人TLR2胞外區(qū)基因酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)研究*

孫守勛，劉 靜，解立威，柏雪婷，單 娜，孟冬婭

(1.中一東北國(guó)際醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，沈陽 110179；2.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，沈陽 110003)

Toll樣受體2(TLR2) 是目前已知的識(shí)別配體最多的Toll樣受體，在人體內(nèi)與脂多糖(LPS)發(fā)生反應(yīng)，識(shí)別各種病原微生物后激活固有免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)T細(xì)胞分化成熟后啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[1～3]。TLR2的胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域是受體作用的重要功能區(qū)域，在TLR2參與的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮著組織和引導(dǎo)的重要作用，與TLR2的配體特異性密切相關(guān)，在其所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中，其胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域是一個(gè)很有前景的炎性介質(zhì)的阻斷劑，因此具有潛在的抗炎治療價(jià)值[4]，更是值得我們?cè)诓煌瑢哟紊霞右陨钊胙芯?。本?shí)驗(yàn)采用酵母雙雜交系統(tǒng)，構(gòu)建了TLR2胞外區(qū)基因的酵母表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化酵母菌Y187對(duì)其進(jìn)行表達(dá)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1 材料與試劑 含有TLR2胞外區(qū)cDNA的重組質(zhì)粒pAdTrack-TLR2由前期實(shí)驗(yàn)工作完成[3]。表達(dá)載體pGBKT7及酵母菌株Y187，酵母YPD培養(yǎng)基，SD/-Trp等培養(yǎng)基購(gòu)自Clontech公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司；pMD18-T載體，Taq酶，T4DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I為TakaRa公司產(chǎn)品；c-myc單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG(HRP-IgG)購(gòu)自北京中山生物公司；醋酸鋰、半硫酸腺苷，IPTG，X-gal為Sigma產(chǎn)品；其余試劑為進(jìn)口及國(guó)產(chǎn)分析純，引物合成及DNA測(cè)序由上海英駿公司完成。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴(kuò)增及序列測(cè)定：根據(jù)GenBank中人TLR2基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增TLR2胞外區(qū)序列的引物，設(shè)計(jì)方法同筆者發(fā)表文獻(xiàn)[5]，上游引物包含EcoR I的酶切位點(diǎn)(下劃線表示)：5’-GCCGAATTCATGCCACATACTTTGTGGA TGGT-3’，下游引物包含Sal I的酶切位點(diǎn)(下劃線表示)：5’-CGGGTCGACTCACATTAAGGGTACAGTCATCAG-3’，內(nèi)含啟動(dòng)子ATG和終止密碼子TCA。應(yīng)用設(shè)計(jì)的引物，以質(zhì)粒pAdTrack-TLR2為模板，建立PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增目的基因，與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后行測(cè)序鑒定，具體操作步驟同筆者發(fā)表文獻(xiàn)[4]。

1.2.2 酵母表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7-TLR2的構(gòu)建：構(gòu)建的pMD18-TLR2質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定后，酶切回收目的片段。用EcoRI和Sal I雙酶切pGBKT7質(zhì)粒使之線性化后，用T4DNA連接酶16℃過夜與目的片段連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，篩選陽性克隆。

1.2.3 重組質(zhì)粒pGBKT7-TLR2轉(zhuǎn)化酵母菌及自激活作用檢測(cè)：按常規(guī)方法將酵母菌Y187制備成感受態(tài)，將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pGBKT7-TLR2轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞Y187，具體操作按Clontech公司提供的說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)化后鋪板于SD/-Trp/X-gal培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，觀察轉(zhuǎn)化菌的生長(zhǎng)情況。

1.2.4 SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Y187后在SD/-Trp/X-gal培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天后，挑取白色、直徑2～3 mm大小的菌落接種于SD/-Trp培養(yǎng)液中，30℃振蕩過夜，再轉(zhuǎn)入到50 ml YPD培養(yǎng)液中，繼續(xù)振搖至A600達(dá)到0.5，離心收菌，按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western-blot檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物，同時(shí)以未轉(zhuǎn)化的酵母菌株Y187作為空白對(duì)照。

2結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物的分析及序列測(cè)定 取PCR產(chǎn)物經(jīng)1 ml/dl瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1 000 bp左右，同預(yù)期目的片段的大小符合，見圖1。該片段經(jīng)測(cè)序證實(shí)結(jié)果與GenBank中序列一致。

2.2 重組質(zhì)粒pGBKT7-TLR2的鑒定 提取重組質(zhì)粒pGBKT7-TLR2經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切鑒定，可見1 000 bp的目的片段條帶，證明插入片段正確，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖2。

2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌 我們選用的Y187菌株，在其轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)下游含有LacZ報(bào)告基因，其被激活后，在X-gal存在時(shí)，酵母菌克隆為藍(lán)色。實(shí)驗(yàn)中當(dāng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Y187后在SD/-Trp/X-gal缺陷培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天后，在平板上長(zhǎng)出白色菌落，說明TLR2胞外區(qū)蛋白對(duì)酵母菌無毒性，同時(shí)也無自發(fā)激活LacZ報(bào)告基因的作用。

1：DNA marker DL2000；2：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

M：DNA marker DL2000；1：pGBKT7經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切；2：pGBKT7-TLR2經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切。

2.4 TLR2胞外區(qū)蛋白在酵母細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè) 酵母細(xì)胞蛋白提取液經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western-blot檢測(cè)TLR2胞外區(qū)蛋白的表達(dá)，在轉(zhuǎn)入pGBKT7-TLR2的菌株中出現(xiàn)33KD的特異性目的條帶，而未轉(zhuǎn)化的Y187菌株雜交結(jié)果為陰性，見圖3。

1：未轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞；2～4：轉(zhuǎn)入pGBKT7-TLR2的酵母細(xì)胞。

3討論目前，Toll樣受體2(TLR2)在免疫應(yīng)答各個(gè)環(huán)節(jié)中的功能和作用日漸引起研究者們的廣泛關(guān)注，其胞外區(qū)與果蠅具有高度的同源性，是識(shí)別病原體的重要結(jié)構(gòu)成分[6，7]，在TLR2介導(dǎo)的免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，一直以來對(duì)于TLR2的研究包括其結(jié)構(gòu)與功能，病原體識(shí)別的模式，信號(hào)傳導(dǎo)途徑等眾多方面。已知在Toll樣受體家族中，TLR2是表達(dá)范圍最廣、識(shí)別病原微生物及其產(chǎn)物種類最多的分子，它不僅可對(duì)病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular paterns，PAMPs)進(jìn)行識(shí)別、結(jié)合，并引發(fā)一系列的信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放，引起天然免疫防御，還能夠介導(dǎo)對(duì)熱休克蛋白等內(nèi)源性抗原的識(shí)別，是聯(lián)系天然免疫和獲得性免疫的橋梁[8]。近年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，痤瘡丙酸桿菌可以通過TLR2依賴的NF-kB途徑調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥及免疫反應(yīng)，如果抑制TLR2的功能與表達(dá)，就有可能抑制痤瘡的進(jìn)展，研制出治療痤瘡的新型藥物[9]。顧燁[10]的研究顯示TLR2在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病和發(fā)展過程中起關(guān)鍵性作用?？梢奣LR2在免疫反應(yīng)和許多疾病發(fā)展中扮演重要角色，對(duì)其在各個(gè)方面還有深入研究的意義。本實(shí)驗(yàn)正是采用酵母雙雜交系統(tǒng)，構(gòu)建了TLR2胞外區(qū)基因的酵母表達(dá)載體以進(jìn)行后續(xù)的深入研究。

酵母雙雜交技術(shù)與其他在體外檢測(cè)蛋白間相互作用的方法相比具有快速、有效、便捷的優(yōu)點(diǎn)，由于是在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，比其它體外試驗(yàn)更能夠在某種程度上反映蛋白質(zhì)在生理?xiàng)l件下的活性狀態(tài)，該技術(shù)能夠保持蛋白質(zhì)間結(jié)構(gòu)的完整性，提高反應(yīng)的靈敏度和檢測(cè)的精確度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠[11]。本實(shí)驗(yàn)首先擴(kuò)增了TLR2胞外區(qū)基因，并將之克隆到酵母表達(dá)載體上，經(jīng)測(cè)序及酶切驗(yàn)證無誤，表明載體構(gòu)建成功。但是酵母雙雜交也有一定的缺陷性，目的蛋白在酵母菌株表達(dá)時(shí)有產(chǎn)生毒性的可能，引起假陰性，或可能直接激活報(bào)告基因而產(chǎn)生假陽性，排除這些影響因素將是目的蛋白能否在酵母系統(tǒng)中正確表達(dá)的關(guān)鍵[12]。本研究中構(gòu)建的表達(dá)載體pGBKT7-TLR2轉(zhuǎn)化到酵母菌Y187中，利用報(bào)告基因LacZ檢測(cè)誘餌蛋白有無自激活作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，轉(zhuǎn)化的重組載體在SD/-Trp/X-gal平板中生長(zhǎng)出白色克隆子，表明融合表達(dá)載體能在酵母中表達(dá)，無毒性和自激活作用，酵母細(xì)胞蛋白提取液經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western-blot檢測(cè)TLR2胞外區(qū)蛋白能在酵母菌中穩(wěn)定表達(dá)。綜合以上，我們建立的目的基因蛋白表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)深入了解TLR2胞外區(qū)蛋白的功能、生物活性及信號(hào)傳導(dǎo)途徑具有重要意義。

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