普洱茶中黃曲霉毒素的研究

◎ 蔡雙福，陳曉嘉，陳敏婷，鐘舒潔

（1.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站,廣東 廣州 510308；

2.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510308；

3.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東 廣州 510308）

黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）屬真菌毒素，是由黃曲霉菌和寄生曲霉菌所產(chǎn)生的一類(lèi)次生代謝產(chǎn)物[1]，可引起肝臟、腎臟等多種組織器官損傷，具有致癌、致畸、致細(xì)胞突變的作用，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為Ⅰ類(lèi)致癌物質(zhì)，嚴(yán)重危害人、畜、禽類(lèi)健康[2]。GB 2761-2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中規(guī)定[3]，食品黃曲霉毒素的限量范圍特殊膳食用食品≤0.5 μg/kg，其他食品≤5 μg/kg，則認(rèn)為此類(lèi)食品對(duì)人類(lèi)不產(chǎn)生較大風(fēng)險(xiǎn)。

普洱茶是以地理標(biāo)志保護(hù)范圍內(nèi)的云南大葉種曬青茶為原料，并采用特定的加工工藝制成，具有獨(dú)特品質(zhì)特征的茶葉[4]。普洱茶的倉(cāng)儲(chǔ)陳化是普洱茶生產(chǎn)不可缺少的環(huán)節(jié)，而儲(chǔ)存過(guò)程又易受到霉菌的污染，以致近年來(lái)大家討論普洱茶受霉菌污染產(chǎn)生黃曲霉毒素，易致癌等報(bào)道在業(yè)界引起了廣泛關(guān)注[5-9]。針對(duì)這一問(wèn)題，結(jié)合前人所進(jìn)行的研究，本文通過(guò)容易受黃曲霉污染產(chǎn)生黃曲霉毒素的花生粉作為對(duì)照組，對(duì)室溫條件、高溫高濕條件、自然條件污染下與接種產(chǎn)毒黃曲霉進(jìn)行保存實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)保存過(guò)程中黃曲霉和黑曲霉的含量。同時(shí)采用常規(guī)快速法酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和先進(jìn)可靠的檢測(cè)方法高效液相法（HPLC）和超高效液相色譜質(zhì)譜法（LC-MS/MS）對(duì)黃曲霉毒素進(jìn)行檢測(cè)，分析不同實(shí)驗(yàn)組黃曲霉毒素的變化情況及不同方法結(jié)果差異情況。全面解釋普洱茶是否容易產(chǎn)生黃曲霉毒素，為普洱茶安全生產(chǎn)、消費(fèi)者的擔(dān)憂提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 產(chǎn)毒菌種

黃曲霉（A. flavus）CICC 2219，來(lái)自于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)樣品

市場(chǎng)出售的中低檔普洱茶茶葉各2批次，其中生普洱、熟普洱各2批，實(shí)驗(yàn)前打成較小顆粒，易于霉菌菌絲進(jìn)入及黃曲霉毒素的提??；花生粉（市售花生米自制成過(guò)細(xì)粉滅菌）。分別進(jìn)行編號(hào)：“生1”為中檔生普洱，“生2”為低檔生普洱，“熟1”為中檔熟生普洱，“熟2”為低檔熟普洱，“花1”為花生粉。

1.1.3 試劑

黃曲霉毒素ELISA試劑盒（美國(guó)Romer Labs公司）、免疫親和柱（美國(guó)Romer Labs公司）。PDA培養(yǎng)基（北京陸橋）。

標(biāo)物：黃曲霉毒素混標(biāo)（純度98%，美國(guó)O2SI公司）、黃曲霉毒素B1內(nèi)標(biāo)法標(biāo)物（純度99%，SIGMA-ALDRICH）、黃曲霉毒素B2內(nèi)標(biāo)法標(biāo)物（純度99.0%，SIGMA-ALDRICH）、黃曲霉毒素G1內(nèi)標(biāo)法標(biāo)物[純度（99±1）%，ROMER]、黃曲霉毒素G2內(nèi)標(biāo)法標(biāo)物（純度99%，SIGMA-ALDRICH）。

液相色譜法試劑：甲醇（色譜純，honeywell）、乙腈（色譜純，honeywell）。

LC-MS/MS試劑：甲醇（色譜純，honeywell），乙腈（色譜純，默克）。

1.1.4 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀Agilent 1200使用 FLD檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）、Triple Quad 3500超高液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)AB SCIEX公司）、Vector PCX柱后衍生器（美國(guó)Pickering公司）、Turbo Vap LV 50位自動(dòng)氮吹濃縮儀（瑞典Biotage公司）、RT-6000酶標(biāo)儀（德國(guó)IFP公司）、AC2-4S1生物安全柜（ESCO公司）、ML204電子分析天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司]、MJ-250-Ⅱ恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海一恒）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌液制備

將黃曲霉產(chǎn)毒菌株CICC 2219接種到PDA培養(yǎng)基斜面上，28 ℃活化培養(yǎng)5 d，轉(zhuǎn)接第二代于相同條件培養(yǎng)7 d，用接種環(huán)挑取一定量接入0.85%生理鹽水，用移液管反復(fù)吹吸混勻，以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使孢子濃度達(dá)到106CFU/mL，用于人工接種模擬黃曲霉污染。

1.2.2 茶葉樣品的模擬存放

將茶葉及花生粉分成A、B、C、D共4組，每組每份100 g。①A組模擬未接種黃曲霉室溫存放：溫度25 ℃、自然濕度。②B組模擬接種黃曲霉后室溫存放：溫度25 ℃、自然濕度，噴灑2 mL上述1.2.1中菌液。③C組模擬產(chǎn)毒條件未接種黃曲霉高溫高濕存放：樣品噴灑20 mL無(wú)菌水，溫度30 ℃、濕度85%。④D組模擬產(chǎn)毒條件接種黃曲霉后高溫高濕存放：樣品噴灑20 mL無(wú)菌水，溫度30 ℃、濕度85%，噴灑2 mL上述1.2.1中菌液。以上4組同時(shí)存放15 d、30 d、60 d，分別進(jìn)行黃曲霉毒素的檢測(cè)。

1.2.3 茶葉中霉菌的測(cè)定

按GB 4789-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》[10]。

1.2.4 高效液相色譜法（HPLC法）

（1）樣品前處理過(guò)程。稱(chēng)10 g，加入25 mL 70%的甲醇水提取，超聲30 min，取2 mL加入18 mL吐溫溶液，全部過(guò)免疫性親和柱，5 mL PBS溶液和5 mL水洗滌，2 mL甲醇洗脫，氮吹干，1 mL甲醇∶水（1∶1）復(fù)溶，壓濾上機(jī)。

（2）色譜條件。流動(dòng)相水+甲醇+乙腈=56+22+22；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量50 μL；柱溫40 ℃；激發(fā)波長(zhǎng)360 nm；發(fā)射波長(zhǎng)440 nm； FLD檢測(cè)器。

（3）柱后衍生器條件。反應(yīng)溫度90 ℃；流速0.3 mL/min；流動(dòng)相0.005%碘液。

1.2.5 超高效液相色譜質(zhì)譜法（LC-MS/MS法）

（1）樣品處理。同高效液相色譜法。

（2）色譜條件。Waters ACQUITY UPLC BEH C18液相色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），梯度洗脫。柱溫為40 ℃，流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸水，進(jìn)樣量為10.0 μL，流速為0.5 mL/min，梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 黃曲霉毒素流動(dòng)相梯度洗脫表

（3）質(zhì)譜條件。電噴霧（ESI)離子源，正離子掃描方式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），氣簾氣38 psi，溫度550 ℃，離子化電壓5 500 V，噴霧氣為55 psi，輔助加熱氣為60 psi。黃曲霉毒素AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2的MRM參數(shù)條件見(jiàn)表2。

表2 黃曲霉毒素目標(biāo)物選擇反應(yīng)檢測(cè)優(yōu)化參數(shù)表

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA法）

黃曲霉毒素參照ELISA檢測(cè)試劑盒提供的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉菌菌落特征

本次主要考慮黃曲霉的污染及茶葉本身固有霉菌（普洱茶目前研究較多的黑曲霉[11-12]）進(jìn)行計(jì)數(shù)，D組樣品在高溫高濕條件下放置7 d后，PDA培養(yǎng)基上的菌落計(jì)數(shù)和形態(tài)特征如圖1～4。

圖1 生1樣品D組培養(yǎng)7 d PDA培養(yǎng)基上菌落特征圖

圖2 生2樣品D組培養(yǎng)7 d PDA培養(yǎng)基上菌落特征圖

圖3 熟1樣品D組培養(yǎng)7 d PDA培養(yǎng)基上菌落特征圖

圖4 熟2樣品D組培養(yǎng)7 d PDA培養(yǎng)基上菌落特征圖

2.2 菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

不同實(shí)驗(yàn)組，在存放3 d、7 d、15 d、30 d取樣進(jìn)行黃曲霉和黑曲霉菌落計(jì)數(shù)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同培養(yǎng)時(shí)間黃曲霉和黑曲霉菌落計(jì)數(shù)測(cè)定結(jié)果表

2.3 樣品的霉菌生長(zhǎng)情況

A組模擬未接種黃曲霉室溫存放的產(chǎn)品，結(jié)果顯示：無(wú)論是黃曲霉還是黑曲霉，計(jì)數(shù)結(jié)果都相當(dāng)?shù)?，而且存放過(guò)程不增值。結(jié)果的差異來(lái)自于檢驗(yàn)方法本身的隨機(jī)誤差。所有樣品霉菌含量小于100 CFU/g，結(jié)果顯示正常儲(chǔ)存條件不具備霉菌增值條件，霉菌毒素也不容易生成。

B組模擬接種黃曲霉后室溫存放樣品，結(jié)果樣品前期黃曲霉呈現(xiàn)微弱生長(zhǎng)，7 d后開(kāi)始下降的趨勢(shì)。由于前期接入黃曲霉含量達(dá)到104CFU/g，黑曲霉菌落可能被黃曲霉菌落覆蓋而計(jì)數(shù)不到黑曲霉，但隨著存放時(shí)間延長(zhǎng)，黃曲霉數(shù)量的下降，黑曲霉數(shù)量逐漸被計(jì)數(shù)，30 d后兩種霉菌含量基本相當(dāng)。證明在普洱茶中容易存在黑曲霉，整個(gè)霉菌變化過(guò)程應(yīng)該是接種過(guò)程帶進(jìn)去的水分造成，短期內(nèi)造成樣品濕度增加，霉菌增殖。但由于儲(chǔ)存環(huán)境濕度較低，樣品逐漸干燥，造成后期含菌量不斷下降。結(jié)果表明正常儲(chǔ)存條件下不利于霉菌生長(zhǎng)繁殖，霉菌毒素缺乏產(chǎn)生條件。

C組模擬未接種高溫高濕存放樣品，結(jié)果顯示樣品中黑霉菌含量不斷增加，3 d后基本達(dá)到頂峰，直至15 d后基本恒定在108CFU/g。由A組可以看出，一般普洱茶含有極少量霉菌，當(dāng)存放在高溫高濕條件下時(shí)霉菌容易生長(zhǎng)繁殖，成品普洱茶保存應(yīng)當(dāng)盡量避免高溫高濕。

D組模擬接種黃曲霉后高溫高濕存放樣品，結(jié)果顯示黃曲霉在培養(yǎng)7 d前不斷增值，15 d后開(kāi)始下降。而黑曲霉則不斷增值，至15 d后相對(duì)恒定，黑曲霉含量在后期明顯占優(yōu)勢(shì)。接種的黃曲霉能在茶葉中生長(zhǎng)繁殖，初期生長(zhǎng)較快，但隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，黃曲霉在茶葉中的生長(zhǎng)明顯受到抑制，其數(shù)量逐漸下降，抑制可能來(lái)自于霉菌間的競(jìng)爭(zhēng)或茶葉溶出性物質(zhì)。結(jié)果表明在未接種黑曲霉的情況下，適合霉菌生長(zhǎng)的C、D組樣品均有黑曲霉生長(zhǎng)，黑曲霉為普洱茶發(fā)酵中的優(yōu)勢(shì)菌群。

對(duì)普洱茶和對(duì)照樣品試驗(yàn)前本底進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。ELISA法作為黃曲霉毒素的快速測(cè)定法，對(duì)黃曲霉毒素的檢測(cè)不進(jìn)行分型，采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，花生粉未檢出黃曲霉毒素，普洱茶均能夠檢出的黃曲霉毒素，采用HPLC和LC-MS/MS方法均未檢出黃曲霉毒素（低于方法檢出限）。

表4 樣品本底，未進(jìn)行培養(yǎng)前檢測(cè)結(jié)果表

普洱茶及對(duì)照樣品A、B、C、D4組樣品，對(duì)存放15 d、30 d、60 d，采用3種方法進(jìn)行黃曲霉毒素的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總?cè)绫?。

表5 四組樣品存放不同時(shí)間檢測(cè)結(jié)果表

續(xù)表5

對(duì)照組花生粉檢測(cè)結(jié)果A、C組ELISA法均未檢出黃曲霉毒素，HPLC和LC-MS/MS方法也未檢出黃曲霉毒素。B、D組3種方法均檢出黃曲霉毒素。B組可能由于花生粉本身較潮濕，室溫接種條件下黃曲霉仍然可以正常生長(zhǎng)所致。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)的花生粉，極易被黃曲霉污染產(chǎn)生黃曲霉毒素。

普洱茶樣品所有A、B、C、D4組樣品，除采用ELISA法結(jié)果均能夠檢出的黃曲霉毒素外，采用HPLC和LC-MS/MS方法均未檢出黃曲霉毒素。

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明接種產(chǎn)毒黃曲霉作對(duì)照組花生粉產(chǎn)生黃曲霉毒素，而所有接種和未接種產(chǎn)毒黃曲霉的實(shí)驗(yàn)組普洱茶雖然黃曲霉可以生長(zhǎng)，但采用先進(jìn)的方法均未檢出黃曲霉毒素。表明受黃曲霉污染的普洱茶不利于黃曲霉毒素的產(chǎn)生。而ELISA法用于茶葉中黃曲霉毒素檢測(cè)容易被基質(zhì)干擾[13]，不同時(shí)間檢測(cè)結(jié)果差異顯著，所檢測(cè)的數(shù)據(jù)不能作為判定樣品中含黃曲霉的依據(jù)。GB 5009.22-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定》已將ELISA列為篩查法，并且茶葉也不在可用于篩查范圍。從而證明ELISA不適用于茶葉中黃曲霉毒素的檢測(cè)。

目前，普洱茶黃曲霉毒素檢測(cè)的報(bào)道，ELISA法幾乎全部檢出外，其他先進(jìn)可靠的檢測(cè)方法HPLC法、LC-MS/MS法除陳建玲等[5]濕倉(cāng)普洱茶有11%檢出超過(guò)5 μg/kg外，所有報(bào)道中均未檢出黃曲霉毒素。證明正常情況下普洱茶黃曲霉毒素幾乎不產(chǎn)生，但可能由于存儲(chǔ)環(huán)境或發(fā)酵過(guò)程存在可能接觸可以產(chǎn)生黃曲霉毒素的物品從而帶進(jìn)微量的黃曲霉毒素，或者濕倉(cāng)快速發(fā)酵過(guò)程中的某些環(huán)節(jié)控制不好所致。

黑曲霉是普洱茶中的優(yōu)勢(shì)菌種[12]，黑曲霉的毒素報(bào)道近年來(lái)相繼出現(xiàn)[14-15]，也有人利用黑曲霉進(jìn)行普洱茶的發(fā)酵。雖然有毒菌種產(chǎn)毒是在特定的條件下，但應(yīng)當(dāng)在傳統(tǒng)普洱茶生產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程中對(duì)相關(guān)霉菌進(jìn)行關(guān)注和研究，以控制生產(chǎn)條件，避免有毒霉菌對(duì)普洱茶品質(zhì)的影響。隨著人們的關(guān)注和對(duì)品質(zhì)的追求，檢測(cè)手段的進(jìn)步，研究的深入，生產(chǎn)工藝的提升，銷(xiāo)售儲(chǔ)存條件的改進(jìn)，相信普洱茶的質(zhì)量能滿足消費(fèi)者安全健康及高品質(zhì)追求的需要。

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