孕晚期陰道及肛周拭子不同方法檢測B族鏈球菌和真菌的效果評價及耐藥分析*

武愛榮(西安高新醫(yī)院檢驗科，西安 710075)

B族鏈球菌(group Bstreptococcus，GBS)亦稱無乳鏈球菌，是一種β溶血的革蘭陽性鏈球菌，GBS是人類泌尿生殖道和胃腸道的定植菌，一般孕婦的定植率為10%～30%[1]，且定植率隨年齡、人種、地域的不同而不同，據(jù)報道，我國孕婦定植率為5%～15%[2]。GBS可引起圍產(chǎn)期孕婦嚴重感染，導致胎膜早破、早產(chǎn)、新生兒的宮腔感染和敗血癥等，嚴重時危及生命。而真菌作為圍產(chǎn)期孕婦的另一種條件致病菌，也會導致胎膜早破和早產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局。所以，檢測孕晚期孕婦生殖道GBS和真菌的定植狀況，采取有效的預防和治療措施是非常有必要的。本文采用血瓊脂培養(yǎng)法、顯色培養(yǎng)法及PCR法三種方法，分別進行GBS和真菌篩查，并對GBS藥物敏感性進行分析，現(xiàn)報告如下。

1材料與方法

1.1 研究對象 選擇我院2013年1月～2017年12月產(chǎn)科門診就診孕婦22 938例，孕齡35～37周，孕婦年齡21～40歲，平均年齡27.6歲，由接診醫(yī)生按規(guī)范采集孕婦陰道和肛周拭子，患者或家屬立即送檢。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 GBS培養(yǎng)鑒定：VITEK2 Compact細菌鑒定儀、GP鑒定卡、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、B族鏈球菌篩查培養(yǎng)基均為梅里埃公司產(chǎn)品。

1.2.2 GBS的藥敏定量試驗：應用梅里埃VITEK2 Compact鑒定儀、GP67藥敏卡，質(zhì)控菌株：無乳鏈球菌ATCC12386和金黃色葡萄球菌ATCC25923，均購自中國衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.2.3 PCR檢測：試劑選用泰普生物有限公司生產(chǎn)的GBS核酸檢測試劑盒，GBS核酸檢測陰、陽性對照品，均由試劑盒廠家提供；儀器為上海宏石SLAN-48P熒光定量PCR擴增儀。

1.2.4 真菌篩查：哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、B族鏈球菌篩查培養(yǎng)基及念珠菌顯色培養(yǎng)基均為梅里埃公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 標本采集：對孕35～37周的孕婦，參照2002年CDC推薦的方法，進行規(guī)范取材。準備兩根無菌女性拭子，拿一根棉拭子放入陰道內(nèi)1/3處，采取陰道分泌物，取材時不需要使用陰道窺器；另一根棉拭子插入肛門至肛門括約肌上2～3 cm處，取直腸分泌物。

1.3.2 GBS篩查方法

1.3.2.1 血瓊脂培養(yǎng)法：將采集的拭子立即送到實驗室，接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，放于35℃5 ml/dl CO2培養(yǎng)箱孵育18～36 h，挑取β溶血灰白小菌落，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢為陽性球菌，觸酶試驗(-)，分純并做CAMP試驗：即將待測菌株與金黃色葡萄球菌標準菌株(ATCC25923)，在羊血培養(yǎng)基上成90°角垂直劃線，放于37℃培養(yǎng)箱孵育過夜，如果在金黃色葡萄球菌的β-溶血素與CAMP因子擴散區(qū)域出現(xiàn)三角形增強β-溶血區(qū)，則該試驗為陽性；待次日CAMP試驗(+)，用VITEK2 Compact進行鑒定及藥敏試驗。

1.3.2.2 顯色培養(yǎng)法：將采集的拭子盡快運送到實驗室，直接接種于顯色培養(yǎng)基，放于37℃培養(yǎng)箱孵育18～36 h，挑取紅色菌落，做CAMP試驗，并分純培養(yǎng)；待次日CAMP試驗(+)，用VITEK2 Compact系統(tǒng)進行鑒定和藥敏試驗。

1.3.2.3 熒光PCR法：將采集的陰、肛拭子作為一組標本，嚴格按照GBS核酸檢測試劑盒說明書要求進行檢測和結(jié)果判定。

1.3.3 真菌篩查：將血瓊基培養(yǎng)基上灰白衛(wèi)星樣小菌落或灰白小菌落、B族鏈球菌篩查培養(yǎng)基上呈淺綠色小菌落或灰白小菌落，進行涂片和革蘭氏染色，當鏡檢為真菌孢子時，再接種于念珠菌顯色培養(yǎng)基，參照其產(chǎn)品說明書，判斷顯色結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件，進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用陽性率表示，組間差異比較采用多個樣本率的χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 三種方法檢測GBS的結(jié)果比較 見表1。顯色培養(yǎng)法篩查GBS陽性率明顯高于PCR法和血瓊脂培養(yǎng)法，該顯色方法檢出的263株呈紅色菌落，CAMP篩查試驗陽性261株，陽性率為99.2%(261/263)，263株經(jīng)VITEK2 Compact鑒定儀進行菌種鑒定，全部為GBS。三種方法檢測GBS比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=94.05，P<0.05)。雖然某些豕鏈球菌在該顯色培養(yǎng)基上也呈現(xiàn)與GBS相同的顏色，但在本研究中還未遇到。

表1 血瓊脂培養(yǎng)法、顯色培養(yǎng)法和PCR法檢測結(jié)果比較

2.2 兩種培養(yǎng)方法檢測真菌的結(jié)果比較 22 938例孕婦標本中，6 782例采用血瓊脂培養(yǎng)，檢出真菌665例(陽性率9.8%)；5 957例采用顯色培養(yǎng)基直接培養(yǎng)，檢出真菌72例(陽性率1.2%)，兩種培養(yǎng)方法對真菌的檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=429.99，P<0.05)。

2.3 培養(yǎng)法分離出的368例GBS的耐藥性分析 對培養(yǎng)法分離出的368例GBS進行藥物敏感的MIC值檢測，結(jié)果見表2。

表2 培養(yǎng)分離出的368例GBS的耐藥性分析(n=368)

3討論

3.1 自20世紀70年代以來，有報道稱GBS是侵入性新生兒感染的致病菌，而導致侵入性新生兒感染最重要的危險因素是產(chǎn)婦泌尿生殖道或胃腸道定植的GBS。1996年，美國疾病預防控制中心發(fā)布了用于預防新生兒GBS感染的推薦方案，隨后，分別在2002年與2010年進行了修訂。這些指南的實施，大幅度減少了早發(fā)型新生兒GBS感染[1]。但由于很多醫(yī)院在篩查方法上并沒有按照美國推薦的方法統(tǒng)一執(zhí)行，而且GBS定植率隨人種、地域、年齡不同而不同，檢出率差異很大。國內(nèi)有報道妊娠婦女 GBS帶菌率為3.5%～32.4%[3]，如廈門地區(qū)的14.43%[4]，山東地區(qū)的32.2%[5]，北京地區(qū)的7.3[6]%，本研究結(jié)果顯示西安地區(qū)妊娠婦女GBS帶菌率較低(4.4%)，其中血瓊脂培養(yǎng)法和PCR法的陽性率分別為1.5%和2.8%，明顯低于顯色培養(yǎng)法(4.4%)，這可能與取材、工作人員對該菌的認識、實驗操作等有關。雖然PCR法用時短，但對實驗室條件要求高、成本高、不易普及，也無法給臨床提供藥敏結(jié)果。而顯色培養(yǎng)基是一種含有3種顯色底物和抗生素的選擇性培養(yǎng)基，標本直接接種，GBS經(jīng)18～24 h呈典型紅色菌落，即可分純鑒定，該方法檢出率高、無需增菌、方便操作，培養(yǎng)出的GBS經(jīng)分純后可進行藥敏試驗，對實驗室條件要求不高，有微生物實驗室的醫(yī)院均能開展。因此，顯色培養(yǎng)法有望成為妊娠晚期孕婦常規(guī)篩查GBS定植的一種準確快速的方法。

3.2 健康婦女泌尿生殖道定植多種微生物，與宿主之間保持微生態(tài)平衡。而妊娠期婦女受激素水平的影響，陰道黏膜充血和通透性增加，容易發(fā)生感染，有研究表明感染是被公認的重要發(fā)病原因[7]。假絲酵母菌為陰道內(nèi)條件致病菌，能夠穿透絨毛膜并侵犯胎兒，導致胎膜早破和早產(chǎn)。楊淑華等[8]報道131例胎膜早破患者中，真菌占生殖道分泌物致病菌的51.1%。雖然國內(nèi)張利俠等[9]報道真菌對引起胎膜早破并沒有統(tǒng)計學意義的結(jié)論，這可能與所選人群有關，畢竟引起胎膜早破并不僅僅是這一種感染因素導致的。楊生宇等[10]報道孕晚期篩查真菌對預防胎膜早破、新生兒感染等不良妊娠結(jié)局具有非常重要的意義。本研究選用的兩種培養(yǎng)法對真菌有一定的檢出優(yōu)勢，尤其是血瓊脂培養(yǎng)陽性率為9.8%，低于李馨等[11]報道的15.74%。通過本次研究，雖然顯色培養(yǎng)法對真菌檢出率較低，但如果將兩種方法聯(lián)合使用，同時提高實驗室人員對真菌的重視和認識，在提高真菌檢出率的同時，可將GBS一并檢出，做到早發(fā)現(xiàn)、早治療。

3.3 參照美國疾病預防控制中心(CDC)推薦，把青霉素G和氨芐青霉素作為妊娠晚期GBS的預防性用藥，對青霉素過敏的孕婦，可使用紅霉素或克林霉素[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢測368株GBS，對青霉素、氨芐西林、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢吡肟、利奈唑胺和萬古霉素的敏感率均為100%；對紅霉素、克林霉素和左氧氟沙星的敏感率分別為17.9%，25.4%和66.7%。與國內(nèi)相關的研究敏感率一致[5，13]。隨著細菌耐藥性的改變，尤其是GBS對紅霉素類和克林霉素類藥物耐藥性的不斷升高，臨床在治療GBS感染的患者時，應根據(jù)藥敏結(jié)果選擇用藥。有研究表明[14]，妊娠晚期給予抗生素治療，不僅可有效減少胎膜早破、早產(chǎn)和新生兒敗血癥等，還可以提高陰道分娩率，降低剖腹產(chǎn)比例。我院自2013年至今，有一例新生兒是由GBS引起血流感染，但經(jīng)查詢該患兒是從外院轉(zhuǎn)來的，其母親在我院無產(chǎn)檢記錄，說明檢測孕婦GBS感染狀況，及時采取治療措施，對預防胎膜早破、新生兒感染等不良妊娠結(jié)局有重要的臨床價值。

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