SAHA聯(lián)合厄洛替尼對EGFR-TKI耐藥肺癌細(xì)胞株H1975的生長抑制作用及機(jī)制

陳立豪，郝吉慶

肺癌是發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤，全球每年約有150萬人患病，5年生存率不足20%，依據(jù)組織學(xué)分型，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC) 約占80%[1-2]。隨著癌癥的個(gè)體化治療及精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的提出，基于腫瘤患者的驅(qū)動(dòng)基因突變檢測在腫瘤診斷和治療過程中有著重要的影響。在亞裔、不吸煙、女性、腺癌患者中表皮生長因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因的突變率較高，約占50%，尤其在我國EGFR突變率為30%，常為外顯子19缺失突變(del 19)及外顯子21的替換突變(L858R)[3];臨床上具有EGFR突變的患者在使用針對EGFR突變的靶向藥物如特羅凱(厄洛替尼)、易瑞沙(吉非替尼)等時(shí)，早期絕大部分患者都取得不錯(cuò)的臨床效果，但在經(jīng)過治療一段時(shí)間后都會(huì)無法避免地出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致治療失敗[4]。除了基因的改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的關(guān)系，表觀遺傳的改變也起著重要的作用。近年來研究[5]證實(shí)，異常的DNA甲基化和組蛋白修飾等表觀遺傳學(xué)的改變，在腫瘤的發(fā)展中有著至關(guān)重要的作用。組蛋白去乙?；? histone deacetylase，HDAC) 抑制劑通過抑制組蛋白及非組蛋白的去乙酰化，從而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等來發(fā)揮抗腫瘤作用。該研究通過體外單藥及聯(lián)合用藥對肺腺癌表皮生子因子酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)靶向耐藥細(xì)胞株H1975的增殖、侵襲影響，探討HDAC抑制劑伏立諾他 (vorinostat，SAHA)與厄洛替尼聯(lián)合對肺癌細(xì)胞是否具有協(xié)同抑制作用以及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料人肺腺癌H1975細(xì)胞株購自上海中科院細(xì)胞庫；RPMI-1640購自美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物科技公司；CCK-8試劑盒購自北京索萊寶科技公司；Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠購自康寧(中國)科技有限公司；SAHA 及厄洛替尼均購自美國 Selleck 公司；Western blot化學(xué)發(fā)光劑購自美國Millipore 公司；磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(the serine-threonine kinase，AKT)、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(phosphorylated serine-threonine kinase，p-AKT)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin，mTOR)、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR)抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) H1975細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素(100 U/ml)的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在 37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞融合80%時(shí)進(jìn)行傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2CCK-8 取對數(shù)生長期的細(xì)胞,以約5 000細(xì)胞每孔接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜后待細(xì)胞完全貼壁后分為4組作用：① 對照組(不加藥)；② SAHA組(0.25、0.5、1、2、4、8、16 μmol/L)；③ 厄洛替尼組(0.25、0.5、1、2、4、8、16 μmol/L)；④ SAHA+厄洛替尼組(SAHA 0.25 μmol/L/L+厄洛替尼 0.25μmol/L, SAHA 0.5 μmol/L+厄洛替尼0.5 μmol/L以此類推)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，藥物作用48 h后，每個(gè)孔加入10 μl CCK-8溶液，培養(yǎng)2 h，在酶標(biāo)儀測450 nm處吸光度(absorbance，A)值，并計(jì)算細(xì)胞存活率(survival rate,SR)，試驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率(%)=(試驗(yàn)組A/對照組A)×100%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對于后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用SAHA 3 μmol/L，厄洛替尼 19 μmol/L,SAHA( 2 μmol/L)+厄洛替尼(2 μmol/L)。

1.2.3平板克隆實(shí)驗(yàn) 將對數(shù)生長期細(xì)胞，用胰酶消化后吹散成單細(xì)胞懸液，取500個(gè)每個(gè)孔接種于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后，分為4組：① 對照組；② SAHA組;③ 厄洛替尼組；④ SAHA+厄洛替尼聯(lián)合用藥組。每3 d更換一次培養(yǎng)液至細(xì)胞集落形成，終止培養(yǎng)。棄培養(yǎng)液，PBS 液洗2次后，純甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染色30 min，空氣干燥后，顯微鏡下計(jì)數(shù)形成的克隆數(shù)(≥50個(gè)細(xì)胞為一個(gè)克隆) ，計(jì)算各組克隆形成率?？寺⌒纬陕?%)=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) 將分裝好的Matrigel膠(4 ℃)放置過夜使之溶解, 用 4 ℃預(yù)冷的無血清培養(yǎng)液稀釋至1 mg/ml,取稀釋的 Matrigel膠100 μl加入到Transwell小室的上室, 將鋪膠后的Transwell小室于 37 ℃溫育至少2 h, 以使凝膠形成。胰酶消化4組經(jīng)過藥物作用48 h后細(xì)胞，并收集細(xì)胞, 用PBS洗滌細(xì)胞3次, 用無血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。取 100 μl的細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)約8 000個(gè))加入上室,在 Transwell小室的下室加入含培養(yǎng)液700 μl,37 ℃培養(yǎng)24 h。取出上室, 用棉簽擦掉上層細(xì)胞, 加入甲醇固定 3 min, 棄固定液, 加入 0.1%結(jié)晶紫染液, 染色 20 min, 雙蒸水洗3遍, 熒光顯微鏡下拍照，隨機(jī)選取3個(gè)視野計(jì)算，取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5Western blot法 各組細(xì)胞處理48 h后收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的RIPA 裂解液( 含PMSF及磷酸化酶抑制劑) 將細(xì)胞重懸，于冰上裂解30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清液行Bradford 法蛋白濃度測定，然后行SDS-PAGE 電泳，Western blot法轉(zhuǎn)移蛋白，一抗4 ℃過夜，二抗37 ℃孵育2 h，應(yīng)用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影，電泳條帶用用掃描儀采集X線片圖像，使用Quantity One 軟件，以β-actin為內(nèi)參照，對各目的條帶進(jìn)行密度分析。

2 結(jié)果

2.1SAHA、Erlotinib單藥及聯(lián)合用藥對H1975細(xì)胞存活率的影響CCK8結(jié)果顯示，藥物作用48 h后，SAHA組(1、2、4、8、16 μmol/L)較對照組細(xì)胞抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.794、16.429、42.212、209.000、143.760，P<0.05)；Erlotinib組(1、2、4、8、16 μmol/L)較對照組細(xì)胞抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.379、8.220、15.057、18.187、42.500，P<0.05)；聯(lián)合用藥組(1、2、4、8、16 μmol/L)較對照組細(xì)胞抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=79.674、67.278、75.215、 71.279、108.098，P<0.05)；可見隨藥物濃度增加，藥物對細(xì)胞的抑制作用也逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)濃度依賴性。SAHA和Erlotinib對H1975細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)值分別為(3.16±0.33)和(19.31±2.53)μmol/L，而聯(lián)合用藥組IC50值為(2.11±0.25)μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=127.299，P<0.05)，見圖1。不同濃度的SAHA聯(lián)合Erlotinib抑制劑處理H1975細(xì)胞48 h后，兩藥聯(lián)合后增殖抑制作用明顯增強(qiáng)，各聯(lián)合藥物劑量組的聯(lián)合指數(shù)(combination index，CI)均<1，表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)(圖2)。

2.2SAHA、Erlotinib單藥及聯(lián)合用藥對H1975腫瘤細(xì)胞的克隆形成SAHA組對細(xì)胞克隆形成率為41.90%，Erlotinib組形成率48.11%，而聯(lián)合用藥組17.89%。結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組較單藥組能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的克隆形成，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.350，P<0.001)，見圖3。

2.3SAHA、厄洛替尼單藥及聯(lián)合用藥對H1975細(xì)胞侵襲能力的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：SAHA組及Erlotinib組細(xì)胞侵襲能力較對照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.072、3.838，P<0.05)；兩藥聯(lián)合組與單藥組細(xì)胞相比，細(xì)胞侵襲到Transwell 小室Matrigel 膠下面的細(xì)胞數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.350，P<0.05)，見圖4。

圖1 SAHA、厄洛替尼單藥及聯(lián)合用藥對H1975細(xì)胞的增殖活力作用

圖2 SAHA聯(lián)合Erlotinib 對H1975細(xì)胞的聯(lián)合作用效應(yīng)

圖3 SAHA、Erlotinib單藥及聯(lián)合用藥對H1975腫瘤細(xì)胞的克隆率形成

1：對照組；2：SAHA組；3：厄洛替尼組；4：SAHA+厄洛替尼組；與對照組比較：**P<0.01；與SAHA組比較：###P<0.001；與厄洛替尼組比較：△△△P<0.001

圖4 Transwell 小室培養(yǎng)48 h后各組遷移到下室的細(xì)胞結(jié)晶紫染色圖 ×200

A：對照組；B：SAHA組；C：厄洛替尼組；D：SAHA+厄洛替尼組；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與SAHA組比較：##P<0.001；與厄洛替尼組比較：△△△P<0.001

2.4SAHA、Erlotinib單藥及聯(lián)合用藥對H1975細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT/mTOR信號通路影響H1975細(xì)胞經(jīng)過藥物處理48 h后，應(yīng)用Western blot檢測研究結(jié)果顯示：PI3K蛋白表達(dá)在各處理組都有明顯降低；p-AKT蛋白表達(dá)量在SAHA組降低，而Erlotinib組無明顯改變；p-mTOR蛋白表達(dá)量在各組都降低。兩藥聯(lián)合組較其余各組PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)量均明顯減低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=84.198、349.523、119.197，P<0.01)，見圖5。

3 討論

肺癌由于早期癥狀不典型，大部分患者在診斷時(shí)已處于中晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)。化療和靶向治療是晚期NSCLC患者的主要治療手段。相對于傳統(tǒng)化療，靶向藥物具有副反應(yīng)輕、選擇性較高、耐受性好、服用方便、依從性高等特點(diǎn)[6]。EGFR是原癌基因HER1表達(dá)產(chǎn)物，為一跨細(xì)胞膜糖蛋白，屬于酪氨酸激酶受體，在多種腫瘤中均可發(fā)現(xiàn)EGFR的高表達(dá)或異常表達(dá)。EGFR-TKI如厄洛替尼等，通過與EGFR結(jié)構(gòu)域中的ATP結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，阻斷EGFR下游信號通路的傳導(dǎo)，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用；還可以抑制絲裂原活化蛋白激酶的活化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡以及抑制腫瘤細(xì)胞的血管形成。對于EGFR突變陽性患者有明顯療效，使患者無進(jìn)展生存期顯著提高。但絕大部分患者都不可避免的在一年內(nèi)出現(xiàn)耐藥，導(dǎo)致病情惡化。常見的耐藥機(jī)制是T790M突變(50%)、MET基因擴(kuò)增(20%)等[7]，盡管臨床上對于一代靶向藥物的耐藥而開發(fā)出二代、三代靶向藥物，但是大部分患者使用一段時(shí)間后效果并不是非常理想，故對于這些EGFR-TKI治療失敗的患者該如何治療是臨床醫(yī)師比較棘手的問題。

圖5 藥物對H1975細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響

1：對照組；2：SAHA組；3：厄洛替尼組；4：SAHA+厄洛替尼組；與對照組比較：**P<0.01，***P<0.001；與SAHA組比較：###P<0.001；與厄洛替尼組比較：△△△P<0.001

表觀遺傳是指基因表達(dá)或蛋白質(zhì)的表達(dá)改變不涉及堿基序列的變化，但可以穩(wěn)定遺傳的現(xiàn)象。越來越多的研究[8]表明，隨著年齡增長、外界環(huán)境刺激等因素，細(xì)胞的正常表觀遺傳狀態(tài)會(huì)被打破，導(dǎo)致癌基因的異常激活或抑癌基因的失活，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。表觀遺傳修飾主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA的調(diào)控、染色質(zhì)重塑等[9]。近年來隨著對表觀遺傳學(xué)研究,組蛋白的異常修飾調(diào)節(jié)與腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系；正常情況下組蛋白處于乙?；叭ヒ阴；膭?dòng)態(tài)平衡之中，乙?；芙M蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶調(diào)控；去乙?；瘎t受HDAC的調(diào)控。在腫瘤細(xì)胞中，HDAC活性明顯增強(qiáng)，平衡狀態(tài)打破，使得抑癌基因表達(dá)下調(diào)的同時(shí)致癌基因表達(dá)上調(diào)[10]。

HDAC抑制劑作為一種高效低毒的靶向抗腫瘤藥物正日益引起人們的關(guān)注。 它可以通過抑制HDACs，調(diào)節(jié)組蛋白和非組蛋白的乙?；?，從而達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的，以逆轉(zhuǎn)變異細(xì)胞的表型、抑制細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯、分化、通過內(nèi)源性和外源性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制血管生成和腫瘤侵襲等[11]。SAHA是一種廣譜的組蛋白抑制劑，于2006年被FDA批準(zhǔn)上市，用于病情惡化或病情反復(fù)者的皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的治療。當(dāng)其他藥物治療效果不佳時(shí)，該藥表現(xiàn)出良好的耐受性[12]。研究[13]表明，SAHA和卡鉑、紫杉醇還可聯(lián)合治療晚期非小細(xì)胞肺癌,并且SAHA在多項(xiàng)腫瘤的聯(lián)合化療中均顯示出其協(xié)同或增強(qiáng)作用。

本研究選用具有T790M突變的肺癌細(xì)胞株H1975，探討兩藥體外聯(lián)合應(yīng)用對肺癌細(xì)胞的影響及作用機(jī)制，結(jié)果顯示SAHA與厄洛替尼聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用，同單獨(dú)用藥組比較能夠顯著抑制H1975腫瘤細(xì)胞的生長增殖、克隆及侵襲能力；同時(shí)由于PI3K/AKT/mTOR信號傳導(dǎo)通路的過渡激活與腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、抗凋亡有著重要的關(guān)系；本研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組對PI3K/AKT/mTOR信號通路有著顯著的抑制作用。

綜上所述，厄洛替尼聯(lián)合HDAC抑制劑SAHA對具有T790M突變的H1975細(xì)胞株具有良好的協(xié)同作用，可增強(qiáng)細(xì)胞對厄洛替尼的敏感性，為臨床上對于EGFR-TKI 獲得性耐藥患者的治療提供新的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)及治療策略。但本實(shí)驗(yàn)僅為初步的體外細(xì)胞研究，尚需進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證其在體內(nèi)的有效性及安全性。

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