維甲酸相關孤核受體α(RORα)在奧曲肽抗大鼠肝纖維化中的作用

龔義飛，張 超，何新苗，駱會來，張慧平，張 沖

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是一種慢性炎性反應過程，研究[1]顯示乙型肝炎等病毒、自身免疫性肝損害、酒精肝等多種因素會導致肝臟內(nèi)多種炎性細胞因子，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素(interleukin 1，IL-1)、IL-6等釋放增多，從而導致匯管區(qū)內(nèi)纖維細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細胞、肝星狀細胞( hepatic stellate cell ，HSC)轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞，激活的成纖維細胞、HSC會分泌大量的膠原蛋白，彌漫性分布于肝細胞內(nèi)，最終導致細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)增多、肝功能受損、肝臟纖維化以及肝硬化。研究[2]表明肝纖維化具有可逆性，大量藥物應用于肝纖維化的防治，其中奧曲肽(octreotide ，OCT)可減輕多種因素導致的組織損傷，具有顯著的細胞保護作用。而維甲酸相關孤核受體α(retinoid-related orphan receptor α，RORα) 可能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、參與炎性反應等機制在肝纖維化發(fā)生中的可能起到了至關重要的作用[3]。該實驗觀察OCT對用四氯化碳(CCl4)建立大鼠肝纖維化模型的肝細胞表達的影響，研究OCT是否通過減少RORα下降的程度來減輕大鼠肝細胞損害。

1 材料與方法

1.1實驗材料本實驗選用成年清潔雄性SD大鼠36只，220～260 g(購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心)；CCl4(無錫展望化工試劑有限公司)及橄欖油(國藥集團化學試劑有限公司)，按容積比4 ∶6配制成40%混合溶液；OCT(0.1 mg/ml，瑞士Novartis Phama Schwaiz公司)用生理鹽水稀釋成0.1、1 mg/ml；透明質(zhì)酸( hyaluronic acid，HA)ELISA測定試劑盒和大鼠層粘連蛋白(Laminin，LN)ELISA測定試劑盒和大鼠Ⅲ型前膠原氨基端原肽(N-terminal procollagen Ⅲ propeptide，PⅢNP)ELISA測定試劑盒和大鼠Ⅳ型膠原(collagen Ⅳ，COL4)ELISA測定試劑盒(伊萊瑞特生物科技有限公司)；BCA 蛋白濃度測定試劑盒和ECL發(fā)光試劑(上海碧云天生物技術研究所)；抗β-actin抗體以及二抗(北京中杉金橋生物技術公司)；抗α平滑肌蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，抗RORα一抗及單克隆抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組及建立模型 大鼠正常喂養(yǎng)1周后隨機分成對照組、模型組和OCT治療組，每組12只。模型組及OCT治療組的大鼠皮下注射40% CCl43 ml/kg，每周2次；OCT治療組的大鼠腹部皮下注射OCT 100 ng/100 g，每日2次；對照組和模型組均予以注射等量生理鹽水。給藥8周后處死大鼠并采集標本。

1.2.2形態(tài)學及病理學觀察 取大鼠肝臟左葉大體觀察肝臟形態(tài)、質(zhì)地、色澤，甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋切片，行HE 和VG 染色。顯微鏡下觀察肝臟病理組織學改變及肝臟膠原纖維的情況，每張切片隨機選取5個400倍的不連續(xù)視野，每個組別的炎癥活動和肝組織纖維化程度通過Ishak評分標準進行分析和比較，按評分及相應的分值判定病情的輕重，即：A碎屑樣壞死(0～4 分)；B融合性壞死(0～6分)；C點狀壞死、凋亡小體和灶性炎癥(0～4 分)；D匯管區(qū)炎癥(0～4分)。該評分系統(tǒng)中，纖維化水平的分期標準是按肝組織纖維增生的程度給以相應的分值(0～6分)[4]。

1.2.3肝臟血清學檢測 通過全自動生化分析儀測定大鼠血清肝功能谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)的含量，按照試劑盒說明書操作通過ELISA法測定HA、LN、PⅢNP、COL4含量。

1.2.4Western blot法檢測 使用玻璃勻漿器將冷凍的大鼠肝細胞勻漿并且離心取上清液。BCA 法測定蛋白含量，統(tǒng)一樣本蛋白總量。按Western blot操作流程進行檢測，用Quantity One軟件分析β-actin、α-SMA，RORα各條帶灰度值，差異性分析蛋白表達量。

2 結(jié)果

2.1大鼠肝臟大體標本及病理學檢測結(jié)果大體標本檢測結(jié)果：對照組大鼠肝臟表面顏色鮮紅，表面光滑，邊緣銳利，質(zhì)地柔軟；模型組大鼠肝臟表面出現(xiàn)結(jié)節(jié)狀改變，邊緣圓鈍，質(zhì)地較硬，色澤淺，纖維化明顯，；OCT治療組大鼠肝臟表面色澤較紅，邊緣較銳利，質(zhì)地較軟。病理學檢測結(jié)果：對照組肝組織炎性細胞較少，罕見凋亡小體，極少量的膠原纖維分布于匯管區(qū)周圍，肝細胞條索狀排列結(jié)構(gòu)正常；模型組肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，匯管區(qū)及小葉纖維增生，肝細胞脂肪變性，同時伴有片狀壞死，伴有單核細胞、淋巴細胞、嗜酸性細胞浸潤；OCT治療組可見肝細胞腫脹，氣球樣變，大量點狀壞死，少量碎片狀壞死，少量的肝組織炎性細胞浸潤大多數(shù)細胞排列結(jié)構(gòu)清晰，細小的膠原纖維圍繞著小血管和匯管區(qū)。見圖1。

2.2Ishak評分結(jié)果模型組及OCT治療組肝細胞炎癥活動度及纖維化程度較對照組均明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，OCT治療組評分有顯著降低(P<0.05)。見表1、2。

2.3大鼠血清生化指標及肝纖維化檢測結(jié)果與對照組比較，模型組和OCT治療組血清AST 、ALT 、HA、LN、PⅢNP、COL4含量水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，OCT治療組血清AST 、ALT 、HA、LN、PⅢNP、COL4含量水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

圖1 大鼠肝臟HE和VG染色結(jié)果 ×400

組別炎癥活動度評分0～34～67～910～1415～18秩均值對照1200006.5模型0039128.46??OCT0273021.25??#H值-----28.990P值<0.01

與對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05

表2 大鼠肝臟纖維化程度Ishak評分

與對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05

2.4RORα蛋白檢測結(jié)果各組之間肝組織RORα蛋白表達量不完全相同，差異有統(tǒng)計學意義(F=37.79、45.99，P<0.01)。與對照組比較，模型組大鼠肝組織RORα蛋白的表達水平明顯下降(P<0.01)。OCT治療后，RORα蛋白表達水平明顯上升(P<0.05)。見圖2。

3 討論

圖2 大鼠肝組織RORα蛋白表達量

與對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05

肝細胞損傷是肝臟纖維化形成的重要原因，一方面是間質(zhì)細胞，如HSC誘導肝纖維化的促進因素，另一方面也是細胞因子，如TGF-b1促進肝纖維化的重要因素[5]。而生長抑素(somatostatin，SST)是一種環(huán)形14肽類激素，由下丘腦釋放，目前已廣泛應用于重癥胰腺炎和肝硬化所致的上消化道出血等疾病的治療[6]，OCT 是SST 的一種衍生物，與SST 有類似的理化性質(zhì)，使用OCT 可以抑制循環(huán)中內(nèi)毒素的水平，并且下調(diào)循環(huán)中的炎癥介質(zhì)，有保護細胞的作用[7]。相關研究[8]表明，RORα可預防肝纖維化的發(fā)生，一方面，通過影響靶基因的表達，調(diào)控脂代謝過程中的重要物質(zhì)，保持脂代謝平衡。另一方面RORα在肝臟炎性反應中也發(fā)揮了至關重要的作用，其表現(xiàn)為抑制了肝臟的炎性反應，減輕肝臟炎性反應帶來的肝臟功能損傷[9]。HSC是肝臟纖維化形成的一種核心細胞，研究[5]表明，多種因素均可導致其增殖、活化及分泌ECM，參與肝纖維化的形成。其增殖的一個核心機制是活化Wnt信號通路[10]。而磷酸化后的RORα可減少各種轉(zhuǎn)錄輔助因子和RNA聚合酶Ⅱ在β連環(huán)蛋白(β-catenin)與相關靶向基因啟動子結(jié)合處的聚合，進而阻止Wnt/β-catenin信號的傳導，抑制β-catenin被激活，減少了相關產(chǎn)物基因的表達[11]，為RORα參與抗肝纖維化提供了可能。但RORα與奧曲肽抗肝臟纖維化中的具體關系未見報道。本實驗通過CCl4建模的大鼠，病理可見肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，匯管區(qū)及小葉纖維增生，肝細胞脂肪變性，同時伴有片狀壞死，伴有單核細胞、淋巴細胞、嗜酸性細胞浸潤。血清AST 、ALT 、HA、LN、PⅢNP、COL4含量水平明顯升高，RORα蛋白的表達水平明顯下降，使用 OCT治療后可見肝細胞腫脹，氣球樣變，伴有大量點狀壞死及少量碎片狀壞死，少量肝組織炎性細胞浸潤，大多數(shù)細胞排列結(jié)構(gòu)清晰，細小的膠原纖維圍繞著小血管和匯管區(qū)。血清AST 、ALT 、HA、LN、PⅢNP、COL4含量水平顯著降低，RORα蛋白表達水平明顯上升。說明OCT治療肝纖維化大鼠療效確切，同時減少了RORα下降的程度，也提示RORα具有抗肝纖維化的作用。

表3 大鼠血清生化指標及肝纖維化檢測結(jié)果

與對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05

[1] 張 碩.根皮苷抗血吸蟲病肝纖維化的作用及機制研究[D].長沙：湖南師范大學，2012.

[2] Ancha H,Ojeas H,Tedesco D,et al.Somatostain-induced gastric protection against ethanol：involvement of nitric oxide and effects on gastric mucosal blood flow[J].Regul Pept,2003,110(2):107-13.

[3] Fitzsimmons R L,Lau P,Muscat G E.Retinoid-related orphan receptor alpha and the regulation of lipid homeostasis[J].J Steroid Biochem Mol Biol,2012,130(3/4/5)：159-68.

[4] Ishak K,Baptista A,Bianchi L,et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis[J]. Hepatol,1995,22:696-9.

[5] 姚 磊,張 超,李方躍,等.奧曲肽對實驗性肝纖維化大鼠瘦素及功能性瘦素受體表達的影響[J].安徽醫(yī)科大學學報,2012,47(7):800-4.

[6] Zhang C，Xu J M，Kong D R，et al. Immediate effects of different schedules of somatostatin on portal pressure in patients with liver cirrhosis[J]. Clin Pharm Ther，2013,38(3):206-11.

[7] Wang G,Wen J,Wilbur R R,et al. The effect of somatostatin，ulinastatin and salvia miltiorrhiza on severe acute pancreatitis treatment[J]. Am J Med Sci,2013,346(5)：371-6.

[8] Jetten A M，Kang H S，Takeeda Y.Retinoic acid-related orphan receptors α and γ：key regulators of lipid/glucose metabolism,inflammation,and insulin sensitivity[J].Front Endocrinol(Lausanne),2013,4:1.

[9] McHedlidze T,Waldner M,Zopf S,et al.Interleukin-33-dependent innatelymphoid cells mediate hepatic fibrosis[J].Immunity,2013,39(2):357-71.

[10] Xiong W J,Hu L J,Jian Y C,et al.Wnt5a participates in hepatic stellate cell activation observed by gene expression profile and functional assays[J].World J Gastroenterol,2012,18(15):1745-52.

[11] 袁 燦.維甲酸相關孤核受體a抗肝纖維化作用研究進展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2014,30(3):391-3.