顱內(nèi)動(dòng)脈支架成形術(shù)后再狹窄患者血清miRNA-210，miRNA-126水平檢測(cè)的臨床應(yīng)用價(jià)值*

巨 濤，宋 波，劉文剛，岳新鵬，李 魯，劉增強(qiáng)(延安大學(xué)咸陽(yáng)醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西咸陽(yáng) 712000)

顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄是缺血性腦卒中發(fā)生和復(fù)發(fā)的重要原因，臨床上采用藥物治療但效果不理想。目前支架成形術(shù)已被證實(shí)能有效地治療顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄。然而擴(kuò)張部位血管再狹窄成為支架成形術(shù)后嚴(yán)重的并發(fā)癥[1]。因此，積極有效干預(yù)這些并發(fā)癥對(duì)降低卒中發(fā)病率、復(fù)發(fā)率及病死率具有重要意義。miRNA是由21～22個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性RNA，其通過(guò)促進(jìn)靶基因mRNA降解和(或)抑制其翻譯過(guò)程調(diào)控基因表達(dá)，廣泛參與細(xì)胞的凋亡、增 殖、分化、發(fā)育和代謝等生理學(xué)過(guò)程[2]。最近的研究認(rèn)為miRNA穩(wěn)定地存在于血液循環(huán)中，并且可能參與缺血性腦卒中的病理進(jìn)展[3]。本研究通過(guò)分析顱內(nèi)動(dòng)脈支架成形術(shù)后患者血清miRNA-210及miRNA-126的表達(dá)水平，探討兩種標(biāo)志物的變化與支架成形術(shù)后再狹窄的關(guān)系，并為腦卒中的治療提供基因依據(jù)。

1材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2015年10月～2017年10月于延安大學(xué)咸陽(yáng)醫(yī)院住院確診的顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄患者202例，均存在缺血性卒中或短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)病史。其中113例患者行支架植入治療。手術(shù)后隨訪12個(gè)月，依據(jù)支架植入治療術(shù)后擴(kuò)張部位是否有再狹窄分為再狹窄組和無(wú)狹窄組。隨訪結(jié)果顯示23例(20.3%)患者出現(xiàn)術(shù)后再狹窄，分布在椎動(dòng)脈段和頸動(dòng)脈顱內(nèi)段(12例和11例)；男性12例，女性11例，年齡47～79歲，平均年齡62.33±7.39歲；其中高血壓和糖尿病的發(fā)病率為52.17%和43.48%，52.17%的患者有吸煙史；無(wú)再狹窄患者90例，男性47例，女性43例，年齡46～77歲，平均年齡63.29±7.23歲；其中高血壓和糖尿病的發(fā)病率分別為52.22%和45.55%，49.77%的患者有吸煙史。兩組患者的性別、年齡與上述三種風(fēng)險(xiǎn)因素的發(fā)病率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者符合頸動(dòng)脈狹窄診斷；依據(jù)華法林-阿司匹林治療癥狀性顱內(nèi)動(dòng)脈疾病研究方法評(píng)估顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄率[4]，患者顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄程度為50%～99%；近期無(wú)感染性疾病史，沒(méi)有重要臟器功能障礙，能夠耐受介入手術(shù)。選取同期體檢健康者25例作為對(duì)照組，男性14例，女性11例，年齡45～77歲，平均年齡63.2±7.6歲，經(jīng)頭部MRI排除既往有腦血管疾病及顳窗穿透不良性卒中。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并得到所有參與者的知情同意。

1.2 儀器和試劑 購(gòu)買(mǎi)mirVANAPARIS試劑盒提取血清中的總RNA。應(yīng)用TaqMall RNA Reverse Transcripts Kits進(jìn)行RT-PCR。頸內(nèi)動(dòng)脈超聲檢查使用Philips IE33超聲儀。采用德國(guó)西門(mén)子公司AXIOM Artis dbc44160數(shù)字減影血管造影機(jī)評(píng)價(jià)頸內(nèi)動(dòng)脈的狹窄程度。

1.3 研究方法

1.3.1 顱內(nèi)動(dòng)脈支架成形術(shù)：采用局部麻醉，在顱內(nèi)頸動(dòng)脈段、基底動(dòng)脈和椎動(dòng)脈分別放置8F，6F和6F血管鞘。在患側(cè)頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端、基底動(dòng)脈和椎動(dòng)脈置入保護(hù)傘，釋放保護(hù)傘，將支架沿保護(hù)傘微導(dǎo)絲置入狹窄段并釋放，然后撤出保護(hù)裝置。造影復(fù)查支架植入后血管復(fù)通情況。

1.3.2 標(biāo)本采集：手術(shù)患者均于術(shù)前、術(shù)后12個(gè)月復(fù)查時(shí)分別抽取肘靜脈血5 ml，對(duì)照組于體檢時(shí)采集。血液標(biāo)本于4℃離心后取上清液，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 頸動(dòng)脈超聲檢查：患者取平臥位，頭后仰暴露頸部，應(yīng)用實(shí)時(shí)灰階二維血流顯像技術(shù)先從頸根部探測(cè)頸總動(dòng)脈近心端，然后沿血管走行方向向頭側(cè)移動(dòng)，跨過(guò)頸動(dòng)脈分叉處，分別探測(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈。將取樣容積置于所要檢測(cè)血管中心，調(diào)整最佳取樣容積大小，測(cè)量收縮期峰值流速(PSV)、舒張期最低血流速度、血管阻力指數(shù)和血管內(nèi)徑(PD)，同時(shí)觀察血管管腔有無(wú)斑塊、狹窄和閉塞等。隨訪時(shí)檢測(cè)置入頸動(dòng)脈支架長(zhǎng)軸中點(diǎn)的血管中心檢測(cè)各參數(shù)。本研究選擇PSV和PD數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較。

1.3.4 顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄檢查：患者于顱內(nèi)動(dòng)脈支架成形術(shù)前及術(shù)后12個(gè)月，分別行全腦血管造影。對(duì)照組則于體檢時(shí)進(jìn)行檢查。所有參與者采用數(shù)字減影血管造影評(píng)價(jià)腦血管的狹窄程度。

1.3.5 RNA提取及RT-PCR：采用RT-PCR方法研究顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄患者血清中miRNA-210及miRNA-126水平在支架成形術(shù)前后的表達(dá)狀況。采用Trizol法提取血清中的總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。根據(jù)操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-PCR。采用β-actin作為內(nèi)對(duì)照，用pfimer5軟件設(shè)計(jì)引物，miRNA-210引物序列為：正義鏈：5’-CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA-3’，反義鏈：5’-AGCCGCUGUCACACGCACAGUU-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小230 bp。miRNA-126的引物序列為：正義鏈：5’-AGTAAACTTCCCGGACCACTAG-3’，反義鏈：5’-GCGTAATCTGGGGTCCAGTTCA-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度260bp。β-actin的引物序列為：正義鏈：5’-AGGCACTGGGGCTTCATCTGAC-3’，反義鏈：5’-GCCTTCCATCCCTTTGCTTAG-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度560 bp。PCR反應(yīng)體系如下：10 μl 2×Taqman PCR預(yù)混物，1.30 μl cDNA，7.70 μl水；反應(yīng)條件：94℃變性10 min，60℃1 min，50個(gè)循環(huán)，于4℃結(jié)束反應(yīng)。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，通過(guò)掃描分析、計(jì)算，得出miRNA-210，miRNA-126和β-actin的光密度，以β-actin 的光密度為參考物，求出miRNA-210，miRNA-126光密度的變化值(△Ct)，以2-△Ct得到miRNA-210，miRNA-126的相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1 各組頸動(dòng)脈超聲檢查參數(shù)比較 見(jiàn)表1。與對(duì)照組比較，再狹窄組和無(wú)狹窄組的PSV均顯著增高，而PD則顯著降低，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；與無(wú)狹窄組比較，再狹窄組的PSV明顯增高，PD則明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。

表1 各組頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)徑及頸內(nèi)動(dòng)脈收縮期峰值流速比較

2.2 血清miRNA-210，miRNA-126水平比較 見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較，再狹窄組和無(wú)狹窄組血清miRNA-210顯著上調(diào)，而miRNA-126水平則顯著下調(diào)，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。與無(wú)狹窄組比較，再狹窄組的血清miRNA-210顯著上調(diào)，而miRNA-126水平則顯著下調(diào)，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。

表2 各組血清miRNA-210，miRNA-126水平比較

2.3 相關(guān)分析 再狹窄組的miRNA-210，miRNA-126水平具有負(fù)相關(guān)性(r=-0.859，P<0.01)。它們分別與頸動(dòng)脈內(nèi)徑(PD)及頸動(dòng)脈收縮期峰值流速(PCV)具有相關(guān)性(r=-0.897，0.876，P<0.01)，(r=0.868，-0.852，P<0.01)。

2.4 ROC曲線分析 以再狹窄組和未狹窄組為因變量，血清miRNA-210和miRNA-126水平的AUC分別為0.839(95%CI：0．755～0．942，P<0.01)，0.857(95%CI：0.749～0．966，P<0.01)。根據(jù)SPSS統(tǒng)計(jì)結(jié)果計(jì)算出miR-210和miR-126在最佳臨界值處診斷再狹窄發(fā)生的敏感度和特異度分別為83.7%和76.3%，83.2%和81.3%。以上提示血清miR-210和miR-126對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈介入術(shù)后再狹窄的發(fā)生有診斷意義，ROC曲線見(jiàn)圖1。

3討論頸內(nèi)動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄或閉塞是導(dǎo)致腦缺血的重要因素之一。采用血管內(nèi)介入治療可以迅速改善腦缺血患者的血管狹窄、減少卒中發(fā)生(復(fù)發(fā))的風(fēng)險(xiǎn)。由于顱內(nèi)支架介入治療后患者支架部位可能會(huì)出現(xiàn)再狹窄，因此國(guó)內(nèi)外學(xué)者重新審視該治療的有效性。但美國(guó)卒中協(xié)會(huì)和TIA二級(jí)預(yù)防指南中指出對(duì)于內(nèi)科治療無(wú)效的卒中或TIA患者可接受Wingspan支架或其它支架植入治療[5]。頸動(dòng)脈支架介入術(shù)后再狹窄被認(rèn)為是同側(cè)腦卒中發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一。研究認(rèn)為血管內(nèi)膜增生可能引起支架介入術(shù)后再狹窄的發(fā)生[6]。據(jù)報(bào)道，腦缺血患者腦組織中常存在缺氧和過(guò)量活性氧的產(chǎn)生，這些極端條件可導(dǎo)致腦細(xì)胞(包括神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞)的凋亡，進(jìn)而加重腦梗死后缺血引起的繼發(fā)性腦損傷[7～9]。因此，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管生成在腦梗死后大腦恢復(fù)中呈現(xiàn)積極的作用。然而這種作用可能引起內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度的增殖以及血管內(nèi)膜增生最終導(dǎo)致擴(kuò)張部位出現(xiàn)再狹窄。以往的研究表明，miRNAs參與缺血腦血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)節(jié)，并且與其損傷和修復(fù)有關(guān)[10]。miRNA-210被認(rèn)為可能激活Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)缺血腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移并參與新生血管生成的病理過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)急性腦梗死患者血清miRNA-210表達(dá)與對(duì)照組相比明顯升高[11]。兩種支架植入材料質(zhì)量比較的分析也印證了miRNA-210在腦缺血中的應(yīng)用。高氮無(wú)鎳不銹鋼(HNNF SS)作為支架介入材料在避免細(xì)胞凋亡、減緩支架植入再狹窄方面優(yōu)于316LSS材料。原因在于316L SS材料增加了黏附于上述材料表面的人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HuVEcs)的凋亡水平，其機(jī)制可能與鎳離子激活Fas-Caspase-8-caspase-3外源性凋亡通路相關(guān)，此信號(hào)通路也受miRNAs調(diào)節(jié)，體外試驗(yàn)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示316LSS材料表面HuVEcs中的相關(guān)基因及miRNA-210表達(dá)明顯高于高氮無(wú)鎳不銹鋼材料[12]。提示miRNA-210可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡有關(guān)，進(jìn)而參與支架植入術(shù)后再狹窄的病理過(guò)程。

圖1 miRNA-126，miRNA-210 ROC曲線

本研究結(jié)果顯示顱內(nèi)動(dòng)脈支架介入術(shù)后再狹窄組血清miRNA-210表達(dá)明顯高于無(wú)狹窄組(P=0.000)，推測(cè)介入術(shù)可能導(dǎo)致了顱內(nèi)動(dòng)脈擴(kuò)張部位的血管內(nèi)膜過(guò)度增殖促進(jìn)了術(shù)后再狹窄的發(fā)生。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)無(wú)狹窄組患者血清miRNA-210水平顯著高于對(duì)照組(P=0.000)，提示介入術(shù)后大腦處于修復(fù)狀態(tài)中，過(guò)度的修復(fù)可能增加再狹窄的風(fēng)險(xiǎn)。miRNA-210在顱內(nèi)動(dòng)脈支架介入術(shù)后再狹窄的研究尚處于起步階段，隨著對(duì)miRNA-210研究的不斷深入，相信該基因可能成為再狹窄發(fā)生和防治的重要標(biāo)志物。

既往眾多研究結(jié)果認(rèn)為miRNA-126參與缺血性卒中的病理進(jìn)展，其在缺血性腦卒中患者血清呈現(xiàn)明顯的低表達(dá)。有報(bào)道認(rèn)為miRNA-126的RS463697多態(tài)性以及其血清濃度與增加的缺血性卒中風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)[13]。miRNA-126廣泛存在于心、肺、腎等血供豐富的臟器，并特異性地在內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)[10]。Jansen等[14]發(fā)現(xiàn)miRNA-126通過(guò)內(nèi)皮微粒被傳遞到受體細(xì)胞，進(jìn)而減少血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和新生內(nèi)膜形成。Izuhara等[15]發(fā)現(xiàn)miRNA-126能夠抑制血管平滑肌細(xì)胞的分化和遷移，采用miRNA126洗脫支架能夠顯著抑制兔再狹窄模型中新生血管內(nèi)膜的形成。冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)介入治療患者的研究也顯示再狹窄組miRNA-126表達(dá)明顯低于未狹窄組[10]。以上研究提示增加的miRNA-126表達(dá)可能抑制再狹窄的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示再狹窄組患者血清miRNA-126表達(dá)顯著低于未狹窄組和對(duì)照組(P=0.000)，提示支架介入術(shù)緩解了顱內(nèi)動(dòng)脈造影陽(yáng)性患者的缺血狀態(tài)。另外無(wú)狹窄組與對(duì)照組比較，血清miRNA-126表達(dá)明顯降低(P=0.000)，提示介入術(shù)的損傷一定程度上影響了血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移，從而增加了再狹窄發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。ROC曲線的分析顯示miRNA-210和miRNA-126表達(dá)對(duì)于顱內(nèi)動(dòng)脈介入術(shù)后再狹窄的發(fā)生有診斷意義，其在最佳臨界值處也有較高的特異度和敏感度。

經(jīng)顱彩色多普勒超聲目前被用于評(píng)價(jià)顱內(nèi)動(dòng)脈支架介入前后腦血流動(dòng)力學(xué)變化以及術(shù)后再狹窄的發(fā)生。采用經(jīng)顱多普勒超聲測(cè)量頸動(dòng)脈支架介入術(shù)治療前、后頸動(dòng)脈狹窄局部管徑、狹窄段收縮期峰值流速可作為評(píng)價(jià)頸動(dòng)脈支架介入術(shù)療效的有效手段[16]。本研究相關(guān)性分析的結(jié)果顯示，再狹窄組miRNA-210和miRNA-126表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，兩標(biāo)志物分別與PD和PSV也具有相關(guān)性。提示兩標(biāo)志物與顱內(nèi)動(dòng)脈支架介入術(shù)后的再狹窄發(fā)生密切相關(guān)，可能參與了該疾病的進(jìn)展，其變化可以反映術(shù)后患者腦缺血癥狀的改善狀況。

綜上所述，檢測(cè)血清miRNA-210和miRNA-126表達(dá)對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈介入術(shù)后的療效觀察及再狹窄的預(yù)測(cè)具有重要的意義，可能為再狹窄的診斷和治療開(kāi)辟新的途徑。

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