NLRP3炎癥小體在大腸桿菌血流感染免疫反應(yīng)機制中的作用

朱夢夢，周樹生，劉 寶

血流感染以高死亡率和高發(fā)病率著稱[1]。大腸桿菌是一種常見的和致命的導(dǎo)致血流感染的病原菌之一，同時也是血流感染中最常見的致病性革蘭氏陰性桿菌[2]。研究[3]顯示，Nod樣受體蛋白3[nucleotide-binding domain (NOD)-like receptor protein 3，NLRP3]炎癥小體可能與多種人類疾病有關(guān)。迄今為止，NLRP3炎癥小體是研究最多的炎癥小體，由NLRP3、凋亡相關(guān)的點狀蛋白含CRAD結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing a CARD，ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1)組成的蛋白復(fù)合物,許多微生物病原體可能通過其產(chǎn)物如：毒素、RNA、DNA等激活NLRP3炎癥小體，包括真菌、細菌和病毒等[4]。caspase-1的激活導(dǎo)致專門的白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和白介素18(interleukin-18,IL-18)分泌[5],細胞因子IL-1β和IL-18可以誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)和清除病原微生物。NLRP3炎癥小體在多系統(tǒng)的多種炎癥反應(yīng)中起重要作用[6]，但是在單一大腸桿菌血流感染引起的膿毒癥中免疫反應(yīng)機制尚不清楚，該實驗通過單種革蘭氏陰性細菌(大腸桿菌)血流感染建立膿毒癥模型，探討NLRP3炎癥小體在免疫反應(yīng)機制，為膿毒癥的臨床治療提供一個新的思路。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 60只SPF級健康雌性6周齡C57BL/6J小鼠(20～25 g)，購自安徽省實驗動物中心，飼養(yǎng)于12 h明暗交替SPF級環(huán)境中，實驗開始前適應(yīng)環(huán)境1周。

1.1.2菌株來源 大腸桿菌標準菌株 (ATCC 25922)由安徽省立醫(yī)院臨床微生物實驗室惠贈。

1.1.3實驗主要試劑 IL-1B和IL-18 ELISA測定試劑盒(武漢華美公司)；TRIzol(美國Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司)；熒光定量PCR試劑盒(德國凱杰公司)；RealTime專用八連管(美國ABI公司)；β-actin單克隆抗體(北京中杉金橋生物公司)；NLRP3單克隆抗體、caspase-1 p20單克隆抗體(英國abcam公司)； ASC單克隆抗體(美國CST公司)；通用型二抗、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑(PMSF)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、PVDF膜、脫脂牛奶、ELC發(fā)光液等 Westem blot相關(guān)試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.1.4實驗儀器設(shè)備 高速低溫離心機(美國Beckman公司)；LHP型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 (常州普天儀器制造有限公司)；細菌比濁儀(英國Oxiod公司)；酶標儀、WB電泳儀和電泳槽及濕性轉(zhuǎn)印槽(美國Bio-Rad公司)；RT-PCR分析系統(tǒng)(美國Biosystems 7500)；紫外分光光度計(上海天普分光光度計有限公司)；-80 ℃超低溫冰柜(日本索尼公司)。

1.1.5引物 依據(jù)GenBank中收錄的小鼠肌動蛋白(β-actin) 、NLRP3、ASC、caspase-1 基因序列，利用Primer premier 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計引物用于RT-PCR檢測，PCR引物由上海生工公司合成。各引物序列見表1。

表1 NLRP3炎癥小體基因引物序列

1.2方法

1.2.1菌液培養(yǎng) 將冷凍的大腸桿菌接種在血瓊脂平板上，瓊脂平板在CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，挑取單個的大腸桿菌菌落轉(zhuǎn)移到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖菌12 h。菌液離心后重懸于PBS中，菌液稀釋至2×109cfu/ml作為最適感染濃度[7]。

1.2.2模型建立 實驗動物分成3組(對照組、血流感染24 h組、血流感染48 h組)，每組20只，血流感染組小鼠分別麻醉后經(jīng)尾靜脈注射菌液0.1 ml/10 g,對照組小鼠注射等量的PBS。血流感染24 h組、血流感染48 h組分別于感染后24 h和感染后48 h安樂死處死小鼠，對照組在實驗開始時即安樂死處死小鼠。

1.2.3ELISA法檢測細胞因子 檢測血清及肺、腎、肝組織勻漿中IL-1Β及IL-18的含量，嚴格按照ELISA檢測試劑盒的操作說明進行操作，分別檢測各標本在480 nm處的吸光度(optical density，OD)值，用標準品的濃度和OD值做標準曲線，根據(jù)樣本的吸光度值和線性回歸方程得出濃度值，樣本濃度=實測濃度×稀釋倍數(shù)。

1.2.4實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA的表達 所有物品經(jīng)DEPC水消毒，分別取血流感染組小鼠和對照組小鼠的組織(肝、腎、肺)50～100 mg放入勻漿器中，加入1 ml 預(yù)冷的TRIzol，徹底研磨后按RNA提取試劑盒說明書提取RNA。取2 μl mRNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)的cDNA,以β-actin 作為內(nèi)參，cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為cDNA 2 μl,上下游引物各0.8 μl，滅菌蒸餾水6 μl，ROX Reference DyeⅡ0.4 μl，共20 μl的反應(yīng)體系。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，總共進行40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析計算出相對表達量。

1.2.5Western blot 法檢測小鼠組織中NLRP3、ASC、caspase-1 p20蛋白表達水平 分別取血流感染組和對照組小鼠組織100 mg放于勻漿器底部，分別加入RIPA裂解液1 ml和蛋白酶抑制劑10 μl在冰上研磨裂解，4 ℃、12 000 r/min離心20 min,按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行蛋白定量后，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(4 ∶1體積)，100 ℃變性10 min后-20 ℃保存。NLRP3及β-actin 蛋白用10%分離膠，ASC、caspase-1 p20蛋白用12%分離膠，4種蛋白都用5%濃縮膠。濃縮膠80 V，分離膠120 V進行電泳，根據(jù)預(yù)染 Marker指示，轉(zhuǎn)移相應(yīng)蛋白到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉液封閉，室溫1 h，封閉后分別用抗NLRP3、ASC、caspase-1抗體1 ∶1 000、β-actin 抗體1 ∶1 000孵育過夜，TBST洗滌3次,每次15 min，孵育二抗辣根過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG 1 ∶20 000，室溫1 h ，TBST 洗滌3次,每次15 min，用ECL曝光、顯影，用Image J軟件分析測定其灰度值。

1.2.6HE染色 新鮮的小鼠組織(肝、腎、肺)用福爾馬林固定48 h后行石蠟包埋，切片，按HE染色步驟染色后置于光鏡下觀察并攝片，病理炎癥評分(PIS)用于HE染色后的組織急性炎癥評分,主要評估各組織切片HE染色后炎癥細胞的浸潤(主要為中性粒細胞和巨噬細胞)。

2 結(jié)果

2.1大腸桿菌血流感染小鼠組織切片HE染色大腸桿菌血流感染后的小鼠組織(肝、腎、肺)切片HE染色顯示均有炎癥細胞浸潤、細胞壞死和組織膿腫，且感染后48 h處死組的炎癥細胞浸潤、組織細胞壞死較24 h組更為嚴重，與同時段同組別的腎和肺組織相比，肝組織的炎癥反應(yīng)(炎癥細胞浸潤、組織細胞壞死)較為嚴重，見圖1。感染組小鼠組織病理炎癥評分(PIS評分)明顯高于對照組，其中48 h組較24 h組PIS評分明顯增高，見圖2。

圖1 各組小鼠組織切片 HE染色×400

2.2大腸桿菌血流感染小鼠組織及血清中IL-18及IL-1β表達水平IL-18在3組血液、肝臟、腎臟、肺組織中的表達量不完全相同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=888.486、581.820、638.689、2 037.61，P<0.05)。IL-1Β在3組血液、肝臟、腎臟、肺組織中的表達量不完全相同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1 316.75、1 339.9、5 269.836、4 588.62，P<0.05)。與對照組比較，24 h組和48 h組肝、腎、肺組織勻漿中的IL-18和IL-1β水平均明顯升高，其中肺組織中48 h組IL-18表達水平較24 h組明顯上升，腎組織中48 h組IL-1β表達水平較24 h組明顯上升(P<0.05)；24 h組和48 h組血液中IL-18表達水平也明顯升高，24 h組血液中IL-1β明顯升高(P<0.05)，而48 h組血液中IL-1β沒有明顯升高，見表2、圖3～4。

2.3組織勻漿中NLRP3、ASC、caspase-1mRNA表達水平與對照組相比，感染后24 h肝、肺組織勻漿中NLRP3、ASC、caspaase-1 mRNA表達水平明顯增高(P<0.05)，而腎組織勻漿中的NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表達水平在感染后48 h明顯升高(P<0.05)，見圖5。

圖2 各組小鼠組織切片HE染色PIS評分

組別IL-18(pg/ml)血肝腎肺IL-1β(pg/ml)血肝腎肺對照2.21±0.3332.52±2.8435.60±2.5031.26±2.329.96±0.560.99±0.158.30±1.109.33±1.0924 h9.81±0.54?148.32±12.95?149.86±12.56?60.65±1.48?55.18±3.86?2 495.17±191.19?784.85±23.37?526.12±20.60?48 h8.29±0.38#145.50±7.02#136.68±4.41#109.83±3.95#9.64±0.68#1 836.22±29.16#2 185.52±79.90#183.87±5.12#

與對照組比較：*P<0.05;與24 h組比較：#P<0.05

圖3 各組小鼠血液及組織勻漿中IL-18表達

圖4 各組小鼠血液及組織勻漿中IL-1β表達

圖5各組小鼠組織中NLRP3、ASC、caspase-1mRNA表達

A:NLPR3；B:ASC；C:caspase-1；1：對照組；2:24 h組；3:48 h組；與對照組比較：*P<0.05;與24 h組比較：#P<0.05

2.4小鼠組織中NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1p20蛋白表達水平與正常對照組相比，24 h組和48 h組蛋白表達水平均有升高(P<0.05)。肝、肺、腎組織中NLRP3蛋白、ASC蛋白在48 h組中表達量比在24 h組中表達量要明顯升高(P<0.05)，而pro-caspase-1 在肝腎組織中3組表達量沒有明顯區(qū)別，caspase-1蛋白在肺腎組織中表達量隨時間推移表達量上升，見圖6～7。

圖6 各組小鼠組織中NLRP3、ASC、caspase-1 蛋白表達

圖7 各組小鼠組織中NLRP3、ASC、caspase-1、pro-caspase-1蛋白表達

3 討論

血流感染(bloodstream infection，BSI)是一種由于血液中微生物，通常是細菌或真菌的存在引起的危及生命的疾病。由多種細菌導(dǎo)致的細菌血流感染可能是社區(qū)獲得性的也可能是醫(yī)源性的，引起了全世界范圍內(nèi)的高患病率和高死亡率[6]。一項以人群為基礎(chǔ)的研究[8]顯示大腸桿菌一直是BSI最常見的病原菌。炎癥小體是導(dǎo)致有生物學(xué)活性的IL-1β釋放的細胞質(zhì)多蛋白復(fù)合物，其中最有代表性的就是NLRP3炎癥小體[5]。NLRP3炎癥小體是一種調(diào)節(jié)促炎細胞因子IL-18和IL-1β成熟的多蛋白復(fù)合物。NLRP3炎癥小體包括NOD樣蛋白NLRP3，適配器蛋白ASC和caspase-1，在內(nèi)源性和外源性刺激下，NLRP3通過激活NLRP3并招募ASC和pro-caspase-1，導(dǎo)致caspase-1激活，隨后將前IL-1β和前IL-18加工成其活性形式[9]。大腸桿菌血流感染可以導(dǎo)致膿毒癥，目前膿毒癥是ICU 死亡的主要原因，盡管衛(wèi)生保健的進步，膿毒癥的發(fā)病率和死亡率依舊很高。作為炎癥小體的成員之一的NLRP3炎癥小體感知細菌、病毒、真菌等病原體相關(guān)分子模式觸發(fā)炎癥反應(yīng)?；罨腘LRP3炎癥小體可以招募炎癥細胞到感染或受傷部位并誘導(dǎo)IL-1β和IL-18成熟和分泌。因此，NLRP3炎癥小體在微生物誘導(dǎo)的膿毒癥中起重要作用[10]。

國內(nèi)目前最常用的膿毒癥模型是盲腸結(jié)扎-穿孔(cecum ligation - perforation，CLP)模型，主要優(yōu)點之一是易于標準化，還可以引入多種不同的變量，缺點是不能控制感染的細菌種類。同時，比較常用的膿毒癥模型還有腹腔細菌接種、腹腔注射人糞便懸液、細菌或內(nèi)毒素血癥模型、燒傷膿毒癥模型、腹膜炎膿毒癥等多種膿毒癥模型[11]。本課題組采用的是單種菌株靜脈注射建立膿毒癥模型，可以人為的控制感染劑量，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，更好的研究單一菌株對NLRP3炎癥小體表達的影響，同時，該模型本身也存在一定的局限性，一過性的輸入大量細菌可以引起動物的快速耐受或死亡，與臨床感染灶細菌持續(xù)釋放有一定的出入。本課題組前期研究[12]建立了簡單易行的尾靜脈或腹腔注射金黃色葡萄球菌，并成功摸索最適感染濃度，造成穩(wěn)定的血流感染模型，為其他特定細菌或者多種已知細菌混合感染的研究奠定了基礎(chǔ)。

Luo et al[9]通過CLP膿毒癥模型發(fā)現(xiàn)血紅素在膿毒癥誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體調(diào)節(jié)的急性肺損傷中起重要的保護作用。Zhang et al[13]研究發(fā)現(xiàn)在膿毒癥小鼠中co通過釋放分子3抑制心臟成纖維細胞中NLRP3炎癥小體的活化來改善心肌功能。本課題組前期研究[14]顯示在金葡菌誘導(dǎo)的血流感染中NLRP3炎癥小體的表達呈上調(diào) ，這為課題后期的實驗研究奠定了基礎(chǔ)。

本研究建立了大腸桿菌血流感染的小鼠膿毒癥模型，通過HE染色證明了感染組小鼠肝、腎、肺組織的炎癥反應(yīng)和細胞壞死，不同組織間炎癥反應(yīng)略有差異，如肝組織中炎癥細胞浸潤和細胞壞死與同組肝腎組織相比較為嚴重；一定時間內(nèi)隨著感染后時間的推移，組織的感染越來越嚴重。Duan et al[7]的研究與本研究有相似的研究結(jié)果，感染后24 h肝組織表現(xiàn)出小部分的炎癥改變，感染后2、3和5 d有更大、更多的組織損傷。

IL-18和IL-1β作為NLRP3 炎癥小體裂解活化的產(chǎn)物，ELISA結(jié)果顯示感染組小鼠血清和組織勻漿中IL-18和IL-1β水平均明顯升高；Kang et al[15]研究結(jié)果與本研究有著相似之處，鮑曼不動桿菌桿菌感染后的小鼠IL-1β表達量升高，結(jié)果表明在鮑曼不動桿菌感染的巨噬細胞中，NLRP3和ASC與caspase-1活化和IL-1β成熟有關(guān)。

通過RT-qPCR法和Western blot 法分別檢測到感染組NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA和蛋白的表達量均有升高，而且不同組織中基因和蛋白的表達量稍有差異，同一組織中不同的基因和不同的蛋白的表達也不同。

綜上所述，本實驗顯示大腸桿菌血流感染導(dǎo)致的膿毒癥中NLRP3炎癥小體的表達程現(xiàn)升高趨勢，且在一定時間范圍內(nèi)有隨時間推移表達增高趨勢，這表明了NLRP3炎癥小體在大腸桿菌血流感染中發(fā)揮了一定的調(diào)節(jié)作用。由于臨床血流感染微生物的多樣性和復(fù)雜性，NLRP3炎癥小體在不同細菌、病毒、真菌血流感染中的作用有待進一步研究,同時NLRP3炎癥小體的作用機制尚需深入研究。

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