結(jié)直腸癌患者組織中K-ras和BRAF基因突變與不同病理特征的相關(guān)性分析*

史 敏，郭曉波，李思遠(yuǎn)，孟婷婷，尚叢珊(.西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院，西安 705；.西安市中心醫(yī)院，西安 7000；.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，西安 70004)

結(jié)直腸癌(CRC)是全球最常見的消化道腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。因其發(fā)病隱匿，發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已到中晚期，臨床常規(guī)治療如化療和手術(shù)治療并不能有效控制死亡率。隨著科技的進(jìn)步，人們?cè)诜肿铀綄?duì)CRC進(jìn)行了研究，以期尋找到有價(jià)值的CRC標(biāo)志物[2～4]。然而，CRC發(fā)病可能受多個(gè)基因突變影響及信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，由表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)介導(dǎo)的下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，如RAS/RAF/MAPK，PI3K/AKT等的激活，與CRC的形成和發(fā)展具有密切關(guān)系，而K-ras基因和BRAF基因在EGFR信號(hào)通路中發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)及調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用[5]。一旦K-ras基因和BRAF基因發(fā)生突變，細(xì)胞正常的生理功能將會(huì)被打破，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或癌變。因此，本研究將通過(guò)檢測(cè)CRC患者組織中K-ras基因和BRAF基因的突變，分析結(jié)腸癌和直腸癌相應(yīng)的突變率、突變位點(diǎn)及特征，從而探索CRC基因治療的靶點(diǎn)。

1材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2014年5月～2016年11月期間來(lái)西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院胃腸外科進(jìn)行手術(shù)治療的CRC患者130例，其中男性75例，女性55例，年齡23～91歲，平均年齡65.62歲。收集的130例CRC手術(shù)標(biāo)本中，結(jié)腸癌67例，直腸癌63例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的51例，無(wú)轉(zhuǎn)移的79例；肉眼觀分型有68例潰瘍型，42例隆起型，20例蕈傘型；鏡下組織學(xué)分型有22例黏液腺癌，108例管狀腺癌。取每個(gè)患者的正常結(jié)直腸組織、CRC瘤組織進(jìn)行研究，取得新鮮CRC組織標(biāo)本后立即放入液氮罐中速凍備用。

1.2 試劑和儀器 DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒，購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；KRAS基因7種突變檢測(cè)試劑盒(ADx-KR04)，BRAF基因V600E突變檢測(cè)試劑盒(ADx-BR03)，均由廈門艾德公司提供；紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)GE 公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(7900)購(gòu)自Applied Biosystems公司；Nano Drop分光光度計(jì)、臺(tái)式高速低溫離心機(jī)均購(gòu)自Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 總DNA的提?。喝〕鲆蜒心ズ玫男迈r結(jié)腸癌組織標(biāo)本，根據(jù)DNeasy Blood & Tissue Kit(德國(guó)Qiagen)試劑盒說(shuō)明書的具體操作要求提取標(biāo)本中的總DNA，經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度及純度。所有樣本的A260 nm/A280 nm均在1.8 以上[6]。

1.3.2 K-ras基因突變檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)K-ras突變。解凍K-ras陽(yáng)性質(zhì)控品和Taq酶，將陽(yáng)性質(zhì)控品振蕩混勻后離心。分別向待測(cè)樣品DNA、陽(yáng)性質(zhì)控品(STD)和純化水(NTC)中加入Taq酶，振蕩混勻，快速離心。在PCR管冰架上將混勻的DNA樣品放入PCR管中，再將PCR管放入實(shí)時(shí)PCR儀器。操作如下：首先，95℃預(yù)變性5min；然后，根據(jù)變性→退火→延伸原理，于95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s條件下進(jìn)行15個(gè)循環(huán)；最后，于93℃ 25s，60℃ 35s，72℃ 20s條件下再進(jìn)行31個(gè)循環(huán)，待反應(yīng)結(jié)束后收集信號(hào)。

1.3.3 BRAF基因突變檢測(cè)：同樣采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)BRAF突變。解凍反應(yīng)混合液，振蕩混勻后離心。以特定比例將反應(yīng)混合液與Taq酶混合。將上述的反應(yīng)混合液分裝到PCR反應(yīng)管中。將待檢測(cè)的DNA樣品離心后連同反應(yīng)混合液一同放入實(shí)時(shí)PCR儀器。操作如下：首先，95℃預(yù)變性5 min；然后，于95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s反應(yīng)條件下進(jìn)行15個(gè)循環(huán)；最后，于93℃ 25s，60℃ 35s，72℃ 20s條件下31個(gè)循環(huán)，后收集信號(hào)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0進(jìn)行處理分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)[n(%)]表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 K-ras基因突變情況 130例CRC患者中，K-ras基因突變率為36.15%(47/130)，其突變率直腸癌患者高于結(jié)腸癌患者的突變率[47.62%(30/63) vs 25.37%(17/67)]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.691，P<0.01)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)直腸癌Gly12ASP位點(diǎn)突變率高于結(jié)腸癌突變率[46.03%(29/63) vs 26.87%(18/67)]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.167，P<0.05)。

2.2 K-ras基因突變與臨床或病理指標(biāo)的關(guān)系 見表1。K-ras基因突變率在Ⅰ+Ⅱ期CRC患者中明顯低于Ⅲ+Ⅳ期CRC患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=30.049，P<0.01)，但在其他指標(biāo)如性別、年齡、病變大體觀及組織分型中，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 K-ras基因突變與臨床或病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 BRAF基因突變及其與術(shù)前血清CA199的關(guān)系 130例CRC患者中，BRAF基因突變率為6.92%(9/130)，其在結(jié)腸癌患者中為11.94%(8/67)，高于直腸癌患者[1.59%(1/63)]的突變率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(使用Fisher確切概率法P=0.033)。BRAF基因突變率在CRC患者術(shù)前血清CA199水平升高者明顯高于CA199水平正常者[11.59%(8/69) vs 1.64%(1/61)，使用Fisher確切概率法P=0.036]。

3討論結(jié)直腸癌(CRC)是全球發(fā)病率極高的惡性腫瘤之一，據(jù)報(bào)道，目前全球CRC的病死率已高達(dá)69萬(wàn)人[7]。因此，尋找具體的CRC分子靶向藥物的治療靶點(diǎn)，進(jìn)而有效控制死亡率及提高患者的生存質(zhì)量已經(jīng)成為當(dāng)今CRC研究的重大挑戰(zhàn)。以往研究表明，與CRC發(fā)病相關(guān)的主要基因突變靶點(diǎn)和信號(hào)調(diào)控通路中，研究最多且最典型的是EGFR所介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，其介導(dǎo)的下游Ras-RAF-MAPK和PI3K-AKT-mTOR通路持續(xù)激活與CRC的形成、發(fā)展具有密切的關(guān)系，而K-ras，BRAF及PIK3CA基因正是導(dǎo)致下游傳導(dǎo)信號(hào)通路持續(xù)激活的主要原因之一[8]。其他研究也顯示，在CRC發(fā)病進(jìn)程中存在多基因共同調(diào)控，多種基因在CRC的形成及發(fā)展中各自扮演著不同的角色[9]。

K-ras/BRAF/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路在結(jié)直腸癌的發(fā)生中起重要作用，以往研究表明，大部分對(duì)CRC病理機(jī)制的研究都是圍繞K-ras基因突變?cè)贓GFR信號(hào)傳導(dǎo)通路中的具體作用而進(jìn)一步深化的。在EGFR信號(hào)通路中，K-ras基因至關(guān)重要，其一旦突變將導(dǎo)致K-ras基因自身磷酸化進(jìn)程，進(jìn)而使下游BRAF基因開始磷酸化，二者磷酸化可促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤的發(fā)展。

基于此，本研究對(duì)130例CRC患者腫瘤組織中的K-ras基因與BRAF基因的突變進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CRC患者的基因突變以K-ras突變?yōu)橹?，BRAF基因突變僅占較小的比例。而且，K-ras基因在Ⅰ+Ⅱ期CRC患者中的突變率明顯低于Ⅲ+Ⅳ期患者。這說(shuō)明K-ras基因突變是CRC的常見事件，且BRAF基因突變?cè)贑RC中很少見，因此聯(lián)合檢測(cè)K-ras和BRAF基因?qū)RC患者的診斷和治療具有重要意義。而且研究顯示，隨著CRC患者TNM分期增高，K-ras基因突變率也在大大升高，這說(shuō)明了K-ras基因突變率與CRC病變程度呈正相關(guān)性，從而顯示了K-ras基因檢測(cè)在預(yù)測(cè)疾病預(yù)后方面的潛力。本研究結(jié)果與前期的研究[10]結(jié)果相似，均顯示了聯(lián)合檢測(cè)K-ras和BRAF基因在CRC診斷和治療預(yù)后方面的潛在價(jià)值。

本研究關(guān)于K-ras基因突變率的檢測(cè)結(jié)果顯示，除與患者病變TNM分期具有相關(guān)性外，與其他具體的病理學(xué)特征如性別、年齡、組織學(xué)分型等無(wú)關(guān)，這一點(diǎn)與其他關(guān)于CRC的研究結(jié)果[11]相似，從而為西妥昔單抗藥物的使用提供參考依據(jù)。另外，本研究還顯示，K-ras基因上的Gly12ASP位點(diǎn)突變與直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這也符合之前的研究結(jié)果[12]。關(guān)于本研究中血清CA199水平與BRAF基因突變的相關(guān)性，目前并未見相關(guān)報(bào)道。

綜上所述，CRC的發(fā)病是所有不利因素共同作用的結(jié)果，在這些不利因素中K-ras基因、BRAF基因突變的影響最為顯著，K-ras和BRAF基因突變靶點(diǎn)的相關(guān)研究有望為CRC的分子靶向治療提供有力的理論支持，也為后期篩選針對(duì)性更強(qiáng)的靶向治療藥物提供了理論基礎(chǔ)。

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