep, 2015, 5: 7856.

[2] Shakhawat A M, Gheidi A, Hou Q, et al. Visualizing the engram: learning stabilizes odor representations in the olfactory network[J]. J Neurosci, 2014, 34(46): 15394-401.

[3] Zheng J,Ding W,Li B, et al. Enriched environment promotes remyelination and motor function recovery through modulation of HDAC1/2 in mice [J]. Neurosci Lett, 2017, 655: 121-30.

[4] Bian W J, Miao W Y, He S J, et al. Coordinated spine pruning and maturation mediated by Inter-Spine competition for Cadherin/Catenin complexes [J]. Cell, 2015, 162(4): 808-22.

[5] He S,Ma J,Liu N, et al. Early enriched environment promotes neonatal GABAergic neurotransmission and accelerates maturation [J]. J Neurosci,2010, 30(23):7910-6.

[6] Li M Y, Miao W Y, Wu Q Z, et al. A critical role of presynaptic Cadherin/Catenin/p140Cap complexes in stabilizing spines and functional synapses in the neocortex [J]. Neuron, 2017,94(6): 1155-72.

[7] Chen N, Chen S, Wu Y, et al. The refractory periods and threshold potentials of sequential spikes measured by whole-cell recordings [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 340(1): 151-7.

[8] 丁正霞,薛 天,鮑 進(jìn),等.小鼠腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元的鑒定及其晝夜發(fā)放頻率 [J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 51(9): 1235-8.

[9] Yan F, Gao Z, Chen P, et al. Coordinated plasticity between barrel cortical glutamatergic and GABAergic neurons during associative memory [J]. Neural Plast, 2016: 5648390.

[10] Pielarski K N, van Stegen B, Andreyeva A, et al. Asymmetric N-cadherin expression results in synapse dysfunction, synapse elimination, and axon retraction in cultured mouse neurons [J]. PLoS One, 2013,8(1):e54105.

[11] Hilal M L,Moreau M M,Racca C, et al.Activity-dependent neuroplasticity induced by an enriched environment reverses cognitive deficits in scribble deficient mouse [J].Cereb Cortex, 2017, 27(12): 5635-51.