生物大分子高分辨率冷凍電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

程凌鵬

(清華大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 蛋白質(zhì)研究技術(shù)中心, 北京 100084)

冷凍電子顯微三維重構(gòu)技術(shù)(簡(jiǎn)稱冷凍電鏡)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種透射電鏡技術(shù),能夠解析生物大分子復(fù)合體的高分辨率三維結(jié)構(gòu)。其特點(diǎn)是能夠解析的生物樣品的尺度較為寬泛,而且不需要樣品結(jié)晶,保持了樣品的近生理狀態(tài)。冷凍電鏡的這些特點(diǎn)與其他結(jié)構(gòu)解析方法相比優(yōu)勢(shì)明顯。X射線晶體學(xué)可以獲得生物大分子原子分辨率的三維結(jié)構(gòu),但其局限在于需要先獲得樣品的結(jié)晶。而對(duì)于分子量較大、較復(fù)雜的生物大分子復(fù)合體通常難以得到結(jié)晶的樣品,此外樣品在結(jié)晶后的結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生變化。核磁共振雖然能解析溶液中的蛋白結(jié)構(gòu),但是只能解析分子量在50 kD以下的小分子結(jié)構(gòu)。由于近年來(lái)隨著電鏡硬件和計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)的飛速發(fā)展,冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)解析分辨率從最初的納米級(jí)推進(jìn)到原子分辨率水平,一大批之前不能解析的生物大分子復(fù)合體的結(jié)構(gòu)一下子變得可解,因此受到了生物學(xué)家的廣泛關(guān)注,逐漸成為生物大分子結(jié)構(gòu)解析的主流方法之一。2017年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了開(kāi)創(chuàng)冷凍電鏡測(cè)定溶液中生物大分子復(fù)合體的高分辨率結(jié)構(gòu)方法學(xué)的迪波什(Jacques Dubochet)、弗蘭克(Joachim Frank)和亨德森(Richard Henderson)3位科學(xué)家。本文介紹了冷凍電鏡高分辨率結(jié)構(gòu)解析技術(shù)的起源、發(fā)展和未來(lái)趨勢(shì)。

1 冷凍電鏡技術(shù)的起源

1932年,德國(guó)物理學(xué)家魯斯卡(Ernst Ruska)和克諾爾(Max Knoll)首次研制出了世界上第一臺(tái)只有2個(gè)磁透鏡的電子成像裝置并將其命名為電子顯微鏡(簡(jiǎn)稱電鏡)。該裝置最初的成像方法倍數(shù)只有十幾倍。此后,魯斯卡等人進(jìn)一步改進(jìn)了成像放大倍數(shù)和分辨率。他們的工作奠定了現(xiàn)代透射電鏡的基礎(chǔ)。因?yàn)殡娮拥牟ㄩL(zhǎng)遠(yuǎn)小于可見(jiàn)光,所以電鏡的分辨率遠(yuǎn)大于光學(xué)顯微鏡,可以達(dá)到0.1 nm左右。魯斯卡也因此獲得1986年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)[1]。在第一臺(tái)電鏡在實(shí)驗(yàn)室問(wèn)世短短幾年后,首臺(tái)商業(yè)電鏡產(chǎn)品就被生產(chǎn)出來(lái)并很快在材料科學(xué)領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用。

由于樣品制備上的原因,電鏡在生物領(lǐng)域的應(yīng)用晚于材料科學(xué)。為了避免電子和空氣分子發(fā)生碰撞散射,電鏡必須在高真空下工作。而活性生物樣品含有水分,真空會(huì)使其脫水從而破壞原有結(jié)構(gòu)。此外,電子輻射也會(huì)破壞生物樣品化學(xué)鍵導(dǎo)致結(jié)構(gòu)破壞。因此,如何盡可能地保持生物樣品的在電鏡觀察時(shí)的原有結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化是個(gè)問(wèn)題。最早引入電鏡制樣的方法是負(fù)染。該方法用重金屬包裹樣品表面然后脫水干燥。這種方法雖然部分地解決了生物樣品的電鏡制樣問(wèn)題并被生物學(xué)家廣泛地應(yīng)用于生物樣品的觀察,但是其局限在于:(1)重金屬本身有可能會(huì)破壞樣品結(jié)構(gòu)；(2)電鏡觀察到的只是樣品的表面形貌；(3)染料不可能完全均勻地分布在樣品表面。這些問(wèn)題嚴(yán)重地限制了電鏡圖像分辨率。為了解決這些問(wèn)題,格萊澤(Robert Glaeser)等人最早提出了利用冷凍的方法來(lái)降低樣品輻射損傷[2-3],但是他們用傳統(tǒng)方法獲得的晶態(tài)冰會(huì)導(dǎo)致生物樣品原有結(jié)構(gòu)因?yàn)楸У漠a(chǎn)生而被破壞。迪波什和合作者在此基礎(chǔ)上做了改進(jìn),他們將溶液中的樣品迅速投入到液態(tài)乙烷中,樣品溶液被快速冷凍形成非晶態(tài)冰,然后將樣品放到液氮冷卻的電鏡冷臺(tái)上觀察。這樣既能保持生物樣品在冰中的原有結(jié)構(gòu),又避免了生物樣品在真空中脫水,并且在一定程度上降低了輻射損傷[4-5]。迪波什等人的工作標(biāo)志著冷凍電鏡技術(shù)的誕生,這個(gè)方法至今仍被沿用。

2 冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析的基本原理

2.1 樣品制備和電鏡成像

冷凍電鏡樣品的具體制作流程如圖1所示。首先,將高濃度和純度的生物大分子溶液樣品約4 μL加載到事先用親水化處理過(guò)的鋪有多孔碳膜的電鏡載網(wǎng)上,然后用濾紙吸掉多余的溶液,使得只剩下一層幾十到上百nm厚度的溶液薄膜留在碳膜上面。將該電鏡載網(wǎng)迅速投入到用液氮冷卻的液態(tài)乙烷中,這樣溶液被迅速冷凍,形成非晶態(tài)的薄冰。從而避免了冰晶的形成對(duì)生物樣品結(jié)構(gòu)的破壞。不直接用液氮,而是乙烷,因?yàn)闃悠泛鸵旱佑|會(huì)迅速沸騰,產(chǎn)生的氮?dú)飧粼跇悠泛鸵旱g阻礙了熱傳導(dǎo),從而形成晶態(tài)冰破壞樣品結(jié)構(gòu)。電鏡圖像從碳膜上的孔內(nèi)的薄冰層中采集。為了防止過(guò)度劑量的電子輻射對(duì)樣品的破壞,冷凍電鏡采用低電子劑量的成像方式。因?yàn)闃悠芳兌群芨?所有樣品顆粒的結(jié)構(gòu)是均一的(具有相同的三維結(jié)構(gòu)),而且冰中的樣品顆粒是隨機(jī)取向,每個(gè)樣品顆粒的電鏡圖像可以看作是單個(gè)顆粒從不同方向上的投影。顆粒的三維結(jié)構(gòu)可以通過(guò)計(jì)算機(jī)重構(gòu)的方法合并這些投影圖得到。因此,在冷凍電鏡制樣前用生化方法獲得結(jié)構(gòu)均一的樣品非常重要。

由于冷凍電鏡樣品非常薄,而且主要由碳、氫和氧等輕原子構(gòu)成,因此能滿足弱相位體近似(weak-phase object approximation),也就是說(shuō),可以認(rèn)為入射電子通過(guò)樣品只發(fā)生一次彈性散射,振幅不變,相位變化很小。由于構(gòu)成生物樣品的原子的原子量和水,接近以及成像采用較低的電子劑量,所以在正焦條件下電鏡圖像的襯度很小。因此樣品的圖像襯度主要通過(guò)成像時(shí)一定程度的離焦(通常是欠焦)來(lái)實(shí)現(xiàn)。由于圖像的欠焦和物鏡的球差效應(yīng),冷凍電鏡圖像沒(méi)有完全真實(shí)地反映樣品顆粒的投影,而是傅里葉空間被襯度傳遞函數(shù)(CTF)所調(diào)制的投影圖(見(jiàn)圖2)。CTF曲線可以寫為空間頻率S的函數(shù)[6]:

CTF(S)=-sin(γ(S)+Φ)

(1)

其中γ(S)=π((-Csλ3S4)/2+ΔzλS2),S是空間頻率,Q是振幅襯度在整個(gè)圖像襯度中所占的比例,由樣品厚度和電子能量所決定,在冷凍電鏡成像中約為0.1弧度；Cs是物鏡球差系數(shù)；λ是電子波長(zhǎng),由電鏡加速電壓決定；Δz是成像時(shí)的離焦值,由用戶給定。

圖2(a)是一張乳糖苷酶的電鏡圖像[7],圖2(b)是冷凍電鏡圖像的傅里葉變換圖，圖2(c)是CTF函數(shù)圖。從圖中可以看到,圖像的低頻部分只是有襯度反轉(zhuǎn),而高頻信息則被完全扭曲。因此要從電鏡圖像中獲得高分辨率的生物樣品的投影圖像,必須先對(duì)圖像進(jìn)行CTF校正。

2.2 電鏡圖像的計(jì)算機(jī)三維重構(gòu)

生物樣品電鏡圖像三維重構(gòu)在冷凍電鏡技術(shù)出現(xiàn)之前已經(jīng)有人研究。1968年,克魯格(Aaron Klug)和德羅西耶(David DeRosier)用三維重構(gòu)的方法合并多張噬菌體螺旋對(duì)稱的尾部負(fù)染電鏡圖像獲得了它的三維結(jié)構(gòu)[8]。重構(gòu)算法的基礎(chǔ)是中央截面定理:一個(gè)三維物體的二維投影的傅里葉變換是該物體的三維傅里葉變換中的垂直于投影方向的一個(gè)中央截面。如果可以獲得該物體在全空間中不同方向的投影,然后對(duì)每張投影圖進(jìn)行傅里葉變換,并按投影方向填充到三維傅里葉空間對(duì)應(yīng)的中央截面,并且如果投影的空間取向足夠多且均勻分布,那么其數(shù)據(jù)點(diǎn)就可以布滿該三維物體的整個(gè)三維傅里葉空間。對(duì)于三維傅里葉空間的空隙的部分可以通過(guò)插值計(jì)算得到。對(duì)該三維物體的傅里葉空間進(jìn)行三維反傅里葉變換就可得到物體實(shí)空間的三維結(jié)構(gòu)。此后,1971年克勞瑟(Richard Crowther)用類似的方法解析了首個(gè)二十面體對(duì)稱病毒衣殼的結(jié)構(gòu)[9]。1975年亨德森等人首次用電鏡解析了細(xì)菌紫膜蛋白的二維晶體結(jié)構(gòu),并在1990年首次將推進(jìn)到近原子分辨率水平[10-11],證明了電鏡結(jié)構(gòu)解析分辨率的潛力。因?yàn)樵谏锎蠓肿訌?fù)合體電鏡圖像三維重構(gòu)領(lǐng)域的開(kāi)創(chuàng)性貢獻(xiàn),克魯格獲得了1982年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

圖1 冷凍電鏡樣品制作流程圖

圖2 冷凍電鏡圖像及CTF函數(shù)圖

以上電鏡三維重構(gòu)的共同特點(diǎn)是都利用了樣品的高對(duì)稱性或樣品形成有序排列的二維晶體。然而,多數(shù)生物大分子復(fù)合體沒(méi)有對(duì)稱性且難以形成二維晶體。1974年,弗蘭克針對(duì)這個(gè)問(wèn)題提出通過(guò)對(duì)框取出的樣品顆粒圖像按照其相關(guān)性做分類,然后將相同類的圖像做二維平均以提高信噪比[12]。每一個(gè)類圖像平均代表了樣品顆粒在某個(gè)方向的投影圖,合并這些投影圖就可以獲得三維結(jié)構(gòu)[13]。冷凍電鏡圖像三維重構(gòu)的流程如下:

(1) 通過(guò)取向參數(shù)擬合的方法測(cè)定每一張圖像的欠焦值和像散并對(duì)圖像進(jìn)行CTF校正。

(2) 獲得初始結(jié)構(gòu)模板。顆粒結(jié)構(gòu)的低分辨率初始結(jié)構(gòu)可以采用與樣品同源的已知結(jié)構(gòu)；如果沒(méi)有類似結(jié)構(gòu),就需要用收集樣品的傾轉(zhuǎn)圖像來(lái)獲得初始結(jié)構(gòu)模板[14]。

(3) 把樣品顆粒圖像從電鏡圖像中框取出來(lái)并按照?qǐng)D像的相似度進(jìn)行歸類,對(duì)同一類的圖像進(jìn)行平均,得到類平均圖像。

(4) 用投影匹配方法獲得每個(gè)類平均圖像的空間取向和中心,投影匹配法需要一個(gè)初始結(jié)構(gòu)作為參考模板,程序首先對(duì)這個(gè)初始結(jié)構(gòu)做全空間取向投影作為模板,然后將每張類平均圖像和這些投影模板用交互相關(guān)的方法做相似度比較,每張類平均圖像中的顆粒的空間取向被測(cè)定為與其相似度最大的投影模板的投影取向。

(5) 合并所有的被測(cè)定了空間取向和中心位置的類平均圖像進(jìn)行三維重構(gòu)。重構(gòu)算法除了上面所說(shuō)的傅里葉空間插值法外,還有反投影重構(gòu)法[15]。

(6) 在得到了新的三維結(jié)構(gòu)后,將該三維結(jié)構(gòu)作為新的模板,重新匹配所有的顆粒。

(7) 循環(huán)迭代第(5)—(6)步,并不斷提高重構(gòu)分辨率。最終的有效結(jié)構(gòu)分辨率通過(guò)計(jì)算兩組獨(dú)立處理的顆粒圖像的重構(gòu)結(jié)果的傅里葉變換的徑向相關(guān)性來(lái)獲得[16]。

3 冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展

隨著電鏡硬件和軟件技術(shù)的不斷改進(jìn)和提高,用冷凍電鏡技術(shù)解析的生物復(fù)合體結(jié)構(gòu)的分辨率也在不斷提高。最初的三維重構(gòu)分辨率只有2～4 nm[17-18]。在眾多非二維晶體的生物樣品中,由于二十面體病毒具有高度對(duì)稱性,總是最早獲得結(jié)構(gòu)分辨率突破的大分子復(fù)合體。1997年,乙肝病毒的亞納米分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)首次被測(cè)定。在0.7～0.9 nm的分辨率下,首次觀察到乙肝病毒衣殼蛋白中的α螺旋呈現(xiàn)棍狀結(jié)構(gòu)[19-20]。2008年,首個(gè)用基于冷凍電鏡方法獲得的病毒衣殼蛋白的骨架模型被構(gòu)建[21]。此后低對(duì)稱性和無(wú)對(duì)稱性的復(fù)合體結(jié)構(gòu)也獲得了類似分辨率的結(jié)構(gòu)[22-23]。近年來(lái)用冷凍電鏡結(jié)構(gòu)達(dá)到可以直接構(gòu)建原子模型的分辨率水平[24-25]。最具有代表性的工作是2013年程亦凡研究組和朱利葉斯研究組合作,首次使用基于直接電子探測(cè)技術(shù)的相機(jī)收集冷凍電鏡圖像重構(gòu)獲得了大小僅為300 kD的一種辣椒素受體蛋白的0.34 nm分辨率的結(jié)構(gòu)[26],表明冷凍電鏡技術(shù)解析較小的蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)也能獲得近原子分辨率水平。目前冷凍電鏡技術(shù)所獲得的結(jié)構(gòu)分辨率已經(jīng)突破0.2 nm,達(dá)到了X射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu)解析的分辨率水平[27]。

3.1 電鏡和相關(guān)設(shè)備的發(fā)展促進(jìn)了電鏡圖像質(zhì)量和采集效率的提高

冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析分辨率的提高與技術(shù)的發(fā)展總是分不開(kāi)的。電鏡高分辨率技術(shù)的一個(gè)較早的突破是場(chǎng)發(fā)射電子槍(FEG)的出現(xiàn)。場(chǎng)發(fā)射電子槍和熱電子槍相比能獲得相干性更好的電子光源,因此能獲得的圖像的襯度和分辨率更高。平行入射電子光源的應(yīng)用進(jìn)一步提高了電子穿過(guò)樣品后的相干性。磁透鏡的恒定功率系統(tǒng)增加了透鏡電流的穩(wěn)定性。近年來(lái)開(kāi)發(fā)的冷凍電鏡圖像自動(dòng)收集軟件的普及使得電鏡可以在無(wú)人監(jiān)督下24 h自動(dòng)收集圖像,大大地減輕了使用者的勞動(dòng)量,提高了結(jié)構(gòu)解析的效率。電鏡樣品自動(dòng)加載系統(tǒng)(autoloader system)的出現(xiàn)很大程度上減少了樣品的冰晶污染并增加了樣品臺(tái)的穩(wěn)定性。冷凍樣品自動(dòng)制樣機(jī)的推廣使得電鏡載網(wǎng)上冰的厚度可控性增加,大大提高了冷凍樣品制備的成功率和可重復(fù)性。

3.2 冷凍電鏡圖像質(zhì)量的提高

因?yàn)槔鋬鲭婄R成像的電子劑量低,且生物復(fù)合體的主要元素碳、氫和氧等原子量和構(gòu)成水的原子量接近,所以冷凍電鏡技術(shù)的最大的瓶頸是圖像的襯度和信噪比低。電子輻照到樣品上導(dǎo)致樣品的抖動(dòng)漂移進(jìn)一步削弱了冷凍電鏡圖像的高分辨率信息。較低的電鏡圖像襯度和信噪比導(dǎo)致后期精確測(cè)定顆粒取向上的困難。直接電子探測(cè)技術(shù)(direct-electron detector device,DDD)的相機(jī)的使用極大地改善了冷凍電鏡圖像的質(zhì)量。電鏡圖像采集器件的效率由電子轉(zhuǎn)換效率(detective quantum efficiency,DQE)也就是輸出信號(hào)和信噪比的平方和輸入信號(hào)的信噪比的平方的比值來(lái)衡量[28]。在DDD相機(jī)出現(xiàn)以前,冷凍電鏡圖像通常用電荷耦合器件(charge coupled device,CCD)相機(jī)或者攝影底片來(lái)收集。CCD相機(jī)收集圖像比底片要方便,而且在低頻區(qū)域的DQE較高。但因?yàn)镃CD不能夠直接探測(cè)電子圖像信號(hào),而是要通過(guò)閃爍體將電子信號(hào)轉(zhuǎn)換為光信號(hào)來(lái)獲得電鏡圖像,在轉(zhuǎn)換的過(guò)程中不可避免地引入了噪聲,所以其高頻信號(hào)的DQE較差。底片收集圖像的高頻區(qū)域的DQE雖然比CCD相機(jī)高[29],但是不能即時(shí)可見(jiàn),而是需要后期顯影和掃描才能獲得數(shù)字圖像,使用起來(lái)很不方便。DDD相機(jī)因?yàn)榭梢灾苯犹綔y(cè)電子信號(hào),所以在各個(gè)頻率段的DQE都遠(yuǎn)高于底片和CCD相機(jī),極大地提高了電鏡圖像的襯度和信噪比。近年來(lái)DDD相機(jī)已成為冷凍電鏡圖像采集的標(biāo)配。

除了DQE值高外,DDD還有一個(gè)特點(diǎn)是能夠以視頻的形式記錄,把一張圖像分為每秒鐘數(shù)十到數(shù)百幀的動(dòng)畫圖像。DDD成像的這一特性使得在電鏡成像時(shí)的樣品漂移可以通過(guò)對(duì)這些幀圖像進(jìn)行配準(zhǔn)后平均來(lái)校正[30-31]。這樣就能減少或者避免因?yàn)闃悠菲茖?dǎo)致的圖像模糊。DDD技術(shù)不僅提高了冷凍電鏡成像質(zhì)量使得用同樣的數(shù)據(jù)量可以獲得更高分辨率的三維結(jié)構(gòu),而且是對(duì)解析1 000 kD以下的較小蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)突破到原子分辨率水平的最大的技術(shù)推動(dòng)。

3.3 生物樣品三維分類和分辨率的提高

冷凍電鏡三維重構(gòu)的一個(gè)特點(diǎn)是通過(guò)合并大量樣品顆粒圖像的平均圖實(shí)獲得樣品顆粒的三維結(jié)構(gòu),因而樣品中含有少量其他不同結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)顆粒不影響最后的三維重構(gòu)結(jié)果。如果樣品中所含不同結(jié)構(gòu)的顆粒較多,尤其是同種樣品的多個(gè)不同構(gòu)象之間具有較小結(jié)構(gòu)差異,那么這些因素會(huì)導(dǎo)致平均圖像的模糊,最終影響重構(gòu)分辨率的提高。生物樣品中這類情況很常見(jiàn),尤其是同種樣品可能有不同的構(gòu)象,每個(gè)構(gòu)象都代表了樣品的一個(gè)和其生物功能相關(guān)的狀態(tài)。因此將不同構(gòu)象的顆粒區(qū)分出來(lái)對(duì)研究其生物機(jī)制有重要意義。最大似然(maximum likelihood)方法應(yīng)用在顆粒分類上能夠識(shí)別顆粒圖像究竟是某個(gè)顆粒的不同方向上的投影還是不同結(jié)構(gòu)顆粒的投影[32]。通過(guò)這種方法,溶液中不同的顆粒可以按其三維結(jié)構(gòu)的不同分為不同的類。這種分類也促進(jìn)了重構(gòu)分辨率的提高。

冷凍電鏡及其相關(guān)設(shè)備的一系列技術(shù)的改進(jìn)和圖像三維重構(gòu)軟件發(fā)展是相輔相成的。電鏡設(shè)備技術(shù)改進(jìn)提高了圖像的襯度和信噪比,反過(guò)來(lái)更好質(zhì)量的圖像也促進(jìn)了三維重構(gòu)圖像處理軟件的研發(fā),這些因素共同推動(dòng)了冷凍電鏡生物大分子復(fù)合體結(jié)構(gòu)解析分辨率的革命性突破[33-34]。

4 冷凍電鏡技術(shù)的未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)

從1997年報(bào)道的首個(gè)解析到亞納米分辨率的乙肝病毒的結(jié)構(gòu)[19-20]到2016年報(bào)道的0.18 nm分辨率的谷氨酸脫氫酶(約300 kD)結(jié)構(gòu)[27],冷凍電鏡結(jié)構(gòu)生物學(xué)在這20年來(lái)經(jīng)歷了飛速的發(fā)展。能夠用冷凍電鏡獲得近原子分辨率水平的結(jié)構(gòu)的樣品范圍從最初的大到病毒這樣的超大分子復(fù)合物到現(xiàn)在的不到100 kD的小分子復(fù)合物[27],其解析小分子復(fù)合物的尺度范圍已經(jīng)部分覆蓋到了原本只有X射線晶體學(xué)才能達(dá)到的范圍。目前冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析技術(shù)已經(jīng)非常成熟,只要有合適的大小、濃度和結(jié)構(gòu)均一性的樣品,單純從結(jié)構(gòu)解析技術(shù)上來(lái)說(shuō),要獲得樣品的高分辨率結(jié)構(gòu)已經(jīng)沒(méi)有挑戰(zhàn)性可言。但是在適用樣品的尺度普適性這一問(wèn)題上依然有很多技術(shù)問(wèn)題有待解決。例如,顆粒尺度太小會(huì)導(dǎo)致電鏡圖像的襯度低,在數(shù)據(jù)處理時(shí)難以準(zhǔn)確地匹配圖像,目前仍然只有少數(shù)100 kD左右的小分子復(fù)合體用冷凍電鏡方法能夠獲得近原子分辨率的結(jié)構(gòu)。此外,由于電鏡的場(chǎng)深有限,要解析較大的顆粒的樣品的原子分辨率結(jié)構(gòu)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。要讓冷凍電鏡高分辨率結(jié)構(gòu)技術(shù)能夠適用更多的生物樣品,使結(jié)構(gòu)解析變得更為普適,永遠(yuǎn)是擺在冷凍電鏡方法學(xué)研究者面前的首要課題。

4.1 相位板技術(shù)為解析小分子結(jié)構(gòu)提供了可能

從成像原理上,冷凍電鏡圖像襯度低的原因是CTF函數(shù)的正弦函數(shù)取向調(diào)制導(dǎo)致圖像低頻部分被衰減,如前面公式(1)和圖2C所示。因此目前用冷凍電鏡解析小分子,尤其是100 kD以下的小分子的高分辨率結(jié)構(gòu)依然是一個(gè)挑戰(zhàn)。如果可以通過(guò)某種手段使得公式(1)中的相移Φ變?yōu)棣?2,那么該正弦函數(shù)則變?yōu)橛嘞液瘮?shù)CTF(S)=-cos(γ(S)),圖像的低頻部分就不存在衰減,襯度就會(huì)顯著增強(qiáng)。近年來(lái)相位板(phase plate)技術(shù)的出現(xiàn)解決了這個(gè)問(wèn)題[35]。相位板是加在電鏡物鏡后焦面上的一層特殊的薄碳膜,能夠?qū)崿F(xiàn)這個(gè)相移。由于圖像襯度的增強(qiáng),可以用正焦或者很小的欠焦,甚至小的過(guò)焦成像[36],這樣也避免了因?yàn)榍方惯^(guò)大導(dǎo)致的圖像信息的高頻衰減。盡管相位板技術(shù)在成像穩(wěn)定性方面有待進(jìn)一步提升,但是該技術(shù)為目前冷凍電鏡高分辨率三維重構(gòu)技術(shù)突破小分子尺度極限提供了可能。

4.2 埃瓦爾德校正技術(shù)是解析超大分子復(fù)合體的原子分辨率結(jié)構(gòu)的方向

在冷凍電鏡結(jié)構(gòu)高分辨率解析的另一個(gè)極端,如果生物樣品的尺度很大(50 nm以上),要獲得其超過(guò)0.3 nm分辨率的結(jié)構(gòu)也很困難。在冷凍電鏡圖像處理時(shí),通常忽略樣品的厚度。如果樣品的厚度小于電鏡的場(chǎng)深,這個(gè)近似是合理的。但是如果樣品的厚度過(guò)大,必然導(dǎo)致樣品沿著入射電子方向上不同層面的欠焦值不同,從而導(dǎo)致圖像高分辨率信息由于欠焦值差異而混疊?？紤]到這一點(diǎn),每張樣品顆粒的冷凍電鏡圖像的傅里葉變換就不再是對(duì)應(yīng)于穿過(guò)原點(diǎn)的中央截面,而是穿過(guò)原點(diǎn)的一個(gè)球形曲面,這樣的電鏡圖像校正稱為埃瓦爾德(Ewald)校正[37]。當(dāng)分辨率要求不高且顆粒尺度很小的時(shí)候,該曲面和截面可認(rèn)為是近似相同的。這就解釋了盡管二十面體病毒樣品是在所有生物樣品中首個(gè)獲得0.3～0.4 nm分辨率結(jié)構(gòu)的樣品,但是分辨率很難繼續(xù)提高了。由于冷凍電鏡圖像信噪比較低且埃瓦爾德校正算法復(fù)雜,目前該校正并沒(méi)有被廣泛地應(yīng)用。要推進(jìn)較大顆粒的重構(gòu)分辨率,電鏡圖像的埃瓦爾德校正有待進(jìn)一步研究。

4.3 某些樣品在溶液中的優(yōu)勢(shì)取向問(wèn)題有待解決

冷凍電鏡樣品中的優(yōu)勢(shì)取向也會(huì)影響重構(gòu)分辨率。如之前提到的,冷凍電鏡三維重構(gòu)的一個(gè)前提就是需要得到顆粒圖像的空間取向足夠多而且均勻分布。但是有一些樣品在溶液中的空間取向并不均勻,而是在某些取向的顆粒極多,其他取向很少。這種情況嚴(yán)重影響最后的重構(gòu)分辨率。盡管目前解決這類問(wèn)題有一些可選方案[38],但是這些方案并非對(duì)所有樣品都有效,或者會(huì)對(duì)成像質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，如何克服溶液中生物樣品顆粒的優(yōu)勢(shì)取向是一個(gè)值得研究的課題。

4.4 建立若干個(gè)冷凍電鏡設(shè)備和技術(shù)資源集中的共享科研設(shè)施是大勢(shì)所趨

目前建立一個(gè)300 kV的主流冷凍電鏡平臺(tái)需要數(shù)千萬(wàn)元人民幣的設(shè)備購(gòu)置開(kāi)支,冷凍電鏡設(shè)備的昂貴的價(jià)格和維護(hù)成本使得大多數(shù)科研單位無(wú)法建立這樣的結(jié)構(gòu)解析平臺(tái)。而且,并不是所有的生物學(xué)家都是冷凍電鏡專家,他們只關(guān)注和結(jié)構(gòu)相關(guān)的生物樣品的分子機(jī)制。冷凍電鏡維護(hù)和操作的復(fù)雜性也提高了生物學(xué)家的結(jié)構(gòu)解析技術(shù)門檻。因此，建設(shè)若干個(gè)科研共享的冷凍電鏡設(shè)施顯得尤為重要。冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析的最終發(fā)展的趨勢(shì)是和X射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu)解析共享科研平臺(tái)一樣,生物學(xué)家只要將合適的生物樣品交給結(jié)構(gòu)解析技術(shù)平臺(tái),就能得到樣品的高分辨率三維結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析技術(shù)的發(fā)展必定會(huì)讓生物學(xué)家更專注于生物學(xué),而不是結(jié)構(gòu)解析技術(shù)本身。

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