一株天然氣生物脫硫菌的分離純化和生物學(xué)特性研究

劉其松 孫茹 易鏵

1.中國(guó)石油西南油氣田公司天然氣研究院 2.國(guó)家能源高含硫氣藏開(kāi)采研發(fā)中心 3.中國(guó)石油天然氣集團(tuán)公司高含硫氣藏開(kāi)采先導(dǎo)試驗(yàn)基地

在石油化工、冶金和沼氣等工業(yè)過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生含H2S的工業(yè)廢氣。H2S為無(wú)色有毒氣體，對(duì)人體健康會(huì)造成影響，導(dǎo)致中毒癥狀，還會(huì)嚴(yán)重腐蝕管道設(shè)備。因此，含硫廢氣的脫硫問(wèn)題越來(lái)越受到人們的重視。利用微生物處理廢氣中的H2S是近年來(lái)研究的一種新型處理方法，它具有傳統(tǒng)方法無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，如成本低、脫硫率高等[1-4]。參與處理硫化物和H2S的微生物主要有無(wú)色硫細(xì)菌和光合細(xì)菌[5-7]，而目前應(yīng)用較廣的為多種硫桿菌，它們能夠氧化硫化物和H2S，生成元素硫，并將硫進(jìn)一步氧化為硫酸鹽。

脫氮硫桿菌是一種兼性好氧菌，在厭氧條件下更容易分離獲得純菌株[8]，而在好氧條件下脫硫更易于操作，成本更低。因此，本研究主要通過(guò)厭氧分離獲得一株脫氮硫桿菌純菌種，并對(duì)其生理生化特性進(jìn)行了鑒定。同時(shí)，對(duì)菌株的生長(zhǎng)曲線和最適生長(zhǎng)條件進(jìn)行了研究，旨在為天然氣生物脫硫工藝的發(fā)展和應(yīng)用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)種泥來(lái)源

本實(shí)驗(yàn)所接種的種泥來(lái)自某天然氣凈化廠污水處理工段的活性淤泥。

1.1.2培養(yǎng)基

厭氧培養(yǎng)基[9]：MnSO40.02 g/L，Na2HPO41.2 g/L，KH2PO41.8 g/L，NaHCO31 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，NH4Cl 0.5 g/L，CaCl20.05 g/L，F(xiàn)eCl30.02 g/L，KNO35g/L，Na2S2O310 g/L，最后調(diào)pH值至中性。

好氧培養(yǎng)基：MnSO40.02 g/L，Na2HPO41.2 g/L，KH2PO41.8g/L，NaHCO31 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，NH4Cl 0.5 g/L，CaCl20.05 g/L，F(xiàn)eCl30.02 g/L，Na2S2O310 g/L，最后將pH值調(diào)至中性。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1脫硫微生物的富集培養(yǎng)

從天然氣凈化廠硫磺回收裝置附近被硫磺污染的土壤和污水廠活性淤泥各取5 g，加入裝有100 mL無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)液的厭氧培養(yǎng)瓶中，厭氧培養(yǎng)瓶置于恒溫磁力攪拌器上。培養(yǎng)溫度35 ℃，攪拌培養(yǎng)20 d。

1.2.2脫硫微生物的定向馴化

將上述培養(yǎng)液加入裝有等體積、質(zhì)量濃度為0.04 g/L NaHS的密閉容器中，靜止2 d后，按10%的接種量轉(zhuǎn)入裝有無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，封口。在150 r/min、30 ℃下培養(yǎng)10 d。培養(yǎng)完成后，取出50 mL培養(yǎng)液加入裝有等體積、質(zhì)量濃度為0.08 g/L NaHS的密閉容器中，靜止2 d后，按10%的接種量轉(zhuǎn)入裝有無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，封口，在150 r/min、30 ℃下培養(yǎng)10 d。培養(yǎng)完成后，將50 mL 培養(yǎng)液加入裝有等體積、質(zhì)量濃度為0.12 g/L NaHS的密閉耐壓容器中，靜止2 d后，按10%的接種量轉(zhuǎn)入裝有無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，紗布封口，在150 r/min、30 ℃下培養(yǎng)10 d。

1.2.3脫硫微生物菌落形態(tài)鑒定

取上述馴化好的菌液1 mL，用無(wú)菌水依次制成體積分?jǐn)?shù)為10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.000 1%的稀釋液。然后將體積分?jǐn)?shù)為0.01%、0.001%、0.000 1%的稀釋液各0.2 mL，分別接種到平板培養(yǎng)基上，涂抹均勻，倒置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至固體培養(yǎng)基表面出現(xiàn)白色圓點(diǎn)狀小菌落，此過(guò)程需10～14 d。根據(jù)脫硫微生物在平板上的生長(zhǎng)菌落形態(tài)、高倍顯微鏡下活菌形態(tài)以及生化生理的代謝特性，結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手則》，初步鑒定獲得的脫硫微生物的屬種名。

1.2.4菌株的生理生化特性研究

從新鮮斜面上洗下菌落直接接種至裝有100 mL初始液體培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，于30 ℃、150 r/min搖床上培養(yǎng)5～7 d，以10%接種量移種至裝有100 mL各種考察條件培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，于30 ℃、150 r/min搖床上培養(yǎng)5～7 d。以此搖瓶培養(yǎng)物作為開(kāi)展培養(yǎng)過(guò)程研究的接種物。

利用單因子實(shí)驗(yàn)以生物量作為參考指標(biāo)，研究接種量、培養(yǎng)基初始pH值、培養(yǎng)溫度等對(duì)微生物脫硫菌種的生長(zhǎng)影響，尋找有利于脫硫微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件。同時(shí)，將少量細(xì)菌接種到一定體積的新鮮培養(yǎng)基中，經(jīng)充分培養(yǎng)后，采用比濁法定時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液中的菌量，并將所測(cè)的OD值與其對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間作圖，繪出該菌的生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果及討論

2.1 脫硫微生物的富集和馴化

脫硫微生物的篩選是開(kāi)展天然氣生物脫硫研究的首要任務(wù)和前提條件。傳統(tǒng)篩選菌種均采用平板分離法，由于脫硫微生物一般為化能自養(yǎng)型，在固體平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)非常緩慢，在長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過(guò)程中，固體培養(yǎng)基水分蒸發(fā)過(guò)度，致使菌體周?chē)}度加大，滲透壓升高，從而形成的菌落極其微小，見(jiàn)圖1。

傳統(tǒng)方法是對(duì)這些小的菌落逐一驗(yàn)證細(xì)菌的轉(zhuǎn)化能力，工作強(qiáng)度較大，篩選效率低。為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，針對(duì)天然氣生物脫硫的工藝特點(diǎn)，以NaHS濃度作為誘導(dǎo)馴化因子，始終采用液體培養(yǎng)技術(shù)，加快了脫硫微生物的生長(zhǎng)速度，克服了傳統(tǒng)平板培養(yǎng)的脫硫微生物生長(zhǎng)緩慢的弊端，快速定向高效的篩選天然氣生物脫硫菌群。將通過(guò)液體富集后得到的菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后涂平板培養(yǎng)觀察，如圖2、圖3所示，由于采樣地點(diǎn)環(huán)境不同，所分離的菌落外觀差別較大，說(shuō)明環(huán)境中所含的微生物種類(lèi)較多。

2.2 富集微生物形態(tài)觀察和初步鑒定

用竹簽挑起以上平板的典型菌落圖片觀察發(fā)現(xiàn)，各個(gè)菌落形態(tài)差異較大，特別是在淤泥中，由于其環(huán)境的多樣性，所含微生物種類(lèi)較復(fù)雜，形態(tài)較多，如圖4所示。本研究應(yīng)用平板單菌落分離方法，根據(jù)細(xì)菌形態(tài)特征和生理生化特征，先將各菌種鑒定到科，再按各分科檢索表鑒定到屬。主要的鑒定方法有革蘭氏染色試驗(yàn)等。文獻(xiàn)[10]報(bào)道，在顯微鏡下觀察，硫桿菌菌體大小為0.5～2.5 μm，單個(gè)、成對(duì)或呈短鏈狀排列，顯微鏡下可見(jiàn)其細(xì)胞內(nèi)有晶體存在，革蘭氏染色呈陰性。平板上菌落外觀形狀為圓形，外周為白色的菌落。根據(jù)分離到的微生物菌落形態(tài)生理特點(diǎn)，如圖4所示，對(duì)照文獻(xiàn)[10]，結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手則》，初步鑒定目標(biāo)菌種為硫桿菌屬。

2.3 生長(zhǎng)特性的研究

2.3.1接種量對(duì)脫硫菌種生長(zhǎng)的影響

接種量是影響微生物生長(zhǎng)繁殖速度的因素之一。采用大的接種量，種子進(jìn)入新鮮培養(yǎng)基后容易適應(yīng)，還可以縮短菌體繁殖至高峰所需的時(shí)間。但是接種量過(guò)大往往使菌體生長(zhǎng)過(guò)快、過(guò)稠，造成營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)缺乏或溶解氧不足而不利于生長(zhǎng)；接種量過(guò)小，則會(huì)引起前期菌體生長(zhǎng)緩慢、生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)、菌體量少等。實(shí)驗(yàn)分別考察了接種量為5%、10%、15%和20%對(duì)脫硫菌種生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，脫硫菌種的接種量為10%時(shí)，OD(optical density,即光密度，以下簡(jiǎn)稱(chēng)OD)值最高，說(shuō)明微生物含量最高。當(dāng)接種量為5%時(shí)，菌體生長(zhǎng)延緩，細(xì)胞含量低；而接種量大于10%時(shí)，可能由于菌體過(guò)度生長(zhǎng)，導(dǎo)致菌體后期營(yíng)養(yǎng)供量不足，從而降低了脫硫菌種的后期生長(zhǎng)。因此，選擇10%作為最佳接種量。

2.3.2溫度對(duì)脫硫菌種生長(zhǎng)的影響

由于微生物的生命活動(dòng)是由一系列生物化學(xué)反應(yīng)組成的，而這些反應(yīng)受溫度的影響極為明顯，當(dāng)微生物處于最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，有刺激生長(zhǎng)的作用；不適宜的溫度可以導(dǎo)致細(xì)菌的形態(tài)和代謝的改變或使微生物的蛋白質(zhì)凝固變性而導(dǎo)致死亡。因此，溫度是影響脫硫菌種生長(zhǎng)、代謝能力和氧化硫化物速率最重要的因素之一。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了3個(gè)溫度梯度：20 ℃、30 ℃和40 ℃。其他實(shí)驗(yàn)條件為：初始pH值7，接種量10%，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，脫硫菌種在30 ℃時(shí)OD值最高，說(shuō)明微生物生長(zhǎng)最好，因此選用30 ℃作為后續(xù)試驗(yàn)的培養(yǎng)溫度。

2.3.3初始pH值對(duì)脫硫菌種生長(zhǎng)的影響

不同的微生物要求的最適pH值不同，一般來(lái)說(shuō)，細(xì)菌和放線菌要求中性或微堿性的pH值，而酵母和霉菌則在偏酸的環(huán)境中生長(zhǎng)。當(dāng)環(huán)境中的pH值超過(guò)或低于適合其生長(zhǎng)的pH值范圍時(shí)，微生物的生長(zhǎng)就會(huì)受到抑制。了解這個(gè)特性后，就可以配制不同pH值的培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)不同的微生物，或選擇性地分離某種微生物。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了3個(gè)pH值梯度：6.5、7.5和8.5。其他實(shí)驗(yàn)條件為初始培養(yǎng)溫度30 ℃，接種量10%，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，脫硫菌種在pH值為7.5時(shí)，OD值最高，說(shuō)明微生物生長(zhǎng)最好，因此，選用pH值為7.5作為培養(yǎng)體系的初始pH值。隨著溶液初始pH值由6.5調(diào)為8.5，從圖7可以看出，溶液細(xì)胞量相對(duì)減少，由此可以推測(cè)，脫硫菌種對(duì)高堿性環(huán)境的適應(yīng)能力不太強(qiáng)，在后續(xù)研究工作中需提高其堿性耐受性。

2.3.4脫硫菌種生長(zhǎng)曲線的繪制

細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的繪制是將少量單細(xì)胞微生物接種到一定容積的液體培養(yǎng)基后，在適宜的條件下培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定細(xì)胞數(shù)量。以細(xì)胞增長(zhǎng)數(shù)目為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制得出一條生長(zhǎng)曲線，它反映了單細(xì)胞微生物在一定環(huán)境條件下在液體培養(yǎng)時(shí)所表現(xiàn)出的群體生長(zhǎng)規(guī)律。依據(jù)其生長(zhǎng)速率的不同，一般可把生長(zhǎng)曲線分為延緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。因此，通過(guò)測(cè)定微生物的生長(zhǎng)曲線，可了解菌種的生長(zhǎng)規(guī)律，對(duì)于科研和生產(chǎn)都具有重要的指導(dǎo)意義。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和取樣時(shí)間，繪制了脫硫菌種生長(zhǎng)過(guò)程中OD值隨時(shí)間的變化，如圖8所示。從圖8中可以看中，菌種各生長(zhǎng)周期明顯，生長(zhǎng)曲線可劃分為延緩期0～20 h、對(duì)數(shù)期20～60 h、穩(wěn)定期60～80 h和衰亡期。

3 結(jié) 論

通過(guò)人工構(gòu)建富集環(huán)境，在添加一定濃度硫化物的條件下，將樣品環(huán)境中的嗜硫微生物進(jìn)行了體系外的富集。富集完成后，繼續(xù)采用液體培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)馴化，在加快微生物生長(zhǎng)速度的同時(shí)，逐步提高硫化物濃度，逐級(jí)逼近目標(biāo)微生物。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中得到以下結(jié)論：

(1) 根據(jù)自然界分離目標(biāo)菌種的要求，在采樣地點(diǎn)的確定上，天然氣凈化裝置已運(yùn)行幾十年，廠區(qū)內(nèi)的土壤及淤泥中自然富集了大量能夠適應(yīng)高硫濃度環(huán)境的微生物，因此，在此處采樣可以獲得優(yōu)良的脫硫微生物。

(2) 實(shí)驗(yàn)表明，連續(xù)液體富集和馴化培養(yǎng)技術(shù)比固體平板劃線分離方法更加適合于自然界中生長(zhǎng)緩慢的菌種分離，比如化能自養(yǎng)型細(xì)菌。

(3) 從富集和馴化后的平板菌落觀察及顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，樣品體系中微生物的形態(tài)較多，有單胞狀、球形、疊球形、弧形、短桿及長(zhǎng)桿狀，說(shuō)明其中微生物種類(lèi)較多，這些微生物均能在富硫環(huán)境中生長(zhǎng)，為以后廣泛研究嗜硫微生物提供了廣闊的野生菌種來(lái)源。

參考文獻(xiàn)

[1] 徐波, 何金龍, 黃黎明, 等. 天然氣生物脫硫技術(shù)及其研究進(jìn)展[J]. 天然氣工業(yè), 2013, 33(1): 116-121.

[2] 徐瑛, 孫永明, 袁振宏, 等. 生物燃?xì)馍锩摿蚣夹g(shù)研究進(jìn)展[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2014, 20(2): 328-335.

[3] 汪家銘. Shell-Paques生物脫硫技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 化肥設(shè)計(jì), 2010, 48(2): 39-42.

[4] 孫茹, 何金龍, 徐波, 等. 高效液相色譜法測(cè)定生物脫硫溶液中單質(zhì)硫[J]. 石油與天然氣化工, 2015, 44(6): 101-104.

[5] SYED M A, HENSHAW P F. Effect of tube size on performance of a fixed film tubular bioreactor for conversion of hydrogen sulfide to elemental sulfur[J]. Water Research, 2003, 37(8): 1932-1938.

[6] SOROKIN D Y, MUNTYAN M S, PANTELEEVA A N, et al. Thioalkalivibrio sulfidiphilus sp. nov., a haloalkaliphilic, sulfur-oxidizing gammaproteobacterium from alkaline habitats[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2012, 62(8): 1884-1889.

[7] MUYZER G, SOROKIN D Y, MAVROMATIS K, et al. Complete genome sequence of “Thioalkalivibrio sulfidophilus” HL-EbGr7[J]. Standard Genomic Sciences, 2011, 4(1): 23-35.

[8] HOLE U H, VOLLACK K U, ZUMFT W G, et al. Characterization of the membranous denitrification enzymes nitrite reductase (cytochrome cd1) and copper-containing nitrous oxide reductase from Thiobacillus denitrificans[J]. Archives of Microbiology, 1996, 165(1): 55-61.

[9] 萬(wàn)淑娟, 黨志, 楊琛, 等. 一株氧化亞鐵硫桿菌的篩選及生長(zhǎng)條件研究[J]. 環(huán)境工程學(xué)報(bào), 2010, 4(9): 2146-2150.

[10] 車(chē)軒, 羅國(guó)芝, 譚洪新, 等. 脫氮硫桿菌的分離鑒定和反硝化特性研究[J]. 環(huán)境科學(xué), 2008, 29(10): 2931-2937.