補(bǔ)腎通絡(luò)方對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠氧自由基的影響

楊 帆，侯秀娟，袁 芳，朱躍蘭

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078；3. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京100010)

膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)是一種常見的退行性關(guān)節(jié)病變，具有漸進(jìn)性破壞的特點，致殘率極高。其主要特點是關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性磨損破壞、關(guān)節(jié)邊緣及軟骨下骨反應(yīng)性增生、形成骨贅，同時可伴有不同程度的滑膜炎表現(xiàn)，主要臨床表現(xiàn)是緩慢進(jìn)展的關(guān)節(jié)疼痛、壓痛，伴有僵硬、腫大、活動受限，嚴(yán)重者會導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙甚至殘疾。其發(fā)病可能與遺傳、性別、年齡增長、體質(zhì)量增加及創(chuàng)傷、炎癥等多種因素有關(guān)[1]。氧自由基指標(biāo)中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和過氧化脂質(zhì)(LPO)的含量可以反映出組織內(nèi)氧自由基的生成及分解情況，監(jiān)測這些指標(biāo)的水平變化可判斷軟骨組織的破壞情況[2-3]。補(bǔ)腎通絡(luò)方具有補(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)的作用，在臨床上治療膝骨關(guān)節(jié)炎療效很好。本實驗旨在通過觀察補(bǔ)腎通絡(luò)方對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠血清SOD、MDA和LPO含量的影響，探討該方治療膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。

1 實驗資料

1.1實驗動物 健康清潔級雄性Wistar大鼠42只，體質(zhì)量180～220 g，由斯貝福(北京)生物科技股份有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2016-0002。大鼠飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心的清潔級環(huán)境中，環(huán)境溫度為(26±1)℃，水瓶給水，自由進(jìn)食，普通飼料喂養(yǎng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。

1.2主要試劑與器材 木瓜蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司提供，25 g/瓶)，生理鹽水(石家莊四藥有限公司，500 mL/瓶)，SOD、MDA、LPO ELISA試劑盒(北京歐北生物科技有限公司提供)，電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司提供]，Centrifuge 5810R(Eppendorf AG公司提供)。

1.3實驗藥物 美洛昔康片(上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20090789，7.5 mg/片)；抗骨增生膠囊(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z10980006，0.35 g/粒)；補(bǔ)腎通絡(luò)方(原藥材每劑含量：骨碎補(bǔ)9 g、桑寄生15 g、川牛膝12 g、雞血藤15 g、白芍12 g、穿山龍15 g、川芎10 g，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥房提供，制成顆粒后每劑藥質(zhì)量為10 g)。灌胃劑量根據(jù)大鼠與人的體表面積比值進(jìn)行換算[4]。

1.4分組、造模及干預(yù) 按照隨機(jī)數(shù)字表法將42只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、西藥組、中成藥組、補(bǔ)腎通絡(luò)方低劑量組、補(bǔ)腎通絡(luò)方中劑量組和補(bǔ)腎通絡(luò)方高劑量組，每組6只。除正常組大鼠外，其余組大鼠均參照文獻(xiàn)[5]方法造模：于大鼠雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射4 %木瓜蛋白酶溶液0.2 mL/肢，第1，4，7天各1次。大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，末次注入木瓜蛋白酶溶液后第2天，隨機(jī)選2只大鼠對其行雙側(cè)膝關(guān)節(jié)X射線檢查，以確定造模是否成功。確認(rèn)造模成功后第2天，西藥組給予美洛昔康0.781 mg/kg混懸液灌胃，中成藥組給予抗骨增生膠囊0.547 g/kg混懸液灌胃，補(bǔ)腎通絡(luò)方低、中、高劑量組分別予補(bǔ)腎通絡(luò)顆粒方0.52，1.04，2.08 g/kg混懸液灌胃(10 g顆粒方相當(dāng)于88 g原藥材)，正常組及模型組均給予等體積蒸餾水灌胃，均每天1次，連續(xù)灌胃4周。

1.5標(biāo)本采集及檢測 各組大鼠于實驗結(jié)束后采用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉后，經(jīng)腹主動脈取血，約8mL/只，室溫下靜置2h后，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，分離留取上層血清，分裝于離心管內(nèi)，做好標(biāo)記后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，利用ELISA法按試劑盒提供的操作流程，分別測定血清中SOD、MDA、LPO含量。

2 結(jié) 果

2.1大鼠造模前后膝關(guān)節(jié)X射線表現(xiàn) 造模前脛骨平臺及股骨髁骨面光滑平整，關(guān)節(jié)間隙大小適中，關(guān)節(jié)邊緣整齊規(guī)則無骨贅，關(guān)節(jié)內(nèi)無游離體，軟骨下骨密度分布均勻，見圖1及圖2。造模后脛骨平臺骨面欠光滑，略有不平整，且關(guān)節(jié)間隙較造模前有所變窄，見圖3及圖4。

2.2各組大鼠血清中SOD、MDA和LPO含量 模型組大鼠血清中MDA和LPO含量均明顯高于正常組(P均<0.05)，SOD含量低于正常組(P<0.05)。各給藥組大鼠血清中MDA和LPO含量均明顯低于模型組(P均<0.05)，西藥組和中成藥組SOD含量均明顯高于模型組(P均<0.05)，補(bǔ)腎通絡(luò)方各劑量組SOD含量與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。補(bǔ)腎通絡(luò)方中劑量組血清中MDA和LPO含量在3組之間最低，SOD的含量最高，但3組之間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。補(bǔ)腎通絡(luò)方高劑量組血清中MDA和LPO含量明顯高于西藥組(P均<0.05)，且LPO含量明顯高于中成藥組(P<0.05)。見表1。

圖1 造模前大鼠右膝關(guān)節(jié)矢狀位X射線影像

圖2 造模前大鼠左膝關(guān)節(jié)矢狀位X射線影像

圖3 造模后大鼠右膝關(guān)節(jié)矢狀位X射線影像

圖4 造模后大鼠左膝關(guān)節(jié)矢狀位X射線影像

表1 各組大鼠血清SOD、MDA和LPO含量比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與補(bǔ)腎通絡(luò)方高劑量組比較，P<0.05。

3 討 論

骨關(guān)節(jié)炎是以關(guān)節(jié)僵硬、腫痛及活動困難為主要表現(xiàn)的一種常見病，多見于中老年人，是最常見的慢性退行性關(guān)節(jié)病損，又稱退行性骨關(guān)節(jié)病、肥大性骨關(guān)節(jié)病和老年性骨關(guān)節(jié)病。據(jù)統(tǒng)計，60歲以上人群中患病率達(dá)50%，75歲以上人群中患病率高達(dá)80%，本病致殘率也可達(dá)到53%[6]。但當(dāng)前對于骨關(guān)節(jié)炎的具體發(fā)病機(jī)制仍不是十分清楚，臨床上也無治愈本病的明確方法。既往研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)軟骨由于不同誘因發(fā)生磨損導(dǎo)致性狀改變，進(jìn)而軟骨代謝異常，造成軟骨細(xì)胞破壞產(chǎn)生大量氧自由基，各種因素同時作用加重軟骨細(xì)胞的損傷、老化等，使關(guān)節(jié)出現(xiàn)進(jìn)行性的退行性改變[7-8]。

骨關(guān)節(jié)炎在中醫(yī)中屬于“痹病”“骨痹”的范疇，以肌肉、筋骨、關(guān)節(jié)發(fā)生酸痛，麻木，屈伸不利，甚或關(guān)節(jié)腫大灼熱等為主要臨床表現(xiàn)。如《靈樞·刺節(jié)真邪篇》：“虛邪之中人也，灑淅動形，起毫毛而發(fā)腠理，其入深，內(nèi)搏于骨，則為骨痹。”本病常見于中老年人，系年邁體弱、正氣耗損、氣血不足，若復(fù)感外邪，氣郁痰滯血瘀阻于經(jīng)絡(luò)而發(fā)病，主要涉及肝、脾、腎三臟[9-10]?！额愖C治裁·痹證》有云：“諸痹……良由營衛(wèi)先虛，腠理不密，風(fēng)寒濕乘虛內(nèi)襲。正氣為邪阻，不能宣行，因而滯留，氣血凝滯，久而成痹?！北砻髌洳C(jī)為正虛邪留，氣血凝澀不通，虛實夾雜，以肝腎虧虛為根本，痰瘀阻絡(luò)為標(biāo)實。因此治療上以補(bǔ)益肝腎為主，配合活血通絡(luò)[11]。補(bǔ)腎通絡(luò)方是朱躍蘭教授多年治療骨關(guān)節(jié)炎的經(jīng)驗方，具有補(bǔ)益肝腎、通經(jīng)活絡(luò)之功效，可明顯改善肝腎虧虛、瘀血阻絡(luò)所致的關(guān)節(jié)疼痛、屈伸不利、行動不便等。近年研究表明，本方具有抑制膝骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清中炎性細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)膝關(guān)節(jié)軟骨含水量作用，進(jìn)而改善疼痛、腫脹、活動受限等癥狀[12-14]。

目前研究表明，軟骨細(xì)胞的破壞、衰老與氧自由基的關(guān)系極為密切，氧自由基作用于細(xì)胞脂膜，攻擊其中的多不飽和脂肪酸(PUFA)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生LPO，而它又正反饋攻擊生物膜和亞細(xì)胞器，使細(xì)胞膜產(chǎn)生更大的損傷，形成一系列惡性循環(huán)；同時誘使進(jìn)一步產(chǎn)生連鎖增殖反應(yīng)，最終形成穩(wěn)定的降解產(chǎn)物MDA[15-16]。由于LPO和MDA都是氧自由基作用后過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，因此檢測血清中LPO和MDA的含量就可以反映脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度。而SOD是一種活性蛋白酶，能催化氧自由基轉(zhuǎn)變成為H2O2和O2，是一種重要的氧自由基清除酶，通過清除軟骨損傷產(chǎn)生的氧自由基而保護(hù)軟骨，緩解軟骨進(jìn)一步被破壞的過程[17-18]。因此，SOD的含量變化可以反映治療手段對骨關(guān)節(jié)炎是否有效。提高SOD含量，降低MDA和LPO含量，能夠減少氧自由基產(chǎn)生，減緩過氧化反應(yīng)，抑制軟骨破壞，延緩骨關(guān)節(jié)炎的病程進(jìn)展[19-20]。

本實驗結(jié)果顯示，模型組中MDA和LPO含量明顯高于正常組，SOD含量明顯低于正常組，說明氧自由基參與了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病。而經(jīng)補(bǔ)腎通絡(luò)方干預(yù)后，MDA和LPO含量明顯下降，SOD含量明顯升高，說明本方能夠清除氧自由基；其中補(bǔ)腎通絡(luò)方中劑量組各指標(biāo)改善更明顯，說明該濃度在此次實驗動物的藥物治療監(jiān)測中為最佳濃度；而補(bǔ)腎通絡(luò)方不同劑量組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能考慮與實驗動物數(shù)量較少有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

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