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    清腸利肝方對(duì)急性肝衰竭小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響*

    2019-09-05 02:05:28張向穎李紅艷李秀惠
    關(guān)鍵詞:清腸肝細(xì)胞試劑盒

    張向穎 李紅艷 任 鋒 李秀惠

    1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合中心(北京, 100000) 2.北京市肝病研究所

    急性肝衰竭(ALF)是由炎癥介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷,并伴隨肝細(xì)胞凋亡和壞死的臨床綜合癥[1],多由肝炎病毒、應(yīng)用肝毒性藥物和肝臟缺血再灌注損傷等病因引起,在臨床上多表現(xiàn)為病情危重、發(fā)展迅速、病死率很高,迄今在臨床上除肝移植外尚沒(méi)有特異有效的治療藥物和方法[2]。肝細(xì)胞凋亡是ALF早期一種重要的病理學(xué)表現(xiàn),如能抑制肝細(xì)胞凋亡,則有望延緩甚至阻斷ALF的病情進(jìn)展[3]。我院院內(nèi)協(xié)定處方清腸利肝方在臨床治療肝衰竭過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,臨床療效較好,前期研究表明清腸利肝方對(duì)ALF小鼠具有保護(hù)作用,然而這種保護(hù)作用是否與其對(duì)肝細(xì)胞凋亡的抑制作用有關(guān)尚不清楚。因此,本研究通過(guò)建立D-氨基半乳糖聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠模型,進(jìn)一步探討清腸利肝方對(duì)ALF小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響,為后續(xù)研究和清腸利肝方的推廣奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 健康C57BL/6雄性小鼠,8~12周齡,重量18~25g,購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院,在北京市肝病研究所飼養(yǎng),實(shí)驗(yàn)前12h和實(shí)驗(yàn)期間禁食,自由飲水。D-氨基半乳糖(D-GalN),脂多糖(LPS)購(gòu)自Sigma公司。Cleaved-caspase3和β-actin兔抗鼠單克隆抗體以及辣根過(guò)氧化酶(HRP)偶聯(lián)的羊抗兔多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司;增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司。Caspase3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司。清腸利肝方購(gòu)自北京康仁堂藥業(yè),方劑組成:生地、大黃、厚樸、蒲公英、熾殼。

    1.2 動(dòng)物分組與模型制備 C57BL/6小鼠腹腔注射D-GalN(700 mg/kg)聯(lián)合LPS(10μg/kg)建立急性肝衰竭模型,清腸利肝方(50mg/kg)在注射D-GalN/LPS之前3d灌胃給藥,1次/日。實(shí)驗(yàn)分組:正常對(duì)照組小鼠給予與模型組和干預(yù)組相同劑量、相同處理方式的生理鹽水;急性肝衰竭模型組小鼠腹腔注射D-GalN/LPS;清腸利肝方干預(yù)組小鼠D-GalN/LPS給藥前3d給予清腸利肝方灌胃,1次/日。D-Gal/LPS給藥6h后收集小鼠肝臟組織和血清。

    1.3 觀察指標(biāo)

    1.3.1 生存率觀察 從D-GalN/LPS干預(yù)小鼠開始計(jì)時(shí),精確到小時(shí),觀察造模處理后24小時(shí)內(nèi)各組小鼠的生存狀態(tài)(每組10只小鼠),記錄每只小鼠的死亡時(shí)間及造模后24小時(shí)各組小鼠的存活數(shù)。繪制生存曲線,進(jìn)行生存分析。

    1.3.2 肝組織細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用TUNEL染色法,取新鮮肝組織包埋,制備5μm冰凍切片,按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行TUNEL染色。

    1.3.3 組織蛋白提取,濃度測(cè)定以及蛋白免疫印跡檢測(cè) 用加入磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液勻漿肝組織提取蛋白,8000×g、4℃離心5min,取上清液進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。蛋白免疫印跡操作如下:取組織蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗(1∶1000稀釋)孵育,TBST漂洗3次,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育(1∶2000稀釋),TBST漂洗后取等量的ECL發(fā)光試劑A液和B液混勻后孵育PVDF膜,壓片曝光。

    1.3.4 肝組織caspase3活性測(cè)定 取肝組織裂解液勻漿裂解,按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行活性檢測(cè)。

    2 結(jié)果

    2.1 清腸利肝方干預(yù)降低ALF小鼠死亡率 模型組小鼠在D-GalN/LPS注射6 h后開始出現(xiàn)死亡,至24 h觀察結(jié)束時(shí)僅存活2只,死亡率為80%;而清腸利肝方干預(yù)組小鼠在注射16 h后開始出現(xiàn)死亡,至24 h觀察結(jié)束時(shí)存活7只,死亡率為30%(圖1)。

    圖1 清腸利肝方干預(yù)與ALF小鼠模型組生存曲線圖

    2.2 清腸利肝方干預(yù)抑制ALF小鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡 D-GalN/LPS造模后6 h,模型組小鼠肝組織TUNEL染色見滿視野凋亡陽(yáng)性細(xì)胞,凋亡率為(67.6±3.01)%,清腸利肝方干預(yù)組小鼠肝組織凋亡陽(yáng)性細(xì)胞少見,清腸利肝方干預(yù)組凋亡率為(16.0±1.76)%,顯著低于模型組(P<0.0001)(插頁(yè)圖2)。

    2.3 清腸利肝方干預(yù)抑制ALF小鼠肝組織cleaved caspase3蛋白表達(dá)水平 與正常對(duì)照組相比,模型組小鼠肝組織中cleaved caspase3蛋白表達(dá)增加,而清腸利肝方干預(yù)后可使ALF小鼠肝組織中cleaved caspase3蛋白表達(dá)降低(圖3)。

    圖3 WB檢測(cè)肝組織中cleaved caspase3表達(dá)水平圖

    2.4 清腸利肝方干預(yù)抑制ALF小鼠肝組織caspase3活性 模型組小鼠肝組織caspase3活性為(118.7±24.89),清腸利肝方干預(yù)組小鼠肝組織caspase3活性為(34.99±6.67),顯著低于模型組(P=0.012)(圖4)。

    圖4 各組小鼠肝組織caspase3活性檢測(cè)

    3 討論

    ALF是一個(gè)多因素參與的、復(fù)雜的病理生理過(guò)程。在眾多因素中,內(nèi)毒素血癥是該病死亡的重要原因[4]。內(nèi)毒素不僅可以誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)毒素血癥,還可誘發(fā)體內(nèi)細(xì)胞的凋亡[5]。肝細(xì)胞凋亡是ALF一種重要的死亡形式,近年來(lái)研究表明肝細(xì)胞凋亡與ALF關(guān)系十分密切[6]。肝細(xì)胞凋亡是一種短時(shí)相病理改變,是ALF早期的一種重要病理學(xué)表現(xiàn),也是藥物治療的重要靶點(diǎn)[7]。

    Caspase3一般以無(wú)活性前體存在于細(xì)胞中,當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入凋亡時(shí)才被激活,從而進(jìn)入細(xì)胞核中執(zhí)行凋亡效應(yīng),使得染色質(zhì)凝集、DNA片段化、凋亡小體的形成等[8]。Caspase3的激活在肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生中起重要的作用,是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末執(zhí)行酶,是多種凋亡刺激信號(hào)傳遞的匯聚點(diǎn)。

    TNF-α被認(rèn)為是肝細(xì)胞凋亡的重要誘導(dǎo)因素,它與相應(yīng)的配體結(jié)合后能激活caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終引起細(xì)胞DNA斷裂、細(xì)胞凋亡。文獻(xiàn)表明:TNF-α是D-GalN/LPS誘導(dǎo)ALF中的主要促凋亡因子[9]。JNK 是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員[10],可由細(xì)胞應(yīng)激、炎癥因子(TNF-α)等因素誘導(dǎo)激活,其中研究最為廣泛的是,TNF-α 通過(guò)與TNFR1 結(jié)合,介導(dǎo)JNK的激活[11]。TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與持續(xù)激活的 JNK 信號(hào)通路有關(guān)[12]?;贘NK2基因敲除小鼠及JNK激酶抑制劑SP600125的研究表明,JNK可通過(guò)誘導(dǎo)線粒體膜通透性改變、細(xì)胞色素C釋放和 bid轉(zhuǎn)位,介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡[13]。因此,在ALF動(dòng)物,TNF-α不僅可直接誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡,還可通過(guò)激活JNK 介導(dǎo)的線粒體凋亡通路,從而顯著放大TNF-α的促凋亡效應(yīng)。在 D-GalN/LPS 誘導(dǎo)的ALF小鼠,TNF-α上調(diào)可能是肝細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)因素,JNK激活介導(dǎo)的線粒體途徑可能是ALF早期肝細(xì)胞大量凋亡的關(guān)鍵。

    我們前期研究結(jié)果表明,清腸利肝方對(duì)D-GalN/LPS誘導(dǎo)的ALF小鼠具有明顯的保護(hù)作用,表現(xiàn)為減輕ALF肝組織病理學(xué)損傷,有效降低血清TNF-α含量,降低磷酸化JNK蛋白表達(dá),在炎癥與細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,清腸利肝方能有效降低ALF小鼠肝細(xì)胞cleaved caspase3的表達(dá)和caspase3的活性,提示清腸利肝方可能通過(guò)調(diào)節(jié)JNK和TNF-α發(fā)揮對(duì)ALF小鼠肝細(xì)胞的抗凋亡作用,從而減輕ALF小鼠肝損傷。

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