響應(yīng)面法優(yōu)化馬鈴薯莖段高效再生體系

江林娟，鄒 雪，黃雪麗，倪 蘇，李立芹，楊世民，2，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，四川 成都 611130)

響應(yīng)面法優(yōu)化馬鈴薯莖段高效再生體系

江林娟1，鄒 雪1，黃雪麗1，倪 蘇1，李立芹1，楊世民1，2，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，四川 成都 611130)

摘 要：為了探討馬鈴薯莖段愈傷組織高效再生的最佳激素濃度配比，建立馬鈴薯組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)新體系，以馬鈴薯品種川芋10號(hào)莖段為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織為材料，通過采用響應(yīng)面方法(RSM)中的Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，研究TDZ、2，4-D、GA3濃度對(duì)馬鈴薯莖段愈傷組織芽分化的影響，優(yōu)化馬鈴薯愈傷組織芽分化的最佳激素配比。結(jié)果表明，從響應(yīng)面法優(yōu)化所得模型可知，培養(yǎng)基中的激素濃度變化對(duì)馬鈴薯愈傷組織出芽敏感性TDZ>GA3>2，4-D；所得模型的決定系數(shù)R2為0.9921，確定了川芋10號(hào)莖段愈傷組織芽分化最佳培養(yǎng)基為MS+2.02mg·L-1TDZ+0.08mg·L-12，4-D+2.25mg·L-1GA3，在此條件下，實(shí)際測(cè)得的平均出芽率與預(yù)測(cè)值基本一致，證實(shí)了該模型的有效性。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；愈傷組織；響應(yīng)面法；培養(yǎng)基

馬鈴薯(SolariumtuberosumL.)是世界四大糧食作物之一，屬糧菜兼用型作物，也是植物組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)的模式作物。目前，馬鈴薯愈傷組織再生體系的研究較多，普遍采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)不同激素配比歸納出最優(yōu)組合[1-2]，但無(wú)法確定整個(gè)區(qū)域上因素的最優(yōu)條件與響應(yīng)值。響應(yīng)面法在試驗(yàn)條件優(yōu)化過程中可以連續(xù)地對(duì)試驗(yàn)因素的各個(gè)水平進(jìn)行分析，克服了正交試驗(yàn)只能對(duì)一個(gè)個(gè)孤立的試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析和不能給出直觀圖形的缺陷[3]。筆者采用響應(yīng)面法優(yōu)化馬鈴薯莖段愈傷組織再生體系，為提高馬鈴薯愈傷組織再生效率，縮短培養(yǎng)時(shí)間，尋找更優(yōu)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。

響應(yīng)面分析法(response surface methodology，RSM)是近幾年來(lái)國(guó)外工作者常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化法，使用方便，優(yōu)選條件預(yù)測(cè)性好[4-5]，已在植物愈傷組織研究中廣泛應(yīng)用。Abbasi等[6]通過運(yùn)用響應(yīng)面法獲得誘導(dǎo)和分化大豆愈傷組織的最佳培養(yǎng)基激素配比。Bagherieh等[7]運(yùn)用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)研究滇紫草愈傷組織繼代培養(yǎng)基體系。川芋10號(hào)具有單株產(chǎn)量高，生育期短，植株健壯，不易倒伏，鮮薯品質(zhì)優(yōu)，塊莖休眠期較長(zhǎng)，較耐貯，淀粉含量高等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。本研究應(yīng)用響應(yīng)面法中的Box-Behnken設(shè)計(jì)方法對(duì)影響川芋10號(hào)馬鈴薯愈傷組織芽分化的激素配比的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立川芋10號(hào)馬鈴薯組織培養(yǎng)的技術(shù)體系，以期為其他植物再生體系的構(gòu)建提供一定借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試苗

馬鈴薯品種川芋10號(hào)脫毒試管苗，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院馬鈴薯研究開發(fā)中心提供。

1.1.2 試劑

所用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(plant growth regulator，PGR)包括：6-芐氨基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)、噻苯隆(thidiazuron，TDZ)、赤霉素(gibberellin acid A3，GA3)等購(gòu)自Sigma公司，萘乙酸(1-naphthaleneacetic acid，NAA)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D)和MS培養(yǎng)基(含3%蔗糖，0.6%瓊脂)，各成分均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

以MS為基本培養(yǎng)基(pH5.8)，培養(yǎng)溫度為(22±2)℃，光照條件為日光燈光強(qiáng)1500～2000μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間14h·d-1，黑暗10h·d-1。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

挑選生長(zhǎng)健壯，長(zhǎng)勢(shì)相當(dāng)?shù)?0d左右脫毒馬鈴薯品種試管苗，取不帶側(cè)芽的莖段0.5cm左右，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+1.5mg·L-16-BA+0.4mg·L-1NAA+0.2mg·L-12，4-D，以平鋪方式培養(yǎng)，每瓶接種10個(gè)莖段，接種150瓶，暗培養(yǎng)7d后見光培養(yǎng)。莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)3、7、14d觀察記錄愈傷組織生長(zhǎng)情況。根據(jù)愈傷組織形成情況，分別于7、14d考察愈傷組織數(shù)量、長(zhǎng)勢(shì)、顏色與狀態(tài)，并統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率、愈傷組織鮮質(zhì)量增長(zhǎng)率。

1.2.3 不同激素配比對(duì)愈傷組織芽分化的影響

采用響應(yīng)面方法中的Box-Behnken設(shè)計(jì)，對(duì)影響馬鈴薯莖段愈傷組織再生體系的關(guān)鍵因素進(jìn)行研究和探索，以獲得芽分化最佳的條件參數(shù)?；谇捌趩我蛩仡A(yù)試驗(yàn)，得知影響馬鈴薯莖段愈傷組織芽分化率的激素有TDZ、2，4-D、GA3。本研究采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)，以TDZ、2，4-D、GA3的3種激素的濃度為3個(gè)因素，以愈傷組織出芽率為響應(yīng)值(表1)，根據(jù)中心組合(Box-Behnken)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，確定愈傷組織分化培養(yǎng)中激素組合的最佳配比。挑選生長(zhǎng)旺盛、結(jié)構(gòu)疏松的新鮮愈傷組織轉(zhuǎn)移到不同激素配比的分化培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種8瓶，每瓶8個(gè)外植體，見光培養(yǎng)。分化培養(yǎng)30d后觀察記錄愈傷組織生長(zhǎng)情況，以芽長(zhǎng)度大于0.5cm的愈傷組織數(shù)量來(lái)統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)基愈傷組織出芽率，討論這3種激素不同濃度組合對(duì)愈傷組織分化的影響。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素與水平

1.2.4 最佳激素的配比及驗(yàn)證

為進(jìn)一步確定最佳的激素濃度，在模型濃度范圍內(nèi)選擇出發(fā)點(diǎn)，按照模型使用快速上升法優(yōu)化，可得愈傷組織芽分化的最佳激素配比。用模型的最佳激素配比培養(yǎng)愈傷組織，來(lái)驗(yàn)證該模型的有效性。分化培養(yǎng)20d愈傷組織于OLYMPUS SZX7體視顯微鏡(目鏡10倍，物鏡5.6倍)下觀察，OLYMPUS DP26成像系統(tǒng)拍照，ACDSee 3.1軟件獲取圖片。

1.2.5 再生植株的生根培養(yǎng)

待愈傷組織上的不定芽長(zhǎng)到1～2cm時(shí)，將其剪下，置于MS培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)，14d后觀察植株生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)狀況

試驗(yàn)結(jié)果顯示，接種莖段2～3d后，莖段兩端切口處便明顯膨大，可見到有淡黃色愈傷組織出現(xiàn)，其后愈傷組織沿維管束向莖段中間生長(zhǎng)，7d左右的愈傷組織即可長(zhǎng)滿莖段表面，誘導(dǎo)率高達(dá)90.55%；14d左右的愈傷組織從外觀上出現(xiàn)了較大的變化，顏色由淡黃色變成黃綠色，且生長(zhǎng)旺盛，愈傷組織增重率高達(dá)500.56%(圖1)。

2.2 響應(yīng)面法分析不同激素濃度配比對(duì)愈傷組織分化的影響

2.2.1 不同激素濃度配比對(duì)愈傷組織分化的影響結(jié)果及方差分析

利用響應(yīng)面法對(duì)影響馬鈴薯愈傷組織芽分化率的主要激素參數(shù)條件進(jìn)行優(yōu)化，采用Design-Expert.V8.0.6.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與回歸分析，結(jié)果見表2、表3。從方差分析結(jié)果可以看出，TDZ對(duì)出芽率的影響最為顯著，其次是GA3，而2，4-D影響較小。

2.2.2 模型擬合與優(yōu)化

圖1 莖段愈傷組織Fig.1 Stem callus tissues

表2Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Table2Box-Behnken design and results

No.X1X2X330 d出芽率/%30 d Shootregeneration ratio/%20 d愈傷組織20 d callus30 d叢生芽30 d cluster buds莖Stem葉Leaf100087.01綠色疏松Green and loose粗壯Strong肥厚Thick211073.99綠色致密 Green and compact細(xì)弱Thin細(xì)長(zhǎng)Narrow30-1-191.21綠色疏松Green and loose粗壯Strong微卷曲Micro curly4-1-1055.16黃綠色較致密Yellow-green and fairly compact粗壯Strong肥厚Thick5-10-151.98白綠色相間致密White with green and compact粗壯Strong肥厚Thick601179.93淡綠色致密Light-green and compact細(xì)弱Thin細(xì)長(zhǎng)Narrow700083.03黃綠色疏松Yellow-green and loose粗壯Strong微卷曲Micro curly81-1081.06綠色較疏松Green fairly and loose細(xì)弱Thin細(xì)長(zhǎng)Narrow900084.95綠色較疏松Green fairly and loose細(xì)弱Thin細(xì)長(zhǎng)Narrow1000083.13綠色較疏松Green fairly and loose細(xì)弱Thin細(xì)長(zhǎng)Narrow110-1177.94黃綠色疏松Yellow-green and loose細(xì)弱Thin細(xì)長(zhǎng)Narrow1210-188.16綠色疏松Green and loose粗壯Strong微卷曲Micro curly1300084.97綠色疏松Green and loose細(xì)弱Thin細(xì)長(zhǎng)Narrow1410167.99淡綠色致密Light green and compact細(xì)弱Thin細(xì)長(zhǎng)Narrow15-11056.15白綠色相間致密White with green and compact粗壯Strong肥厚Thick16-10164.92淡綠色致密Light-green and compact細(xì)弱Thin細(xì)長(zhǎng)Narrow1701-179.90淡綠色致密Light-green and compact粗壯Strong微卷曲Micro curly

表3回歸模型各項(xiàng)的方差分析

Table3Variance analysis of regression equation

方差來(lái)源Variance source平方和Sum of squares自由度Degree of freedom均差Mean squareF值F valueP顯著性Significance模型Model2398.479266.5097.98<0.0001**X1-TDZ860.921860.92316.53<0.0001**X2-2,4-D29.64129.6410.900.0131*X3-GA352.38152.3819.260.0032*X1 X216.24116.245.970.0445*X1 X3274.071274.07100.77<0.0001**X2 X344.22144.2216.260.0050*X211078.6011078.60396.57<0.0001**X2217.23117.236.330.0400**X230.5210.520.190.6761殘差Residual19.0472.72失擬項(xiàng)Lack of fit8.3532.781.040.4652誤差Pure error10.6942.67總和Cor total2417.5116

*和**分別表示顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)水平。

* and **represented significance at the level of 0.05 and 0.01，respectively.

圖2 測(cè)量與預(yù)測(cè)的出芽率之間的線性相關(guān)圖Fig.2 Linear correlation plot between shoot regeneration ratio of measured value vs.predicted value

2.2.3 響應(yīng)面和等高線

為了分析TDZ、2，4-D、GA3對(duì)馬鈴薯莖段愈傷組織再生出芽效率的影響，根據(jù)回歸方程做出各因素對(duì)Y的響應(yīng)面和等高線，考察擬合響應(yīng)曲面的形狀(圖4)。從響應(yīng)面的坡度變化及等高線的形狀可分析各因素的交互作用：若等高線的形狀為橢圓形表示因素間交互作用顯著，圓形則表示因素間交互作用可忽略不計(jì)[10]，同時(shí)響應(yīng)面坡度相對(duì)平緩表示響應(yīng)值不敏感；反之，則敏感。

圖3 TDZ、2，4-D、GA3三者與愈傷組織出芽率的攝動(dòng)關(guān)系圖Fig.3 Perturbation of TDZ(X1),2，4-D(X2) and GA3(X3) on callus shoot regeneration ratio

由圖4可以看出，TDZ和2，4-D，TDZ和GA3的交互作用顯著，2，4-D和GA3交互作用較小。因此，TDZ在培養(yǎng)基中的濃度變化對(duì)馬鈴薯愈傷組織出芽很敏感，而2，4-D、GA3相對(duì)不敏感，其敏感性TDZ>GA3>2，4-D。

2.2.4 最佳激素濃度配比及驗(yàn)證

在MS+2.02mg·L-1TDZ+0.08mg·L-12，4-D+2.25mg·L-1GA3最佳激素配比下，馬鈴薯莖段愈傷組織的理論出芽率為91.52%。在此激素條件下，實(shí)際測(cè)得的平均出芽率為91.50%，與預(yù)測(cè)值基本一致，證實(shí)了該模型的有效性。分化培養(yǎng)14d左右，其中一些愈傷組織表面出現(xiàn)瘤狀顆粒，結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地緊密，20d在OLYMPUS SZX7體視顯微鏡下觀察，可以看到愈傷組織瘤狀突起處有胚芽形成，30d肉眼可觀察到明顯的叢生芽，40d芽越來(lái)越多，60d叢生芽生長(zhǎng)旺盛。

圖4 愈傷組織出芽率隨TDZ(A)、2，4-D(B)和GA3(C)變化的響應(yīng)面圖及對(duì)應(yīng)的等高線圖Fig.4 Response surface and contour map for effects of TDZ(A),2，4-D(B) and GA3(C) on callus shoot regeneration ratio

接于MS上的芽，14d再生植株生長(zhǎng)良好，根系粗壯(圖5)。

圖5 叢生芽誘導(dǎo)(A-F)與再生植株的生根培養(yǎng)(G-I)Fig.5 Multiple-shoot inducement(A-F) and regeneration rooting culture plants(G-I)

3 討論

響應(yīng)面分析法是一種試驗(yàn)次數(shù)少、周期短、回歸方程精度高，能研究幾種因素間交互作用的回歸分析方法[11]。相對(duì)于傳統(tǒng)的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法，響應(yīng)面分析法求得的各參數(shù)組合更加精確，可以大大降低生產(chǎn)實(shí)踐過程中造成的原料浪費(fèi)。愈傷組織分化培養(yǎng)的效果，需要綜合考慮多方面因素，諸如生長(zhǎng)情況，是否出現(xiàn)退化、變色、硬化、出芽等問題。由于在進(jìn)行響應(yīng)面法設(shè)計(jì)時(shí)，需要以定量值作為衡量指標(biāo)，定性指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)不好確定，因此，以出芽長(zhǎng)度>0.5cm的愈傷組織數(shù)統(tǒng)計(jì)出芽率，作為響應(yīng)值。

從響應(yīng)面和等高線可以看出，不同濃度TDZ、2，4-D、GA3對(duì)愈傷組織出芽率的影響不同，敏感性TDZ>GA3>2，4-D。研究不同濃度的激素組合對(duì)愈傷組織叢生芽誘導(dǎo)率的影響，以往在馬鈴薯組織培養(yǎng)中的芽誘導(dǎo)主要應(yīng)用的細(xì)胞分裂素是6-BA[1]、玉米素(trans-zeatin)[12]、激動(dòng)素(kinetin，KT)[2]。在蔥[13]、土黨參[14]等植物愈傷組織再生體系中運(yùn)用TDZ效果顯著，因此本實(shí)驗(yàn)中引用了TDZ代替6-BA。TDZ是一類人工合成的苯基脲衍生物，具有強(qiáng)烈的細(xì)胞活性，其活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過玉米素、6-BA、激動(dòng)素KT和異戊烯腺嘌呤(Zip)，能誘導(dǎo)外植體從愈傷組織形成到體細(xì)胞胚胎發(fā)生的一系列過程，具有生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素雙重作用的特殊功能[15-16]。Elaleem等[17]研究馬鈴薯愈傷芽分化時(shí)認(rèn)為MS+5.00mg·L-1TDZ出芽率高達(dá)81%。而本研究結(jié)果表明，使用較高濃度的TDZ對(duì)叢生芽誘導(dǎo)時(shí)間、叢生芽誘導(dǎo)率、出芽數(shù)均有較為顯著的作用，而當(dāng)TDZ濃度超過2.02mg·L-1后，隨著TDZ使用濃度的增加，愈傷組織的叢生芽誘導(dǎo)率及出芽數(shù)降低。這表明對(duì)TDZ形成具再生能力的致密型愈傷組織影響最大，當(dāng)超過一定濃度后，TDZ的添加量與指標(biāo)體系之間存在負(fù)相關(guān)性。可能由于馬鈴薯品種的基因型不同，其內(nèi)源激素有差異，導(dǎo)致本研究中的TDZ最佳濃度有別于前人的研究結(jié)果。

GA3能刺激細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)，對(duì)芽的分化有明顯促進(jìn)作用[18]。研究結(jié)果表明，GA3在馬鈴薯莖段愈傷不定芽分化中均具有一定的影響，這與Ghosh等[19]在馬鈴薯葉片愈傷不定芽分化中的研究結(jié)果一致。Kumlay等[20]研究認(rèn)為，低濃度的GA3有利于馬鈴薯愈傷組織芽分化。在本研究中GA3濃度較高，但當(dāng)濃度大于5mg·L-1時(shí)，會(huì)導(dǎo)致芽莖桿細(xì)，移植的苗不健壯，且不容易成活。2，4-D是誘導(dǎo)馬鈴薯愈傷組織的關(guān)鍵激素之一，在一定濃度范圍內(nèi)，濃度的增加對(duì)誘導(dǎo)大部分植物的胚性愈傷具有良好效果[21]，但過高或過低的2，4-D濃度均不利于胚性愈傷組織的形成和分化[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，2，4-D對(duì)芽的分化有抑制作用，且愈傷組織出芽率隨著2，4-D濃度的增加而逐漸降低。濃度過高會(huì)產(chǎn)生白色愈傷組織，質(zhì)地緊致且芽分化困難，這與大多數(shù)人研究認(rèn)為高濃度2，4-D能誘導(dǎo)生長(zhǎng)勢(shì)旺盛的愈傷組織，但不定芽的分化率相對(duì)較低的結(jié)果相似。

馬鈴薯愈傷組織表面形狀與顏色、質(zhì)地疏松與否，與其形態(tài)器官的再生能力有明顯關(guān)系。本研究表明，只有顏色呈綠色或黃綠色、表面凹凸明顯、結(jié)構(gòu)疏松的馬鈴薯莖段愈傷組織，才具有較強(qiáng)形態(tài)器官的再分化能力與較強(qiáng)的植株再生能力。TDZ對(duì)馬鈴薯愈傷組織芽分化起著關(guān)鍵作用，與Dokhaniyeh等[23]研究結(jié)果相一致。本實(shí)驗(yàn)中馬鈴薯莖段愈傷組織脫分化后形成的愈傷組織在相對(duì)低濃度的2，4-D(0.08mg·L-1)與相對(duì)高濃度的TDZ(2.02mg·L-1)及GA3(2.25mg·L-1)作用下，再分化芽能力最強(qiáng)，平均出芽率與模型預(yù)測(cè)值基本一致。表明在生長(zhǎng)素的添加量適宜的前提下，適當(dāng)提高細(xì)胞分裂素和赤霉素的添加量有利于組培苗形態(tài)器官的再分化。后期實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究響應(yīng)法運(yùn)用應(yīng)綜合考慮衡量愈傷組織生長(zhǎng)好壞的其他指標(biāo)。

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Optimizationofefficientregenerationsysteminstemofpotatousingresponsesurfacemethodology

JIANG Linjuan1，ZOU Xue1，HUANG Xueli1，NI Su1，LI Liqin1，YANG Shimin1，2，*

(1.CollegeofAgronomy，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China;2.NationalDemonstrationCenterforExperimentalCropScienceEducation,SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

Abstract:To establish the optimal hormone concentrations of culture medium for efficient regeneration of potato stem callus tissue，as well as build a new system for tissue culture and rapid propagation technology，stem of Chuanyu No.10 was employed as explants to induce callus tissue，and the Box-Behnken design method of response surface methodology(RSM) was used to research the effect of TDZ，2，4-D and GA3on the differentiation of potato callus.Meanwhile，the hormone concentrations were optimized.The results showed that the sensitivity of the hormone concentrations in culture medium to potato callus budding from the response surface method optimization model is TDZ>GA3>2，4-D.The determination conefficientR2of the model was 0.992 1，the optimal medium for adventitious bud differentiation from stem callus of Chuanyu No.10 was MS+2.02mg·L-1TDZ+0.08mg·L-12，4-D+2.25mg·L-1GA3.In this condition，the budding rate was actual measured,which was consistent with the predicted values.That confirmed the validity of the model.

Key words:potato;callus;response surface method;medium

中圖分類號(hào)：S532

A

文章編號(hào)：1004-1524(2018)06-0918-08

收稿日期：2017-09-04

基金項(xiàng)目：四川省科技創(chuàng)新苗子工程(2015120)；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃子課題(2016YFD0300908-03)

作者簡(jiǎn)介：江林娟(1985—)，女，浙江嘉善人，碩士研究生，主要從事植物組織培養(yǎng)及遺傳育種研究。E-mail:juan498@163.com

，楊世民，E-mail:yangshimin1@163.com

10.3969/j.issn.1004-1524.2018.06.05

(責(zé)任編輯張 韻)