亮菌多糖對GES-1細(xì)胞發(fā)生EMT的影響及機制研究

趙莉莉，朱耀東，李 平,張 梅

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，在胚胎發(fā)育、傷口愈合、組織再生、器官纖維化和腫瘤進(jìn)展中起重要作用[1]。研究[2]表明 ，EMT與胃癌的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)，廣泛存在于胃癌前病變過程中，與多種信號通路及基因表達(dá)失調(diào)有關(guān)，其主要表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及相關(guān)蛋白異常表達(dá)，胃黏膜上皮細(xì)胞由不規(guī)則多邊形向梭形轉(zhuǎn)變，細(xì)胞之間黏連減少，排列紊亂；其標(biāo)記上皮細(xì)胞的E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)表達(dá)減少，標(biāo)記間質(zhì)細(xì)胞的N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表達(dá)增多。亮菌多糖(Armillariellatabescenspolysaccharides,ATPS)是亮菌生長代謝過程中的有效產(chǎn)物，是亮菌口服液的有效成分，ATPS有明顯的增強機體免疫力、抗腫瘤及保護(hù)胃黏膜的作用[3]。亮菌口服液臨床廣泛用于治療慢性淺表性、萎縮性胃炎，并取得了較好的療效，有效的逆轉(zhuǎn)胃癌前病變，控制了疾病的進(jìn)展。關(guān)于亮菌多糖對人胃黏膜細(xì)胞(human gastric epithelial cell line, GES-1)發(fā)生EMT的影響及相關(guān)機制研究，相關(guān)研究報道較少。該研究利用白介素-8(interleukin-8，IL-8)誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞建立EMT模型；不同劑量亮菌多糖作用后細(xì)胞形態(tài)可部分恢復(fù)，侵襲力降低。

1 材料與方法

1.1實驗儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；安全生物柜購自北京Aertai公司；DMEM培養(yǎng)基、胰酶購自美國Gibco公司；胎牛血清購自以色列Biological Industries公司；ATPS購自合肥誠志生物制藥有限公司(純度>90%)；IL-8及IL-8溶解套裝購自美國Peprotech公司，溶解稀釋成25 mg/L，分裝后-20 ℃保存；兔抗人E-Cadherin、N-cadherin、Vimentin、PDCD4抗體購自美國Cell Signaling Technology生物公司；鼠抗人GAPDH抗體購自上海BBI life sciences公司；二抗購自美國Promega公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、細(xì)胞裂解液購自合肥biosharp公司。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1株購自南京科佰生物科技有限公司，在細(xì)胞培養(yǎng)室的超凈工作臺上，將GES-1細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)液中(含10%胎牛血清,1%雙抗 )，將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)皿中細(xì)胞生長近80%細(xì)胞基本融合時，用濃度為0.25% 胰蛋白酶37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化2～3 min，顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓、散開時，1 ∶1加入DMEM培養(yǎng)液終止消化，800 r/min離心3 min，重懸后分裝至3小皿繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2建立EMT模型 生長至對數(shù)期的GES-1細(xì)胞，加入含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞完全貼壁，更換培養(yǎng)基為1%FBS的DMEM，分別加入濃度為25、50、100、200、300 μg/L的IL-8作為實驗組；對照組更換正常培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3MTT法檢測不同濃度亮菌多糖對GES-1細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長的GES-1細(xì)胞消化計數(shù)后接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，8.0×103個每孔，37 ℃、5% CO2溫室培養(yǎng)12 h細(xì)胞長成單層 ,將ATPS用DMEM稀釋成15、30、60、120、240 mg/L分別加入各孔中,每孔0.1 ml,每一稀釋度設(shè)置5個復(fù)孔 ,同時設(shè)立空白對照組、DMSO處理組及僅加DMSO組。37 ℃、5% CO2溫育24 h后每孔加入MTT(5 g/L)10 μl后繼續(xù)孵育4 h，小心吸凈各孔內(nèi)培養(yǎng)液，然后每孔內(nèi)加入150 ml DMSO，震蕩10 min，酶標(biāo)儀測其波長490 nm吸光度，各組均取平均值，計算各組細(xì)胞的相對存活率并繪制柱狀圖。以空白組為零，抑制率(%)=1-(給藥組OD值-DMSO組OD值)/(空白組OD值-DMSO組OD值)×100%，實驗重復(fù)3遍。

1.2.4亮菌多糖對IL-8誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞發(fā)生EMT的影響 GES-1細(xì)胞隨機分為5組，每組至少3復(fù)孔。分別設(shè)空白對照組、模型組、實驗組[ATPS(高、中、低劑量)組]。待細(xì)胞貼壁后除空白對照組外，其余各組預(yù)先更換為1% FBS的DMEM并給予IL-8 200 μg/L孵育1 h后，實驗組給予不同濃度(30、60、120 mg/L)的亮菌多糖繼續(xù)孵育24 h。

1.2.5光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化 取不同濃度IL-8誘導(dǎo)24 h后的GES-1細(xì)胞顯微鏡下拍照，每孔取4個視野；同樣的方法對亮菌多糖處理后的各組細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下拍照。

1.2.6細(xì)胞劃痕實驗 先用記號筆在6孔板背后用直尺均勻劃橫線，每孔至少穿過5條線，將對數(shù)期生長的GES-1細(xì)胞胰蛋白酶消化、10% MDEM重懸，每孔內(nèi)加入約8×105個細(xì)胞，以過夜能鋪滿孔底為最好，37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)待細(xì)胞至細(xì)胞融合達(dá)到90%以上，用100 μl移液槍頭在孔板內(nèi)平行劃痕，PBS液洗滌3次后，空白對照組加入1% FBS的DMEM培養(yǎng)基1.5 ml，模型組加入IL-8 200 μg/L含1% FBS的DMEM培養(yǎng)基1.5 ml，實驗組加入IL-8 200 μg/L含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基1.5 ml培養(yǎng)1 h后加入ATPS 120 mg/L,在倒置顯微鏡100倍下觀察、劃痕兩側(cè)細(xì)胞的遷移情況，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別于0、6、12、18、24 h鏡下拍照測量劃痕寬度，比較各組間劃痕愈合的差異,實驗重復(fù)3次。

1.2.7Western blot法檢測EMT相關(guān)蛋白及PDCD4蛋白的表達(dá) 將處理后細(xì)胞棄上清液，加入細(xì)胞裂解液(80～100 μl)，充分搔刮孔底后收集樣本，沸水煮樣10 min，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?%濃縮膠，10%分離膠，每孔上樣10 μl，90 V恒壓電泳20 min，調(diào)整電壓150 V電泳60 min；恒流350 mA轉(zhuǎn)膜150 min，將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上；用50 mg/L的脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4 ℃ 孵化過夜，E-Cadherin(1:300)、N-cadherin(1 ∶500)、Vimentin(1 ∶500)、PDCD4(1 ∶500)、GAPDH(1 ∶1 000)，TBST洗去一抗(共洗5次,每次7 min)，加二抗(1 ∶10 000)室溫孵化1h，TBST洗去二抗(共洗5次,每次7 min)，ECL發(fā)光試劑A液：B液1 ∶1混合后均勻滴在條帶上，使用ImageQuant LAS 4000系統(tǒng)顯影，Image-Pro-Plus軟件進(jìn)行Western blot條帶灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1觀察EMT模型細(xì)胞形態(tài)變化IL-8誘導(dǎo)24 h后，GES-1細(xì)胞形態(tài)由不規(guī)則多邊形、易聚集成片向梭形轉(zhuǎn)變，細(xì)胞排列疏松紊亂，細(xì)胞間粘連度減小，隨IL-8濃度越大，細(xì)胞形態(tài)變化越明顯，見圖1。

2.2Westernblot法檢測IL-8誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)變化結(jié)果顯示，其標(biāo)記上皮細(xì)胞的E-Cadherin表達(dá)減少，標(biāo)記間質(zhì)細(xì)胞的N-cadherin、Vimentin表達(dá)增多，綜合3種蛋白表達(dá)量變化情況及結(jié)合形態(tài)學(xué)變化，選擇IL-8 200 μg/L誘導(dǎo)建立EMT模型，見圖2。

圖1 IL-8誘導(dǎo)GES-1發(fā)生EMT轉(zhuǎn)變細(xì)胞形態(tài)的變化 ×100

圖2 Western blot法檢測各組細(xì)胞中E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin的表達(dá)

1:空白對照組；2：IL-8 25 μg/L；3：IL-8 50 μg/L；4：IL-8 100 μg/L； 5：IL-8 200 μg/L；6：IL-8 300 μg/L ；與空白對照組比較：*P<0.05，***P<0.001

2.3MTT檢測ATPS對GES-1細(xì)胞存活率的影響不同濃度ATPS處理GES-1細(xì)胞24 、48 h后，相同作用時間不同濃度之間用χ2檢驗，相同濃度不同作用時間組間行t檢驗。MTT結(jié)果提示：同一濃度下，隨著藥物作用時間增加，對細(xì)胞的抑制作用增強，差別有統(tǒng)計學(xué)意義；同一時間點，ATPS濃度的增加對GES-1細(xì)胞增殖的抑制作用的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

2.4觀察ATPS逆轉(zhuǎn)GES-1細(xì)胞EMT后細(xì)胞形態(tài)的變化和空白對照組相比，模型組GES-1細(xì)胞形態(tài)明顯由多邊形向梭形轉(zhuǎn)表，細(xì)胞排列疏松紊亂，細(xì)胞間粘附力降低，實驗組和模型組比較，細(xì)胞形態(tài)向多邊形轉(zhuǎn)變，細(xì)胞之間出現(xiàn)片狀粘連，生長狀態(tài)好轉(zhuǎn)，見圖4。

2.5ATPS逆轉(zhuǎn)GES-1細(xì)胞發(fā)生EMT相關(guān)蛋白表達(dá)變化Western blot結(jié)果顯示實驗組與模型組相比上皮細(xì)胞的E-Cadherin表達(dá)增加，標(biāo)記間質(zhì)細(xì)胞的N-cadherin、Vimentin表達(dá)減少，見圖5。

圖3 不同濃度ATPS用于GES-1細(xì)胞的存活率

與處理48 h組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖4 不同濃度ATPS逆轉(zhuǎn)IL-8誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞發(fā)生EMT的細(xì)胞形態(tài)變化 ×100

圖5 Western blot法檢測ATPS作用前后EMT相關(guān)蛋白變化

1:空白對照組；2：IL-8 200 μg/L；3：IL-8 200 μg/L +ATPS 30 mg/L；4:IL-8 200 μg/L +ATPS 60 mg/L；5: IL-8 200 μg/L +ATPS 120 mg/L；與IL-8 200 μg/L比較：*P<0.05

2.6ATPS逆轉(zhuǎn)GES-1細(xì)胞發(fā)生EMT的機制探討為進(jìn)一步探討可能機制，Western blot檢測程序性細(xì)胞死亡因子PDCD4蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示，模型組PDCD4表達(dá)明顯減少，加入亮菌多糖后，PDCD4表達(dá)量增高，說明亮菌多糖逆轉(zhuǎn)EMT可能與調(diào)節(jié)PDCD4表達(dá)量有關(guān),見圖6。

2.7細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果細(xì)胞劃痕實驗顯示IL-8使GES-1細(xì)胞侵襲擴散能力增強，而ATPS可以顯著抑制GES-1細(xì)胞向周圍擴散，抑制其侵襲和轉(zhuǎn)移能力,見圖7。

3 討論

圖6 Western blot法檢測程序性細(xì)胞死亡因子PDCD4蛋白表達(dá)量

1:空白對照組；2：IL-8 200 μg/L；3:IL-8 200 μg/L +ATPS 30 mg/L；4:IL-8 200 μg/L +ATPS 60 mg/L；5:IL-8 200 μg/L +ATPS 120 mg/L；與IL-8 200 μg/L比較：***P<0.001

圖7 細(xì)胞劃痕實驗不同時間各組細(xì)胞向周圍擴散的程度

亮菌又叫假蜜環(huán)菌，是一種兼食用與藥用價值于一體的名貴真菌，從2002年開始亮菌口服液應(yīng)用于臨床，主要用于慢性肝炎、遷延性肝炎、慢性膽管炎和膽囊炎以及慢性、淺表性、萎縮性胃炎及放療、化療引起的白細(xì)胞減少的輔助治療，取得顯著的療效。亮菌可降低化療后大鼠胃腸道組織5-HT的釋放,可有效抑制順鉑化療所誘發(fā)的胃節(jié)律性運動紊亂[4]。以亮菌發(fā)酵產(chǎn)物為主要成分的亮菌口服液臨床上長期應(yīng)用于慢性胃炎的治療，取得顯著的療效，可以有效逆轉(zhuǎn)慢性萎縮性胃炎，研究[5]表明，亮菌口服液對反流液造成的胃黏膜損失有保護(hù)作用，其機制可能與降低了胃黏膜COX-2含量相關(guān)，并且亮菌口服液可以通過修復(fù)受損胃黏膜的超微結(jié)構(gòu)來起到保護(hù)作用[6]。大量臨床案例及實驗室研究表明慢性萎縮性胃炎屬胃癌前病變，亮菌口服液可有效逆轉(zhuǎn)胃癌前病變，降低胃癌的發(fā)生。其中亮菌口服液的主要有效成分ATPS起到重要的作用，亮菌多糖是由亮菌發(fā)酵產(chǎn)生的分子量145 000的雜多糖，由L-木糖、L-巖藻糖、D -半乳糖、D -葡萄糖和D -甘露糖5種單糖組成。研究[7]表明，亮菌多糖可通過提高小鼠腸黏膜組織中表皮生長因子EGF含量降低前列腺素2含量，從而對順鉑所致小鼠小腸黏膜損傷起到保護(hù)作用。亮菌多糖作為一種天然藥物對人類的多種疾病療效明顯，多年以來，由于其分離純化困難，分子結(jié)構(gòu)不明確等各種因素限制了其發(fā)展和應(yīng)用，本課題組與合肥誠志生物制藥有限公司合作，提取了純度較為可觀的亮菌多糖，用于亮菌多糖在逆轉(zhuǎn)胃癌前病變的過程作用的研究。

既往研究認(rèn)為胃癌的發(fā)病與家族史、不良生活習(xí)慣、H.pylori感染、相關(guān)藥物使用不當(dāng)以及人體免疫功能下降等因素密切相關(guān)。且胃癌的發(fā)生是一個慢性演變的過程，胃黏膜在各種因素的刺激下，從正常胃黏膜-淺表性胃炎-慢性萎縮性胃炎-腸上皮化生-異性增生逐步發(fā)展成胃癌，因此如何將胃癌抑制在發(fā)展階段，如何有效逆轉(zhuǎn)胃癌前病變成為亟待解決且意義重大的事情。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，研究者開始從分子水平上進(jìn)一步探尋胃癌前病變的發(fā)病及癌變機制。研究表明，在胃癌前病變的形成過程中，DNA甲基化，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，端粒酶激活，EMT的發(fā)生等占有重要的地位[8]，其中EMT與胃癌前病變的形成過程密切相關(guān)，在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[2]。

本研究表明，亮菌多糖可逆轉(zhuǎn)IL-8誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞EMT的發(fā)生，不僅從形態(tài)學(xué)上使其恢復(fù)上皮細(xì)胞的不規(guī)則多邊形，其EMT相關(guān)蛋白E-Cadherin、N-cadherin、Vimentin表達(dá)均得到逆轉(zhuǎn)，細(xì)胞劃痕實驗證明，亮菌多糖可有效抑制GES-1細(xì)胞的擴散侵襲能力，這可能與上皮細(xì)胞因子E-Cadherin表達(dá)增多有關(guān)，E-Cadherin使細(xì)胞間相互粘附聚集，不易向遠(yuǎn)處擴散，連續(xù)觀察24 h，實驗組較模型組細(xì)胞擴散程度明顯減低，本研究表明亮菌多糖可通過逆轉(zhuǎn)EMT對胃癌前病變起治療作用，且可以抑制GES-1細(xì)胞的擴散侵襲，阻止癌變進(jìn)程。PDCD4作為一種新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，Yu et al[9]在胃癌細(xì)胞株GSC-7901和BGC-823中轉(zhuǎn)染入過表達(dá)PDCD4的質(zhì)粒，使PDCD4 mRNA及蛋白均高表達(dá)，然后檢測EMT特異性標(biāo)志物TWIST1、Vimentin、E-Cadherin，結(jié)果顯示間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物TWIST1、Vimentin蛋白及相應(yīng)mRNA均降低，而上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-Cadherin明顯升高，表明PDCD4可逆轉(zhuǎn)EMT，本研究為了進(jìn)一步研究亮菌多糖逆轉(zhuǎn)EMT可能機制，Western blot檢測PDCD4蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果顯示IL-8誘導(dǎo)的模型組較空白對照組明顯降低，而亮菌多糖處理后PDCD4基本恢復(fù)到處理前水平，說明亮菌多糖逆轉(zhuǎn)EMT可能與使PDCD4高表達(dá)有關(guān)，PDCD4的表達(dá)受各種因素的調(diào)節(jié)。DNA甲基化可明顯抑制PDCD4的表達(dá)，Gao et al[10]使用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷阻斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的甲基化，PDCD4基因表達(dá)明顯提高。研究[11]表明，多種微小RNA(miRNA)與PDCD4的表達(dá)相關(guān)，其中miR-21與PDCD4表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)，Wen et al[12]在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株(TE-13)中轉(zhuǎn)染反義miR-21使其表達(dá)明顯減少，結(jié)果顯示與對照組相比轉(zhuǎn)染染反義miR-21的TE-13細(xì)胞中PDCD4表達(dá)明顯升高，且miR-21、miR-23a和miR-27a可協(xié)同抑制PDCD4、抗增殖基因2(BTG2)等抑癌基因的表達(dá)來促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌進(jìn)展，增強其侵襲力，可作為生存期較短的可靠標(biāo)志[13-14]。miR-183過表達(dá)亦可使PDCD4蛋白表達(dá)降低，促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，在食管癌細(xì)胞中可通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)通路來降低miR-183表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)PDCD4[15]。本研究表明ATPS逆轉(zhuǎn)EMT可能與調(diào)高PDCD4表達(dá)有關(guān)，但ATPS到底是通過何種機制上調(diào)PDCD4表達(dá)仍未清楚，下一步擬在基因水平進(jìn)一步探討相關(guān)機制及可能的信號表達(dá)通路。

[1] Hou J,Wang T,Xie Q,et al.N-Myc-interacting protein (NMI) negatively regulates epithelial-mesenchymal transition by inhibiting the acetylation of NF-κB/p65[J].Cancer Lett,2016,376(1):22-33.

[2] Huang L,Wu R L.Epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer[J].Am J Transl Res,2015,7(11):2141-58.

[3] 楊麗紅,葉選怡,凌慶枝,等.亮菌的臨床應(yīng)用與研究進(jìn)展[J].北方藥學(xué),2013,10(3):66-7.

[4] 杜 靜,李 平,孫 鑫,等.亮菌對順鉑化療所誘發(fā)胃腸道反應(yīng)的防治效果[J].中華腫瘤雜志,2011,33(8):579-82.

[5] 王冬青,丁西平,殷 實.實驗性膽汁反流性胃炎大鼠胃黏膜改變及亮菌口服液的干預(yù)作用[J].世界華人消化雜志,2014,22(20):2875-80.

[6] 虞文永,丁西平,胡 聞,等.亮菌口服液對反流液致胃黏膜損傷模型大鼠胃黏膜SOD及IL-8的影響和超微結(jié)構(gòu)的變化[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2014,49(12):1751-4.

[7] 尤 偉,張 梅,李 平,等.亮菌多糖對順鉑致小鼠腸黏膜損傷的保護(hù)作用[J].中國新藥雜志,2013,22(22):2683-7.

[8] Wu Y,Fan Y,Jiang Y,et al.Analysis of risk factors associated with precancerous lesion of gastric cancer in patients from eastern China: a comparative study[J].J Cancer Res Ther,2013,9(2):205-9.

[9] Yu H,Zeng J,Liang X,et al.Helicobacterpyloripromotes epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer by downregulating programmed cell death protein 4 (PDCD4)[J].PLoS One,2014,9(8):e105306.

[10] Gao F,Wang X,Zhu F,et al.PDCD4 gene silencing in gliomas is associated with 5'CpG island methylation and unfavourable prognosis[J].J Cell Mol Med,2009,13(10):4257-67.

[11] 趙莉莉,張 梅,朱耀東.程序性細(xì)胞死亡因子4在腫瘤中的研究進(jìn)展[J].國際腫瘤學(xué)雜志,2017,44(7):512-5.

[12] Wen S W,Zhang Y F,Li Y,et al.Characterization and effects of miR-21 expression in esophageal cancer[J].Genet Mol Res,2015,14(3):8810-8.

[13] Frampton A E,Castellano L,Colombo T,et al.Integrated molecular analysis to investigate the role of microRNAs in pancreatic tumour growth and progression[J].Lancet ,2015,385 Suppl 1:S37.

[14] Frampton A E,Castellano L,Colombo T,et al.MicroRNAs cooperatively inhibit a network of tumor suppressor genes to promote pancreatic tumor growth and progression[J].Gastroenterology,2014,146(1):268-77.e18.

[15] Ren L H,Chen W X,Li S,et al.MicroRNA-183 promotes proliferation and invasion in oesophageal squamous cell carcinoma by targeting programmed cell death 4[J].Br J Cancer,2014,111(10):2003-13.