巢氏PCR擴增低拷貝HBV全基因組方法的建立及應(yīng)用*

張 孟，李 倩，周華君，孫長貴，成 軍，戴玉柱

(中國人民解放軍第一一七醫(yī)院a.財經(jīng)中心；b.檢驗科，杭州 310013)

低濃度HBsAg乙肝感染者是以HBsAg含量≤5μg/L定義的[1]。而低濃度HBsAg乙肝感染人群在感染性疾病診斷中已越來越引起流行病學(xué)專家及臨床實驗室的重視[2，3]。在流行病學(xué)方面，慢性低濃度HBsAg乙肝感染者在普通人群和慢性HBV感染人群中的分布、基因型以及宿主的免疫功能與高濃度HBsAg人群之間存在著差異。在我國，慢性低濃度HBsAg乙肝感染者(未經(jīng)治療或藥物干預(yù)) 占HBsAg陽性人群的6.9%～23.2%，該人群主要呈現(xiàn)攜帶者狀態(tài)，且低濃度HBsAg人群存在HBVDNA復(fù)制遠低于高濃度HBsAg人群的現(xiàn)象[1，4]，因此運用常規(guī)PCR法較難完成對HBV病毒全基因的擴增。

乙型肝炎病毒(HBV)屬嗜肝DNA病毒科，基因長度約3.2 kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA病毒，其基因組中包含兩個缺口，負鏈包括基因組的全長，正鏈則因基因型的差異而不同。由于缺口的存在，PCR擴增HBV全基因相對困難，在低拷貝的樣本中更為明顯，1995年Gunther等[5]設(shè)計的負鏈末端缺口區(qū)引物，避免了基因擴增時跨缺口處的延伸。本文利用在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上建立的巢式PCR(nested PCR)技術(shù)，采用兩對PCR引物，進行兩輪PCR擴增，實現(xiàn)對低拷貝目的片段高效、特異性的擴增，且重點介紹利用簡并引物與缺口區(qū)引物相結(jié)合的巢氏PCR法，對低拷貝HBV DNA全基因擴增方法的建立以及反應(yīng)條件的優(yōu)化。

1材料與方法

1.1 研究對象 分別收集10例HBV DNA高濃度樣本用于方法學(xué)驗證與實驗的優(yōu)化，并收集我院2016～2017年低濃度HBsAg(<10IU/ml)標(biāo)本57例。男性28例，女性29例，年齡15～82歲，中位年齡42歲。以無菌5ml促凝管收集靜脈血3～5 ml，室溫靜置2 h后于11 000×g離心5 min，吸取上層血清至無菌1.5 ml離心管中。血清樣本-80℃凍存，避免反復(fù)凍融。

1.2 試劑與儀器 病毒的核酸提取試劑與核酸提取儀，購自天隆生物科技有限公司，實時熒光定量PCR試劑盒購自艾康生物有限公司，PCR反應(yīng)體系中Taq酶，dNTP，PCR緩沖液，質(zhì)粒載體(pMDTM19-T)，DNA Marker購自日本TaKaRa公司，瓊脂糖購自西班牙，S1000梯度擴增儀、電泳儀購自美國伯樂公司，凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能有限公司。

1.3 方法

1.3.1 核酸的提取與質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品定量標(biāo)準(zhǔn)：血清HBV DNA提?。菏占∪搜逵?.5 ml離心管中，取血清500 μl加50 μl蛋白酶K消化(濃縮5倍)，其余步驟均按試劑說明書要求操作(天隆科技)，采用磁珠法純化核酸；提取核酸終體積為100 μl，分裝5管各20 μl，將分裝好的核酸于-80℃凍存，每次使用取出一支，盡量減少反復(fù)凍融。質(zhì)粒構(gòu)建：首先合成各基因標(biāo)準(zhǔn)品片段，將其連接至質(zhì)粒載體(pMDTM19-T)上，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α后進行培養(yǎng)。選擇陽性克隆株經(jīng)PCR和測序鑒定后提取質(zhì)粒DNA，利用核酸檢測儀測量質(zhì)粒DNA的濃度，確定DNA的拷貝數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)品定量母液(108～109IU/ml)。將標(biāo)準(zhǔn)品定量母液稀釋至104IU/ml，置-80℃保存。

1.3.2 引物設(shè)計：根據(jù)HBV全基因不同亞型的比較及HBV病毒核酸的特性設(shè)計通用引物，另外結(jié)合文獻報道[5，6]，進行了相應(yīng)改進，并進行BLAST(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)序列比對驗證引物特異性，具體序列見表1，引物由上海生物工程有限公司提供。

表1 巢氏PCR分段擴增HBV基因組所用引物

注：表中“*”代表PCR反應(yīng)第一輪外引物，而“#”表示PCR反應(yīng)第二輪內(nèi)引物。引物序列參照標(biāo)準(zhǔn)株(NC_003977)。

1.3.3 PCR擴增條件優(yōu)化：文獻[6]已將部分PCR擴增的條件進行了優(yōu)化和明確，本文在此文獻基礎(chǔ)之上引入了一對缺口引物(表1中P3，P4)，因此文章的優(yōu)化和評價主要集中在Ⅰb和Ⅳ段。

1.3.3.1 退火溫度優(yōu)化：使用8個不同的退火溫度(50～65℃)巢式PCR擴增HBV全基因，首先選出第1輪退火溫度后，再以此退火溫度下擴增的產(chǎn)物來篩選第2輪擴增的退火溫度。第1輪PCR反應(yīng)總體積為25 μl，反應(yīng)體系為：選取乙肝質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(經(jīng)實時熒光定量PCR檢測104IU/ml)3 μl，HBV DNA 第一輪外側(cè)引物濃度為0.2 μmol/L，Mg2+濃度為3 mmol/L，dNTP濃度為0.2 mmol/L，Taq酶20 U/ml；反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，8個退火溫度分別30 s，72℃延伸1 min，共循環(huán)35次，最后72℃再延伸2 min。取第1輪擴增產(chǎn)物3 μl，再用內(nèi)側(cè)引物進行第2輪PCR擴增，使用8個不同退火溫度(50～65℃)退火，其他反應(yīng)條件同第1輪。使用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測巢式PCR產(chǎn)物。觀察不同退火溫度組合對巢式PCR非特異性擴增的影響。

1.3.3.2 引物濃度優(yōu)化：在已確定好的退火溫度下，選擇陽性與陰性樣本，第1輪PCR分別使用2對外側(cè)引物濃度0.2 μmol/L，其他反應(yīng)條件不變。而后取第1輪擴增產(chǎn)物分別進行產(chǎn)物稀釋(1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32)，吸取稀釋后產(chǎn)物3 μl，再用濃度為0.2 μmol/L的內(nèi)側(cè)引物在確定的退火溫度下進行第2輪PCR擴增并按照不同的稀釋比例增加擴增循環(huán)數(shù)(1，2，3，4，5)，其他反應(yīng)體系與條件不變。使用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測巢式PCR產(chǎn)物。觀察不同引物濃度組合對巢式PCR非特異性擴增的影響。

1.3.4 靈敏度分析：使用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(1 600 IU/ml)以2倍比例進行稀釋，分別使用Ⅰb，Ⅳ段引物(改良后)與文獻[5，6]報道引物(改良前，1797r：CCAATTTMTGCYTACAGCCTC； 1584f：ACTTCGMBTCACCTCTGCACGT)進行擴增，使用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳巢式PCR產(chǎn)物。觀察這兩段PCR擴增反應(yīng)的靈敏度。

1.3.5 重復(fù)性分析：分別使用不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(102IU/ml，103IU/ml，104IU/ml)，進行Ⅰb，Ⅳ段引物擴增，每個濃度擴增3次，使用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測巢式PCR產(chǎn)物，觀察PCR擴增產(chǎn)物結(jié)果重復(fù)性。

2結(jié)果

2.1 退火溫度優(yōu)化 電泳結(jié)果見圖1。Ⅰb，Ⅳ段在第1輪和第2輪PCR的退火溫度均為59.5℃。

注：A，B分別表示Ⅰb第1，2輪擴增產(chǎn)物；C，D分別表示Ⅳ第1，2輪擴增產(chǎn)物；1～8分別是不同退火溫度(65℃，64.1℃，62.5℃，59.5℃，55.9℃，53℃，51℃，50℃)；M為電泳Marker。

2.2 引物濃度優(yōu)化 不同引物濃度的組合，見圖2。Ⅰb，Ⅳ段反應(yīng)體系的最適引物濃度為：Ⅰb段外側(cè)引物0.025 μmol/L，內(nèi)側(cè)引物0.2 μmol/L，條帶單一，且非特異性擴增下降，陰性中彌散背景消失；當(dāng)Ⅳ段外側(cè)引物濃度0.05～0.4 μmol/L之間，內(nèi)側(cè)引物濃度為0.2 μmol/L，擴增產(chǎn)物目的條帶單一，且擴增產(chǎn)物亮度一致。當(dāng)外側(cè)引物濃度<0.05 μmol/L時，擴增效率明顯下降。

2.3 靈敏度分析 見圖3。Ⅰb，Ⅳ兩段缺口區(qū)引物擴增靈敏度優(yōu)于跨缺口引物，其靈敏度分別為25 IU/ml，50～100 IU/ml。

注：A，B圖分別為Ⅳ，Ⅰb段擴增產(chǎn)物圖，1～7分別代表不同引物濃度(0.006 25，0.012 5，0.025，0.05，0.1，0.2，0.4 μmol/L)。

注：A，B分別為Ⅰb段原引物與改進后引物擴增產(chǎn)物圖；C，D段為Ⅳ段原引物與改進后引物擴增產(chǎn)物圖。1為陰性對照，2～8依次為25，50，100，200，400，800，1 600 IU/ml。

2.4 重復(fù)性分析 分別使用不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)及血清樣品，進行多次擴增，結(jié)果見圖4，產(chǎn)物條帶單一，清晰穩(wěn)定，大小一致，重復(fù)性好。

注：A，B分別為Ⅰb，Ⅳ段；1為陰性對照；2～4為100 IU/ml，5～7為103 IU/ml，8～10為104 IU/ml。

2.5 測序驗證 測序結(jié)果見圖5。各堿基的測序峰形單一，沒有出現(xiàn)結(jié)合干擾，進一步說明該方法的可行性，且各段測序后的拼接序列，均通過Blast驗證可知，與已知HBV DNA序列具有較高的同源性(>98%)，進一步說明測序結(jié)果有較好的準(zhǔn)確性。

圖5 各目的片段測序結(jié)果截圖

2.6 低濃度HBsAg感染者樣本檢測 慢性低濃度HBsAg乙肝感染者樣本135例，其中化學(xué)發(fā)光法定量檢測HBsAg<10IU/ml的57例，其中全基因擴增49例(86.0%)，各片段(Ⅰa，Ⅰb，Ⅱa，Ⅱb，Ⅲ，Ⅳ)擴增分別為：53例(93.0%)，52例(91.2%)，54例(94.7%)，54例(94.7%)，55例(96.5%)，49例(86.0%)。

3討論乙型肝炎是我國最為常見的病毒性肝炎，因此研究乙型肝炎全基因的擴增方法有很多，但因為乙型肝炎病毒的基因組含有缺口，所以在擴增時很容易出現(xiàn)非特異的擴增，我們研究的低濃度HBsAg乙肝感染者，多數(shù)以較低的病毒復(fù)制為主，以至于這部分人群的全基因擴增更為困難。而巢氏PCR的運用解決了低拷貝樣本的擴增問題，但對于引物的要求則更高。由于外側(cè)、內(nèi)側(cè)引物間容易出現(xiàn)非特異性的結(jié)合，所以選擇合適的引物至關(guān)重要[7，8]。

低拷貝樣本提高擴增目的產(chǎn)物的量及純度，受到多重因素的影響，其中包括引物(濃度和特異性)、酶(擴增效率、保真性、濃度)、Mg2+濃度、退火(溫度和時間)、模板(濃度、純度和完整性)、延伸(溫度和時間)等因素的影響。如何對低拷貝樣本進行高效擴增需要多個因素綜合考慮[9，11]，但我們也應(yīng)當(dāng)分主次，以及先后，在巢氏PCR中選擇合適的酶以后，首先應(yīng)當(dāng)對引物的特異性、退火溫度、濃度進行篩選，只有如此才能保證后續(xù)擴增的順利進行。

由Gunther等[5]設(shè)計的負鏈末端缺口區(qū)引物，避免了PCR在缺口區(qū)的延伸，提高了擴增效率，降低了非特異擴增，但該方法在擴增低拷貝樣本時，由于擴增的產(chǎn)物長度過長，容易出現(xiàn)錯配以及擴增不出的情況，為此只能降低目的片段的長度。另外乙型肝炎病毒有多個基因型，病毒的保守性差，為引物設(shè)計的通用性帶來了難度[12]，為此Chook等[6]設(shè)計簡并引物擴增HBV全基因，縮短了產(chǎn)物擴增的長度，同時各目的片段間重疊區(qū)域大，有利于比對擴增中的錯配；缺點是沒有考慮到引物擴增過程中的非特異性污染(引物濃度對于擴增產(chǎn)物的影響)，以及乙肝病毒核酸的特點(病毒基因組含有缺口) ，本文著重彌補了這兩個方面的不足，并對引物的性能及方法學(xué)可行性進行了驗證。

目前，市場上多數(shù)擴增商品試劑盒已經(jīng)把基本擴增的條件標(biāo)注清楚，可是我們在使用過程中，巢氏PCR的引物濃度必須進行篩選，其中圖2，我們可以看出，當(dāng)使用第Ⅳ段引物擴增時，引物在常用濃度范圍(0.2～0.4 μmol/L)內(nèi)，甚至更低時對擴增的產(chǎn)物均無明顯影響(>0.025 μmol/L)。而Ⅰb段擴增時，當(dāng)外側(cè)引物>0.025 μmol/L時，樣本擴增產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性條帶或彌散，陰性對照中同樣出現(xiàn)彌散，分析原因為外側(cè)引物濃度過高，以至于第1輪反應(yīng)結(jié)束，仍剩余過多的引物，過多的外引物與內(nèi)引物形成非特異性的橋接，致使產(chǎn)物電泳圖背景加深，當(dāng)引物為0.025 μmol/L時，擴增產(chǎn)物單一并且無非特異擴增。

靈敏度分析(圖3)的結(jié)果可以看出，HBV全基因缺口區(qū)對于HBV擴增的影響，尤其是Ⅳ段，之前報道的引物是進行跨缺口延伸，圖3中看出原引物擴增的目的片段存在拖尾及非特異性的條帶，這說明產(chǎn)物在跨缺口擴增時發(fā)生了非特異性擴增，而更換后的引物，目的條帶清晰、單一、無拖尾或彌散。在臨床慢性低濃度HBsAg乙肝感染者中使用該套巢氏引物，大大提高了全基因擴增率，為這部分人群的全基因研究奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，本文建立和改良的巢氏PCR法具有較高的靈敏度和特異度，適用于慢性乙型肝炎低濃度HBsAg感染者全基因分析，且適用于HBV DNA低拷貝全基因擴增。

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