光信號對Fmr1 KO小鼠睡眠-覺醒的調控作用

李曉鳳，王 媛，李 磊，許 奇，張 瑾，王烈成

晝夜節(jié)律是以24 h左右為周期的規(guī)律性變化，影響晝夜節(jié)律的因素包括光照、聲音、飲食、運動和激素等，其中光照在睡眠-覺醒的調控起重要作用[1]。眼睛接收和處理周圍環(huán)境中的光信號并傳至大腦，通過睡眠-覺醒中樞的分析綜合，進而調控睡眠和覺醒[2]。脆性X智力低下基因(Fragile X mental retardation 1，Fmr1)的功能及相關疾病的研究起始于上世紀九十年代[3]。Fmr1在基因組中跨越38 000 bp，由17個外顯子和16個內含子組成[4]，其轉錄產物mRNA編碼由596個氨基酸殘基組成的脆性X智力低下蛋白(Fragile X mental retardation protein，Fmrp)[5]，參與調解中樞神經系統內850多種mRNA的轉錄和翻譯[6-7]。Fmr1基因缺失或沉默，導致Fmrp蛋白合成和分泌不足，從而引起神經元結構異常和功能紊亂。研究[8]表明，脆性X綜合征(Fragile X syndrome, FXS)在行為、認知和情感等方面存在異常。該研究通過改變光信號分析Fmr1 KO小鼠和WT小鼠的睡眠-覺醒變化，旨在為Fmr1 KO小鼠的研究提供參考，為治療Fmr1相關的自閉癥提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物 SPF級Fmr1 KO 10周齡雄性C57BL/6J小鼠(n=11)，20～25 g(北京大學生命科學院生物膜與膜生物工程國家重點實驗室張晨研究員友情提供)；SPF級10周齡雄性C57BL/6J小鼠(n=13)，20～25 g(安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供)。實驗小鼠置于獨立通風籠內飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。光照時間8:00 am～8:00 pm，溫度22～24 ℃，濕度55%～60%。

1.1.2主要試劑與儀器 小鼠適配器、高速顱骨鉆(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；造牙粉、義齒基托樹脂(上海二醫(yī)張江生物材料有限公司)；記錄排線(東莞市耀博電子有限公司)；組織膠(日本Toagosei公司)；MP150多導生理信號記錄分析系統(美國Biopac公司)；Sleepsign睡眠分析軟件(日本Kissei Comtec株式會社)；PCR儀(美國伯樂公司)。

1.2實驗方法

1.2.1基因鑒定 小鼠出生后2周，取尾部組織50 mg左右于EP管中，剪碎并做好標記。加入80 μl NaOH(50 mmol/L)，放入99 ℃金屬浴中30 min，加入40 μl Tris-Hcl(1 mmol/L)?；靹蚝笕「? μl樣品加入反應體系(ddH2O+Buffer+dNTP+TAP酶+引物)，混勻后進行PCR反應(94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35個循環(huán)；延伸72 ℃ 10 min)。取PCR反應產物2 μl進行1%瓊脂糖凝膠電泳，與Marker作比較，條帶約500 bp為WT小鼠，條帶約800 bp為Fmr1 KO小鼠。選出需要的基因型雄鼠進行單獨飼養(yǎng)。引物序列見表1。

表1 WT and Fmr1 KO 小鼠的PCR驗證引物

1.2.2動物手術

1.2.2.1 小鼠麻醉和固定 采用4%戊巴比妥鈉對小鼠行腹腔麻醉，麻醉劑量為0.04 ml/g。待小鼠痛覺反射消失后，將其固定于小鼠腦立體定位適配器上。

1.2.2.2 顱骨暴露和埋置腦電電極 剪去小鼠頭頂毛發(fā)，并用75%酒精消毒皮膚，沿露骨正中線切開皮膚，分離皮下組織使顱骨充分暴露。分別于冠狀縫前1.0 mm及人字縫前1.0 mm與顱骨中線兩側旁開1.5 mm處用顱骨鉆鉆通顱骨(注意不要弄破硬腦膜)，先后用組織膠和牙科水泥將腦電電極固定于顱骨上，腦電電極下端觸碰硬腦膜為度，用于記錄皮層腦電活動。

1.2.2.3 固定肌電電極并縫合傷口 將兩根肌電電極分別插入小鼠頸背部兩側的斜方肌內，用于記錄肌電活動。然后將電極底座用組織膠和牙科水泥于顱骨上。傷口處給予青霉素粉末并縫合傷口。將小鼠側臥位放于預先加熱好的電熱毯上，待小鼠恢復清醒后放入恒溫、恒濕、隔音和靜電屏蔽功能的屏蔽箱內單獨飼養(yǎng)，屏蔽箱內正常光照時間設置為：8:00 am～8:00 pm。

1.2.2.4 連線適應 術后1周，將記錄腦電和肌電的排線與小鼠頭部的電極連接適應5 d，屏蔽箱內光照8:00 am ～ 8:00 pm。

1.2.3記錄方法 為了盡可能減小對小鼠睡眠-覺醒周期的影響，適應結束后采取連續(xù)記錄的方式。記錄12 h : 12 h明暗條件下的睡眠-覺醒情況；記錄9:00 am ～ 11:00 am關燈2 h條件的睡眠-覺醒情況。小鼠的睡眠-覺醒情況包括：覺醒(wake，W)、慢波睡眠(slow wave sleep，SWS)和快波睡眠(fast wave sleep，FWS)。

2 結果

2.1小鼠基因鑒定結果手術前，采用PCR技術鑒定Fmr1 KO和WT小鼠，選取Fmr1 KO純合子(-/-)和WT純合子(+/+)，PCR擴增結果見圖1。Fmr1 KO純合子小鼠擴增出約400 bp的DNA片段，WT純合子小鼠擴增出約131 bp的DNA片段。經過PCR技術鑒定，確保了實驗動物品種正確。

圖1 小鼠基因型鑒定結果

M：Marker；1、2、5、6、9、10、11：WT(+/+)；4、8、12：KO(-/-)；3、7：KO(+/-)

2.2正常光照條件下WT和Fmr1KO小鼠的睡眠-覺醒成一致的晝夜節(jié)律現象12 h ∶12 h明暗(8:00 am開燈和8:00 pm關燈)交替中的光授時信號對Fmr1 KO(n=4)和WT小鼠(n=6)的總睡眠時間(total sleep time，TST)和覺醒時間的影響具有一致的晝夜節(jié)律變化，二者之間的差異無統計學意義(圖2)。

2.3光授時信號對WT和Fmr1KO小鼠在9:00am～11:00am期間覺醒量的影響與正常12 h ∶12 h明暗(8:00 am開燈和8:00 pm關燈)交替的時段相比，WT小鼠(n=6)在關燈2 h(9:00 am～11:00 am)時的覺醒量發(fā)生明顯變化，尤其是在關燈后的第1小時覺醒量顯著增加(P<0.01)。具體表現為：關燈后的第一個階段(9:00 am～9:20 am)小鼠的覺醒量由(17.66±4.92)%增長至(85.86±8.78)%(t=-11.60，P<0.01)，第二個階段(9:20 am～9:40 am)由(10.21±4.21)%增長至(61.53±7.93)%(t=-14.01，P<0.01)，第三個階段(9:40 am～10:00 am)由(35.92±8.27)%增長至(63.62±9.46)%(t=-5.40，P<0.01)。見圖3B。

圖2 WT和Fmr1 KO小鼠在12 L/12 D條件下的總睡眠時間和覺醒時間的分布

圖3 Fmr1 KO和WT小鼠在9:00 am～11:00 am關燈前后覺醒情況分布圖

相比于WT小鼠相同時間段關燈前后的變化，Fmr1 KO小鼠(n=6)覺醒量的增加幅度顯著降低(P<0.01)。具體表現為：關燈后的第一個階段(9:00 am～9:20 am)小鼠的覺醒量由(21.39±8.90)%增長至(37.91±11.11)%(t=-2.84，P<0.05)，關燈后的第二個階段(9:20 am ～ 9:40 am)由(16.20±8.63)%增長至(49.41±17.15)%(t=-4.24，P<0.01)，關燈后的第三個階段(9:40 am～10:00 am)由(35.38±10.10)%增長至(62.47±11.77)%(t=-4.28，P<0.01)。見圖3C。

2.4光授時信號對WT和Fmr1KO小鼠在9:00am～11:00am期間時相轉換的影響與正常光照(8:00 am開燈和8:00 pm關燈)的相同時段相比，WT和Fmr1 KO小鼠關燈2 h期間(9:00 am～11:00 am)的SWS、FWS和W時相的轉換數也發(fā)生明顯的變化(P<0.05)。

圖4 WT和Fmr1 KO小鼠9:00 am～11:00 am關燈期間的時相轉換數

A、 B、C：9:00 am～10:00 am；D、E、F：10:00 am～11:00 am；其中A、D：SWS-W、B、E：W-SWS；C、F：FWS-W；與正常光照比較：*P<0.05,**P<0.01

9:00 am～10:00 am關燈期間WT小鼠的SWS-W、W-SWS和FWS-W時相的轉換數依次由(5.14±0.51)增加至(28.86±1.77)(t=-12.91，P<0.01)、(6.00±0.31)增加至(32.86±1.65)(t=-15.97，P<0.01)和(0.86±0.26)增加至(4.00±0.44)(t=-6.18，P<0.01)；與自身正常光照相同時段相比，10:00 am～11:00 am關燈期間WT小鼠的SWS-W、W-SWS和FWS-W時相的轉換數的變化差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

9:00 am～10:00 am關燈期間Fmr1 KO小鼠的SWS-W、W-SWS和FWS-W時相的轉換數依次由(5.29±0.36)增加至(15.71±0.57)(t=-15.56，P<0.01)、(6.29±0.42)增加至(24.71±0.68)(t=-23.05，P<0.01)和(1.00±0.31)增加至(9.43±0.48)(t=-14.75，P<0.01)；與自身正常光照相同時段相比，10:00 am～11:00 am關燈期間Fmr1 KO小鼠的SWS-W、W-SWS和FWS-W時相轉換數的變化較前一個小時明顯減弱，但差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

3 討論

本試驗是在基因鑒定的基礎上，選用Fmr1 KO純合子雄性小鼠為試驗動物，以光授時信號為試驗因子，探究Fmr1 KO小鼠在睡眠-覺醒方面存在的異常。在本研究中，正常光照條件下Fmr1 KO小鼠和WT小鼠的睡眠-覺醒都具有一致的晝夜節(jié)律現象；改變9:00 am～11:00 am期間的光授時條件，Fmr1 KO在覺醒量和睡眠-覺醒時相轉換數方面與WT小鼠存在差異，由此推測與WT小鼠相比較，Fmr1 KO小鼠受光授時信號的影響有所減弱。而說明光信號如何通過視網膜上的感光細胞對Fmr1 KO小鼠的睡眠-覺醒產生影響，將有助于為患有與Fmr1基因有關的自閉癥人群改善睡眠質量提供理論指導。

需要注意的是，小鼠是夜行性動物，而人類是晝行性動物，因此試驗中在白天改變光授時信號?；蚯贸姆椒ㄖ圃斓膭游锬Ｐ?，與真正意義上的FXS在分子基礎上有著一定上的區(qū)別。最近研究[9]表明，新型轉基因小鼠有待進一步的開發(fā)。另外，由于Fmr1基因位于X染色體上，而男性患者只有一條X染色體，當Fmr1基因突變之后，不能像女性患者那樣有一個補償性的Fmr1基因，故男性FXS的智力和行為缺陷較女性患者更重一些，因此性別因素成為不可忽略的重要方面。故在本研究中選擇雄性Fmr1 KO小鼠作為實驗動物。

自閉癥的病因包括遺傳和非遺傳因素，FXS是遺傳因素中最常見的類型。關于自閉癥睡眠問題的報道日益增多。目前以Fmr1 KO小鼠為模型動物研究FXS睡眠問題的報道較少，特別是通過埋置腦電和肌電電極全程監(jiān)測Fmr1 KO小鼠睡眠-覺醒情況的研究鮮有報道，該方法的優(yōu)點在于實時監(jiān)控和精確統計。

光信號對Fmr1 KO小鼠的睡眠-覺醒具有調控作用，相比于WT小鼠，Fmr1 KO小鼠的睡眠-覺醒受光信號改變的影響有所減弱。

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