PTEN在銀屑病和皮膚非黑色素腫瘤中的表達(dá)和意義

李婭娣，蔓小紅，尤立平，張曉艷

銀屑病是一種由多基因遺傳決定的、多環(huán)境因素刺激誘導(dǎo)的免疫異常性慢性炎癥性增生性皮膚病。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，在銀屑病皮損表皮中，磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidyl inositol 3 kinase, PI3K）的表達(dá)明顯高于正常人及銀屑病非皮損區(qū)表皮[1]，磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase, Akt）的蛋白水平及Akt的激酶活性明顯升高[2]，提示銀屑病的角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocyte，KC）可能存在著PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路異?；罨??；罨腁kt通過(guò)磷酸化其下游幾個(gè)重要的靶蛋白：促Bcl-XL/Bcl-2凋 亡 因 子（Bcl-XL/Bcl-2-associated death promoter，Bad），Caspase-9，原癌蛋白核轉(zhuǎn)錄因子 κB（NF-κB），叉頭蛋白O家族（forkhead box O subfamily，F(xiàn)oxO），哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶分子（mammalian target of rapamycin，mTOR），加速 KC增殖。PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）是PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路的負(fù)調(diào)因子，銀屑病皮損內(nèi)PI3K/Akt的異?；罨欠袷怯蒔TEN的功能或表達(dá)的下調(diào)所致？另一方面，PTEN作為僅次于p53的第二大抑癌基因，主要通過(guò)負(fù)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路的方式發(fā)揮其抑癌作用。本研究收集銀屑病、慢性濕疹、良惡性皮膚腫瘤（脂溢性角化、基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌皮損）以及正常人皮膚，采用免疫組化技術(shù)測(cè)定PTEN分布情況和蛋白水平，初步探討PTEN與銀屑病KC增殖的關(guān)系， PTEN在炎性增生性疾病與皮膚惡性腫瘤中的作用機(jī)制，以期揭示銀屑病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，為治療銀屑病提供新的思路和新的靶向。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

19例尋常性進(jìn)行期銀屑病患者來(lái)自2007—2010年中日友好醫(yī)院皮膚科門(mén)診及住院確診患者，男10例，女9例，年齡18～65歲，平均（33.83±9.48）歲，病程7 d～2年，平均4個(gè)月；19例患者銀屑病皮損面積和嚴(yán)重度評(píng)分（PASI）為2.4～26.1分，平均（8.997±5.098）分。所有入選患者均需符合以下條件：近2個(gè)月無(wú)系統(tǒng)應(yīng)用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素及維A酸類(lèi)藥物治療史，近2個(gè)月無(wú)中波紫外線（UVB）或補(bǔ)骨脂素長(zhǎng)波紫外線（PUVA）光照史，近2周無(wú)外用藥物史；無(wú)內(nèi)科疾病，血常規(guī)、尿糞常規(guī)、肝腎功能及其他生化指標(biāo)均在正常范圍。正常對(duì)照選擇與銀屑病患者性別、年齡相匹配的中日友好醫(yī)院整形外科患者正常皮瓣18例，均無(wú)免疫系統(tǒng)疾病及相關(guān)家族史。其中男9例，女9例。兩組在性別、年齡上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，遵照赫爾辛基宣言執(zhí)行，患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 試劑

PTEN (C-term) RabMAb 抗體（美國(guó)Epitomics公司）；β-肌動(dòng)蛋白抗體 NO. ab3280（美國(guó)abcam公司）；ChemMateTMDAKO EnVisionTM/HRP，Rabbit/Mouse（ENV）（美國(guó)Epitomics公司）；DAB顯色試劑盒（丹麥Dako公司）；抗體稀釋液（丹麥Dako公司）。

1.3 方法

銀屑病患者按常規(guī)皮膚手術(shù)活檢取典型皮損，對(duì)照組皮膚均來(lái)自整形外科手術(shù)切除的多余正常皮膚。置于10%的甲醛溶液，常規(guī)石蠟包埋。中日友好醫(yī)院皮膚科蘇木精-伊紅染色（HE）病理診斷慢性濕疹、脂溢性角化、基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌各20例的蠟塊，行免疫組化染色。常規(guī)石蠟切片，采用免疫組化SP法，操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，所有切片染色均在同一質(zhì)控條件下進(jìn)行。陽(yáng)性對(duì)照為扁桃體組織，PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

1.4 圖像處理

免疫組化切片采用日本NIKON公司的ECLIPSE 80i專(zhuān)業(yè)圖像采集與分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。在相同條件下對(duì)同一批染色切片進(jìn)行觀察、圖像采集，通過(guò)NIS-Elements3.0軟件對(duì)所采集的圖像中陽(yáng)性部位（細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)）進(jìn)行光密度（A）值的測(cè)定，每張皮膚組織切片在200倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取表皮部位各3處，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)的平均A值，進(jìn)行定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用SPSS17.0軟件做統(tǒng)計(jì)分析比較，所得數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05確定為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

PTEN染色陽(yáng)性信號(hào)為棕色顆粒。PTEN定位于正常皮膚、銀屑病皮損、慢性濕疹、脂溢性角化癥、皮膚基底細(xì)胞癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞核及胞質(zhì)內(nèi)。正常對(duì)照者表皮各層細(xì)胞核和胞質(zhì)均見(jiàn)濃密的深棕色顆粒（圖1）；銀屑病皮損表皮內(nèi)可見(jiàn)稀疏淡染的棕色顆粒（圖2）；慢性濕疹表皮內(nèi)各層細(xì)胞核和胞質(zhì)內(nèi)均見(jiàn)濃密的深棕色顆粒（圖3）；脂溢性角化癥表皮內(nèi)各層細(xì)胞核和胞質(zhì)內(nèi)均見(jiàn)濃密的深棕色顆粒（圖4）；皮膚基底細(xì)胞癌表皮內(nèi)各層細(xì)胞及真皮內(nèi)腫瘤細(xì)胞團(tuán)塊胞核和胞質(zhì)內(nèi)均見(jiàn)濃密的深棕色顆粒（圖5）；皮膚鱗狀細(xì)胞癌表皮內(nèi)各層細(xì)胞及真皮內(nèi)腫瘤細(xì)胞團(tuán)塊胞核和胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)稀疏淡染的棕色顆粒，個(gè)別細(xì)胞甚至無(wú)染色（圖6）。

分別測(cè)定各個(gè)疾病組PTEN表達(dá)的平均A值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損、皮膚鱗狀細(xì)胞癌PTEN著色的A值分別為0.078±0.052、0.036±0.132，平均A值均低于正常皮膚（0.659±0.120），三者之間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中皮膚鱗狀細(xì)胞癌平均A值比銀屑病皮損低。慢性濕疹、脂溢性角化和皮膚基底細(xì)胞癌中PTEN著色的A值分別為0.711±0.162、0.694±0.055、0.704±0.165，高于正常皮膚，四者之間差異相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

PTEN蛋白是人類(lèi)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)兼具脂質(zhì)和蛋白質(zhì)磷酸酶雙重活性的新型抑癌基因。PTEN定位于染色體10q23，在腫瘤生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖分化和代謝、血管增生、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、核糖體生物合成、mRNA翻譯等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[3]。PTEN通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞無(wú)休止增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑癌作用，在肺部、結(jié)腸、前列腺、乳腺、子宮內(nèi)膜及腦部等眾多腫瘤性疾病中PTEN可發(fā)生突變、缺失和表達(dá)下降[4]。然而，PTEN在銀屑病皮損中的表達(dá)和功能研究，與皮膚良、惡性腫瘤之間的關(guān)系報(bào)道甚少。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)免疫組化染色結(jié)果采用量化分析，較以往染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比方法更為精確。同一批次染色組織切片，相同曝光情況下采集200倍圖像，利用專(zhuān)業(yè)圖像分析系統(tǒng)對(duì)同一切片多部位進(jìn)行光密度測(cè)定，取其平均值作為每個(gè)切片的A值，再用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行比較分析。較之以前以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占比結(jié)果來(lái)比較免疫組化染色強(qiáng)弱更加精確和可重復(fù)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可信。

圖1 正常對(duì)照表皮PTEN免疫組化組織病理（SP法×200）

圖2 銀屑病表皮PTEN免疫組化組織病理（SP法×200）

圖3 慢性濕疹表皮PTEN免疫組化組織病理（SP法×200）

圖5 基底細(xì)胞癌PTEN免疫組化組織病理（SP法×200）

圖4 脂溢性角化表皮PTEN免疫組化組織病理（SP法×200）

圖6 皮膚鱗狀細(xì)胞癌PTEN免疫組化組織病理（SP法×200）

筆者前期研究提示，銀屑病皮損中PI3K/Akt通道調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的關(guān)鍵性分子PI3K亞單位P110（PI3K-P110）特異性高表達(dá)[1]，磷酸化Akt的蛋白水平與Akt的激酶活性明顯升高[2]，推測(cè)銀屑病皮損中可能存在PI3K/Akt通路異?；罨TEN在銀屑病皮損中低表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路的上游PTEN表達(dá)低下，使本來(lái)PTEN致PIP3去磷酸化成為PIP2，逆轉(zhuǎn)P13K的作用降低，繼而Akt活性增強(qiáng)，引發(fā)PI3K/Akt通路過(guò)度活化。下游一系列靶蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)：FOXO3失活，進(jìn)而下調(diào)p27kip1和p130Rb2，上調(diào)cyclin D1表達(dá)[5]，使細(xì)胞周期加速，促進(jìn)細(xì)胞增殖。mTOR磷酸化水平升高，實(shí)驗(yàn)證明銀屑病皮損內(nèi)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路活化使角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖[6]。PTEN還可激活受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases，RTK），介導(dǎo)有絲分裂原蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期。在銀屑病中，PTEN缺乏致MAPK信號(hào)通路過(guò)度活化，引發(fā)細(xì)胞過(guò)度增殖和對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑的敏感性下降[7]。

在良性炎癥性表皮增殖性疾病如慢性濕疹和脂溢性角化癥中，PTEN正常表達(dá)甚至略多于正常皮膚表達(dá)，提示這兩種疾病表皮增殖機(jī)制與PTEN無(wú)關(guān)。已證實(shí)脂溢性角化癥中PIK3CA，AKT1存在善意突變，無(wú)PTEN突變，發(fā)病與PI3K/PTEN/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路無(wú)關(guān)[8]。低度惡性增殖性皮膚病變基底細(xì)胞癌中PTEN正常表達(dá)，說(shuō)明與PTEN在眾多人類(lèi)腫瘤中缺失或突變導(dǎo)致其喪失抑癌作用不同。從蛋白水平看，PTEN似乎沒(méi)有在皮膚基底細(xì)胞癌細(xì)胞增殖發(fā)展中起作用。研究發(fā)現(xiàn)皮膚基底細(xì)胞癌的分子發(fā)生機(jī)制是Hedgehog (Hh)傳導(dǎo)通路異常活化[9]。然而，PI3K/Akt可與Hh通路一起協(xié)同作用致腫瘤生長(zhǎng)發(fā)育[10]。因此，研究PTEN在皮膚基底細(xì)胞癌中的功能機(jī)制將對(duì)皮膚基底細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展具有重要意義。本研究測(cè)定顯示，皮膚鱗狀細(xì)胞癌PTEN低表達(dá)，與既往研究結(jié)果一致。人和小鼠的眾多實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)PTEN在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮重要的抑癌作用。體外人KC、體內(nèi)皮膚腫瘤化學(xué)模型表明Cowden's患者皮膚鱗狀細(xì)胞癌皮損內(nèi)PTEN功能降低。小鼠敲除PTEN將會(huì)導(dǎo)致皮膚鱗狀細(xì)胞癌[11]。Li等[12]研究顯示，皮膚鱗狀細(xì)胞癌中PI3K/PTEN/Akt通路活化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲，抑制細(xì)胞凋亡。

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果示PTEN在銀屑病和皮膚鱗狀細(xì)胞癌皮損中均低表達(dá)，與多數(shù)腫瘤細(xì)胞中PTEN缺失有相似變化。但銀屑病并不能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生概率增加，或并不伴隨腫瘤發(fā)生和發(fā)展?？赡艿脑蛞环矫婺[瘤發(fā)生是一個(gè)多重因素參與網(wǎng)絡(luò)化的復(fù)雜的調(diào)控的過(guò)程，單一因素PTEN缺失不能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[13]；另一方面也許銀屑病中PTEN下調(diào)表達(dá)的數(shù)量不夠低，不足以引起腫瘤發(fā)生。Yoshimoto等[14]證實(shí)PTEN蛋白表達(dá)水平的高低與腫瘤患者的病理分級(jí)及預(yù)后有關(guān)?；颊邜盒远仍礁撸A(yù)后越差、PTEN蛋白水平越低。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示PTEN在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)更低于銀屑病皮損中的表達(dá)量，推斷PTEN在組織中含量低到一定量時(shí)才會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，PTEN可能在銀屑病KC增殖方面發(fā)揮關(guān)鍵的作用。PTEN在銀屑病中低表達(dá)，負(fù)調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路的作用減弱致PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路異?；罨?，通過(guò)下游多個(gè)靶分子作用縮短細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)，使銀屑病不斷發(fā)生發(fā)展。但需要更進(jìn)一步的研究，如體外PTEN活性研究、PTEN基因轉(zhuǎn)染、PTEN敲除動(dòng)物模型等來(lái)揭示PTEN在銀屑病KC過(guò)度增殖和異常凋亡中的確切功能，和其在皮膚腫瘤間的關(guān)系，對(duì)了解銀屑病病因及尋找治療藥物有很大的幫助。

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