血清miR-765和CA153聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值*

洪 宏，袁建芬，喻海忠(南通市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南通 226001)

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率、致死率均較高，且有年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性健康[1]。近年來(lái)研究表明[2，3]，微小RNA(microRNA，miRNA)的檢測(cè)可用于惡性腫瘤的早期診斷和預(yù)后判斷，多種microRNA的異常表達(dá)影響著乳腺癌的行為和進(jìn)展，其中miR-765的異常表達(dá)亦參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[4]。本研究旨在通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)乳腺癌患者血清miR-765表達(dá)和CA153的水平，探討聯(lián)合檢測(cè)模式在乳腺癌診斷中的價(jià)值，以期尋求新方法來(lái)診斷乳腺癌。

1材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2014年4月～2018年1月南通市中醫(yī)院58例行乳腺癌根治術(shù)患者、28例乳腺良性疾病患者及30例健康者靜脈血。其中乳腺癌患者術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，術(shù)前均未行任何放、化療，年齡32～71歲，平均年齡48.2歲；乳腺良性疾病患者為同期我院收治的乳腺纖維腺瘤、囊性增生及乳頭狀瘤，年齡35～68歲，平均年齡47.4歲；另健康者為女性體檢者，均無(wú)肝腎、心血管及乳腺等疾病，年齡33～69歲，平均年齡48.7歲。各組在年齡、性別上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 試劑和儀器 Trizol(Invitrogen 美國(guó))，TaqMan MicroRNA RT kit(Ambion 美國(guó))，TaqMan MicroRNA assay(Life 美國(guó))，Cobas z 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche 瑞士)；Cobas e 411電化學(xué)發(fā)光儀(Roche 瑞士)，CA153試劑及質(zhì)控品均為原裝配套試劑。

1.3 方法 術(shù)前空腹抽取靜脈血3 ml，分離血清，用Trizol法提取血液樣本中的總mRNA。分光光度儀A260nm/280nm檢測(cè)吸光度，1.8～2.2合格，進(jìn)行下一步逆轉(zhuǎn)錄。TaqMan MicroRNA RT kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min，生成的cDNA置于-70℃保存。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀使用TaqMan MicroRNA assay試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，U6為內(nèi)參，miR-765反應(yīng)體系如下：cDNA 1 μl，2×Master mix 10 μl，PCR primer 0.5 μl，20×SYBRI 1 μl，H2O 7.5 μl，共20 μl；U6體系中除去PCR primer，H2O增至 8 μl。反應(yīng)條件：95℃10 min，95℃15 s，60℃30 s(40個(gè)循環(huán))，溶解曲線(xiàn)1個(gè)循環(huán)。用2-△Ct表示miR-765的相對(duì)表達(dá)含量。用羅氏Cobas e 411型電化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)CA153。

2結(jié)果

2.1 各組血清CA153含量與miR-765相對(duì)表達(dá)水平比較 見(jiàn)表1。乳腺癌患者血清CA153的水平與乳腺良性疾病患者及健康對(duì)照者比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=26.24，P<0.01)；乳腺癌患者血清中miR-765的相對(duì)表達(dá)量低于乳腺良性疾病患者，同時(shí)低于健康體檢者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=35.97，均P<0.01)。

表1 各組血清CA153含量與miR-765相對(duì)表達(dá)水平比較

2.2 CA153含量和miR-765相對(duì)表達(dá)水平單獨(dú)檢測(cè)與聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值 見(jiàn)表2。以miR-765，CA153為自變量，建立Logistic回歸模型，通過(guò)模型中的概率值來(lái)擬合聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線(xiàn)，CA153和miR-765聯(lián)合檢測(cè)的AUC為0.903，有較好的靈敏度和特異度。

表2 血清CA153含量和miR-765相對(duì)表達(dá)水平對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值

2.3 CA153陰性患者血清miR-765相對(duì)表達(dá)水平對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值 見(jiàn)圖1。CA153<25U/ml的乳腺癌患者也可通過(guò)檢測(cè)血清miR-765相對(duì)表達(dá)量診斷乳腺癌，其靈敏度為87.5%，特異度為82.4%，AUC為0.840(95%CI：0.746～0.934，P<0.01)。

3討論microRNA是一類(lèi)非編碼的小分子RNA片段，具有高度保守性，可結(jié)合靶基因mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，以調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動(dòng)中眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細(xì)胞發(fā)育、增殖及凋亡等一系列過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[5～7]。在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，起到癌基因或抑癌基因的作用[8，9]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中microRNA可進(jìn)入血液循環(huán)，能穩(wěn)定的存在于血清當(dāng)中，表達(dá)水平可反映組織中的表達(dá)情況，且具有耐RNA酶降解，可反復(fù)凍融，能長(zhǎng)期保存等優(yōu)點(diǎn)，具備作為腫瘤標(biāo)志物的特性應(yīng)用于臨床[10，11]。有研究表明抑制乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞株中的miR-765表達(dá)有助于細(xì)胞凋亡，并發(fā)現(xiàn)其潛在的靶基因EMP3可能是腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的癌基因，在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中可能起到抑癌基因的作用[12]。

圖1 CA153<25U/ml的乳腺癌患者miR-765檢測(cè)診斷乳腺癌的ROC曲線(xiàn)

目前臨床上診斷乳腺癌首選的血清學(xué)標(biāo)志物為CA153，但其敏感度和特異度均不能滿(mǎn)足臨床需求。本研究通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)提示miR-765在乳腺癌患者血清中表達(dá)下調(diào)，單獨(dú)檢測(cè)miR-765靈敏度為87.9%，特異度為81.0%，AUC=0.843(P<0.01)，表明臨床診斷準(zhǔn)確性較高，通過(guò)ROC曲線(xiàn)確定血清miR-765表達(dá)的臨床診斷臨界值(cutoff value≤0.253)，即當(dāng)miR-765相對(duì)表達(dá)水平2-△Ct≤0.253可考慮患有乳腺癌的可能。單獨(dú)檢測(cè)CA153靈敏度僅為60.3%，特異度為91.4%，AUC為0.775(P<0.01)，通過(guò)miR-765與CA153聯(lián)合檢測(cè)，診斷乳腺癌的靈敏度可提高至89.7%，與單獨(dú)檢測(cè)CA153特異度相比稍低(86.2%)，AUC為0.903(P<0.01)，表明聯(lián)合診斷能提高診斷乳腺癌的準(zhǔn)確性，但要注意假陽(yáng)性問(wèn)題。CA153<25U/ml的乳腺癌患者中血清miR-765診斷乳腺癌的靈敏度為87.5%，特異度為82.4%，AUC為0.840(P<0.01)，提示通過(guò)對(duì)血清miR-765的檢測(cè)可以降低血清CA153<25U/ml的乳腺癌患者通過(guò)血清學(xué)篩查的漏檢率。

綜上所述，乳腺癌患者血清miR-765的表達(dá)下調(diào)，miR-765對(duì)乳腺癌診斷的靈敏度和特異度均較好，特別是miR-765聯(lián)合檢測(cè)CA153后，能顯著減少臨床的漏診率。然而，由于成本問(wèn)題，納入本研究的病例數(shù)有限，指標(biāo)的診斷價(jià)值仍需加大樣本量來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證；未對(duì)乳腺癌進(jìn)行分期，用于乳腺癌的早期診斷尚未明確；以及未進(jìn)行隨訪(fǎng)觀察乳腺癌患者的預(yù)后情況等。因此，我們的結(jié)果為血液腫瘤標(biāo)志物miR-765用于乳腺癌篩選提供了可能性，研究基于血清中miR-765和CA153兩個(gè)指標(biāo)對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值進(jìn)行了評(píng)價(jià)，僅作為臨床上一種輔助診斷的方法。

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