長根菇菌種鑒定及生長條件優(yōu)化

張磊　徐麗麗　何翠萍　郭立忠

摘 要：為解決長根菇菌株命名混亂問題以及初步篩選最佳生長條件，該研究以6株長根菇菌株為試驗(yàn)材料，利用拮抗試驗(yàn)和分子鑒定技術(shù)，探究參試菌株的親緣關(guān)系；用單因素變量試驗(yàn)探究在不同碳、氮源，pH條件下菌株最佳生長條件。結(jié)果顯示，參試長根菇菌株總體親緣關(guān)系較近，其中編號OuA與OuC親緣關(guān)系更近，OuD與OuE親緣關(guān)系更近，OuA，OuC與OuB和OuD，OuE與OuF親緣關(guān)系和其他菌株相比，親緣關(guān)系較近，OuC與OuD親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，OuC與OuF親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，OuD與OuF親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)；最佳碳源是麥芽糖，最佳氮源是牛肉膏，不能利用尿素作為氮源，最適生長pH為7。該研究可以長根菇規(guī)范化命名提供科學(xué)依據(jù)，為長根菇商品化，規(guī)?；a(chǎn)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：長根菇；拮抗反應(yīng)；分子鑒定；碳、氮源；生長條件

中圖分類號 S646 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號 1007-7731（2018）05-0014-07

Identification of Oudemansiella radicata and its Growth Conditions Optimization

Zhang Lei1，2 et al.

（1Shandong Province Key Laboratory of Agricultural Applied Mycology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；2Shanghai Sun Avenue Biotechnology Co.，Ltd，Shanghai 201418，China）

Abstract：In order to solve the naming chaos problem of Oudemansiella radicata and to obtain the optimum conditions for the initial screening，the genetic relationship of the tested strains was studied by antagonistic test andmolecular identification technique. Six isolates of Oudemansiella radicata were used as the experimental materials. The optimum growth conditions were studied under different carbon，nitrogen and pH conditons. The results showed that all test strains had close relationships：OuA，OuC，OuE had closer relationships than others，OuA，OuC，OuB，OuD，OuE，OuF had closer genetic relationship with OuF，OuC was closely related to OuF，OuF and OuE had relatively distant with each other. Maltose was the best carbon source. Beef extract was the best nitrogen source and urea cannot be used by the strains. The optimum growth pH was 7. The results provided a scientific basis for the standardization name and commercialization of Oudemansiella radicata，and a theoretical basis for large scale production.

Key words：Oudemansiella radicata；Antagonism；Molecular identification；Carbon；Nitrogen source；Growth conditions

長根菇Oudemanciella radicata（Relhan：Fr）sing[1]學(xué)名為長根小奧德蘑[2]，屬擔(dān)子菌亞門、傘菌綱、傘菌目、膨瑚菌科、小奧德蘑屬[3]，為珍稀野生食藥用真菌，其在國際上享有“食用菌皇后”的美譽(yù)[4]。長根菇在中國、日本等都有生產(chǎn)[5]。在中國，它主要分布于福建、廣西、江蘇、河北等地，是一種土生型木腐真菌。其營養(yǎng)成分包含蛋白質(zhì)，氨基酸[6]，脂肪，碳水化合物，維生素，微量元素等，肉嫩味鮮[7]，營養(yǎng)價(jià)值高，深受消費(fèi)者喜愛，人們經(jīng)常食用，可增強(qiáng)人體免疫力，降低高血壓，長根菇中含有多種對人體有益的成分，如長根菇多糖、長根菇素等，其中多糖成分對治療腫瘤有顯著作用，長根菇素（小奧德蘑酮Oudenone）對血壓有降低作用[8-9]。目前，在市場上，供銷售的長根菇量較少，長根菇人工栽培困難、產(chǎn)量較低。在目前，國內(nèi)外對長根菇的研究主要集中在菌絲培養(yǎng)[10-13]、培養(yǎng)特性、馴化栽培、深層發(fā)酵[14-16]等方面，但對長根菇菌絲體的親緣關(guān)系分析的報(bào)道比較少見。為此，本試驗(yàn)以6個(gè)長根菇菌株為基礎(chǔ)，通過相關(guān)試驗(yàn)，比較它們的菌株拮抗反應(yīng)；菌絲生長速度和生長勢等指標(biāo)，以期規(guī)范長根菇的命名，為新品種選育和長根菇商品化，規(guī)?；a(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 供試菌株如表1所示。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基 試劑和培養(yǎng)基如表2所示。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 主要參試儀器如表3所示。

1.1.4 試驗(yàn)器皿 500mL錐形瓶，250mL錐形瓶，1000mL量筒，500mL量筒，90cm平板，試管，接種針，打孔器。

1.2 菌株鑒定

1.2.1 長根菇分子鑒定 （1）菌株DNA的提?。涸敿?xì)方法見E.Z.N.A.TM Fungal DNAmini Kit柱式試劑盒說明書。（2）樣品rDNA ITS區(qū)的PCR擴(kuò)增：采用由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成真菌核糖體基因間隔區(qū)通用引物ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′）和ITS4（5′TC CTCCGCTTATTGATATGC3′）進(jìn)行擴(kuò)增。構(gòu)建PCR擴(kuò)增體系如表4。

按表4構(gòu)建擴(kuò)增體系后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。PCR擴(kuò)增完成后，產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓為100V，產(chǎn)物和Marker上樣量均為5μL，電泳結(jié)果進(jìn)行成像分析。

（3）ITS擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測定：將1.2.1的（2）中得到的樣品ITS擴(kuò)增產(chǎn)物直接送至有關(guān)公司測序，測序引物為PCR引物。（4）ITS擴(kuò)增產(chǎn)物序列對比及分析：將測序得到的序列，通過Blast比對，并用MEGA7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用NJ法（鄰近遺傳距離法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，制作方法參考文獻(xiàn)[17]。

1.2.2 配置PDA培養(yǎng)基 準(zhǔn)確稱取新鮮洗凈并去皮的馬鈴薯，切成1cm3大小，以20%添加量放入蒸餾水中，煮沸30min，用8層紗布過濾，取汁液；稱取并添加2%葡萄糖和2%瓊脂至汁液中，待瓊脂完全熔化后，加入葡萄糖混勻，定容至并分裝入500mL的錐形瓶中，裝瓶量為250mL。標(biāo)記并封口，115℃濕熱滅菌20min，備用。

1.2.3 菌株活化 在滅好菌的超凈工作臺(tái)中，用1.2.2中滅好菌的培養(yǎng)基，倒平板，采用無菌操作接種技術(shù)接種于培養(yǎng)皿正中間，標(biāo)記并封口，在25℃的恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。待菌絲長滿培養(yǎng)皿之后，置于室溫備用。

1.2.4 長根菇拮抗試驗(yàn) 在滅好菌的超凈工作臺(tái)中，用1.2.2中滅好菌的培養(yǎng)基，倒平板至培養(yǎng)基完全鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿，且厚度不宜過高，以方便后期試驗(yàn)觀察。將制備好的培養(yǎng)基平板底部劃分為3塊區(qū)域，并對3個(gè)不同編號的菌株隨機(jī)組合，用無菌操作接種技術(shù)，將相對應(yīng)編號的菌株接種于相應(yīng)區(qū)域中央，使其相距2～3cm，做好標(biāo)記并封口，然后將平板置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)5～7d。待平板長滿菌絲之后，觀察菌株間拮抗情況。

1.3 生長條件優(yōu)化

1.3.1 長根菇菌絲生長速度試驗(yàn) 在滅好菌的超凈工作臺(tái)中，用1.2.2中滅好菌的培養(yǎng)基，倒平板，采用無菌操作打孔接種技術(shù)，將活化好的菌種接種于培養(yǎng)皿正中間，每組設(shè)置5個(gè)平行，做好標(biāo)記并封口。將接種好的平板置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。每2d按時(shí)觀察平板菌絲生長情況，生長勢，菌絲濃密程度和菌絲顏色，在平板背面記錄菌絲生長圈，計(jì)算菌落增長半徑與菌絲生長速度，進(jìn)行比較分析。

1.3.2 不同碳、氮源培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%、葡萄糖1%、瓊脂2%。用1%碳源和0.5%氮源將表5中的碳、氮源依次替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳、氮源，依次用0.5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7，標(biāo)記并封口，115℃濕熱滅菌20min，備用。

按1.3.1中方法接種培養(yǎng)，每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)。按1.3.1方法進(jìn)行觀察記錄，進(jìn)行比較分析。

1.3.3 不同pH培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn) 分別配制pH為6，7，8和9的PDA培養(yǎng)基，標(biāo)記并封口，115℃濕熱滅菌20min。按1.3.1中方法接種培養(yǎng)，每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)。按1.3.1方法進(jìn)行觀察記錄，進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子鑒定結(jié)果 將長根菇子實(shí)體提取DNA，進(jìn)行rDNA ITS序列PCR擴(kuò)增后，跑電泳后得到的膠圖，詳見圖1。如圖1所示。供試驗(yàn)的6個(gè)菌株的條帶大小在1000～750bp，這與我們預(yù)計(jì)的結(jié)果800bp相一致。說明在這次跑膠的過程中，我們得到了比較理想的條帶。

將PCR擴(kuò)增后得到的樣品直接送至有關(guān)公司測序，測序引物為PCR引物。將測序得到的序列，通過相關(guān)軟件進(jìn)行同源性比對。樣品序列通過MEGA7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，得到圖2。如圖2所示，長根菇菌株的差異不大。但相對而言，OuA與OuC的親緣關(guān)系更相近，OuA，OuC與OuB的親緣性和其他菌株相比，親緣關(guān)系相近；OuD與OuE的親緣關(guān)系更相近，OuD，OuE與OuF的親緣關(guān)系和其他菌株相比，親緣關(guān)系相近。OuC與OuD的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，OuC與OuF的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，OuD與OuF的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

2.2 菌株拮抗性比較 試驗(yàn)將PDA平板平均劃分3個(gè)區(qū)域，6個(gè)試驗(yàn)菌株3個(gè)隨機(jī)組合無菌操作打孔接種于平板中，在25℃下培養(yǎng)7d后觀察菌株之間的拮抗反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，6個(gè)菌株兩兩之間的拮抗反應(yīng)基本上都呈現(xiàn)出隆起狀，較少出現(xiàn)凹陷。菌株編號OuA與OuB，OuB與OuC有拮抗反應(yīng)，菌絲生長較為稀疏形成拮抗線。OuA與OuC，OuB與OuD，OuB與OuE，OuC與OuD，OuC與OuE，OuC與OuF，OuD與OuE，OuD與OuF和OuE與OuF有拮抗反應(yīng)，菌絲生長形成隆起的拮抗線。OuA與OuD，OuA與OuE，OuA與OuF拮抗反應(yīng)不明顯，菌絲生長較為稀疏，形成不明顯的凹陷拮抗線。OuB與OuF拮抗反應(yīng)不明顯，菌絲生長形成不明顯的隆起拮抗線。如表6和圖3所示。

2.3 不同菌株菌絲生長速度比較 此試驗(yàn)采用無菌操作打孔接種技術(shù)，將6個(gè)供試菌株接種于PDA平板中央。每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)，在25℃下培養(yǎng)5d后開始觀察，此后每2d定時(shí)觀測一次，記錄數(shù)據(jù)，并進(jìn)行分析，分析結(jié)果如表7所示。從表7可以看出，在供試驗(yàn)的6個(gè)菌株中，6個(gè)菌株之間生長勢相差不大，OuF菌株菌絲生長速度最快，而OuA菌株菌絲生長速度最慢。這幾個(gè)菌株菌絲生長速度的順序?yàn)镺uF>OuB>OuC>OuD>OuE>OuA。

2.4 碳、氮源對其生長狀況的影響

2.4.1 碳源對其生長狀況的影響 根據(jù)1.2.1和1.2.4的試驗(yàn)結(jié)果，我們選擇出3個(gè)親緣性差異比較大的菌株來進(jìn)行不同碳源培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)，3個(gè)親緣性差異比較大的菌株分別為：OuC，OuE，OuF。試驗(yàn)采用無菌操作打孔接種技術(shù)，將3個(gè)供試菌株接種于1.3.2制作的相應(yīng)的培養(yǎng)基所倒平板的中央。每個(gè)菌株在每種培養(yǎng)基上做3個(gè)重復(fù)，在25℃下培養(yǎng)5d后開始觀察，此后每2d定時(shí)觀測一次，記錄數(shù)據(jù)，并進(jìn)行分析，分析結(jié)果如表8所示。

根據(jù)表8的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，OuC菌株對供試驗(yàn)的6種碳源都能加以利用。其菌絲生長勢以葡萄糖、麥芽糖、果糖為最佳，可溶性淀粉和甘油較好，蔗糖為最差。其菌絲生長速度的順序?yàn)辂溠刻?gt;果糖>甘油>可溶性淀粉>葡萄糖>蔗糖。其中麥芽糖的菌絲生長速度最快，蔗糖的菌絲生長速度最慢，其中麥芽糖、果糖之間以及葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、甘油之間在影響菌絲生長速度上無顯著差異。而麥芽糖、果糖與葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、甘油相比較，則有顯著或極顯著差異。

OuE菌株對供試驗(yàn)的6種碳源都能加以利用。其菌絲生長勢以葡萄糖、麥芽糖、果糖為最佳，可溶性淀粉和甘油較好，蔗糖為最差。其菌絲生長速度的順序?yàn)楦视?gt;果糖>葡萄糖>麥芽糖>蔗糖>可溶性淀粉。其中甘油的菌絲生長速度最快，可溶性淀粉的菌絲生長速度最慢，其中甘油、果糖之間以及葡萄糖、麥芽糖、蔗糖之間在影響菌絲生長速度上無顯著差異。而甘油、果糖與葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和可溶性淀粉相比較，則有顯著或極顯著差異。

OuF菌株對供試驗(yàn)的6種碳源都能加以利用。其菌絲生長勢以葡萄糖、麥芽糖、果糖為最佳，可溶性淀粉和甘油較好，蔗糖為最差。其菌絲生長速度的順序?yàn)槠咸烟?gt;麥芽糖>果糖>甘油>可溶性淀粉>蔗糖。其中葡萄糖的菌絲生長速度最快，蔗糖的菌絲生長速度最慢，其中麥芽糖、葡萄糖和果糖之間以及可溶性淀粉、甘油之間在影響菌絲生長速度上無顯著差異。而麥芽糖、葡萄糖和果糖與溶性淀粉、甘油與蔗糖相比較，則有顯著或極顯著差異。

2.4.2 氮源對其生長狀況的影響 根據(jù)1.2.1和1.2.4的試驗(yàn)結(jié)果，我們選擇出3個(gè)親緣性差異比較大的菌株來進(jìn)行不同氮源培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)，3個(gè)親緣性差異比較大的菌株分別為：OuC，OuE，OuF。試驗(yàn)采用無菌操作打孔接種技術(shù)，將3個(gè)供試菌株接種于1.5.6制作的相應(yīng)的培養(yǎng)基所倒平板的中央。每個(gè)菌株在每種培養(yǎng)基上做3個(gè)重復(fù)，在25℃下培養(yǎng)5d后開始觀察，此后每2d定時(shí)觀測一次，記錄數(shù)據(jù)，并進(jìn)行分析，分析結(jié)果如表9所示。

根據(jù)表9的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，供試的3個(gè)菌株對供試驗(yàn)的6種氮源的利用具有選擇性。它們能利用蛋白胨、酵母浸膏、（NH4）2SO4、KNO3、牛肉膏，不能利用尿素。OuC菌株其菌絲生長勢以蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏為最佳，（NH4）2SO4、KNO3較差。其菌絲生長速度順序?yàn)镵NO3>酵母浸膏>牛肉膏>蛋白胨>（NH4）2SO4。KNO3、牛肉膏、酵母浸膏之間與蛋白胨、（NH4）2SO4之間在對菌絲生長速度影響上無顯著差異，而KNO3、牛肉膏、酵母浸膏與蛋白胨、（NH4）2SO4之間則有顯著或極顯著差異。其中以利用酵母浸膏的效果最好，生長勢最佳。

OuE菌株菌絲生長勢以蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏為最佳，（NH4）2SO4和KNO3較差。其菌絲生長速度順序?yàn)镵NO3>牛肉膏>（NH4）2SO4>蛋白胨>酵母浸膏。蛋白胨、KNO3、牛肉膏之間與蛋白胨、（NH4）2SO4之間在對菌絲生長速度影響上無顯著差異，而KNO3、牛肉膏與蛋白胨、（NH4）2SO4和酵母浸膏之間則有顯著或極顯著差異。其中以利用牛肉膏的效果最好，生長勢最佳。

OuF菌株菌絲生長勢以蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏為最佳，（NH4）2SO4和KNO3較差。其菌絲生長速度順序?yàn)镵NO3>蛋白胨>酵母浸膏>牛肉膏>（NH4）2SO4。蛋白胨、KNO3、酵母浸膏之間在對菌絲生長速度影響上無顯著差異，其中以利用酵母浸膏的效果最好，生長勢最佳。

2.5 pH對其生長狀況的影響 根據(jù)1.2.1和1.2.4的試驗(yàn)結(jié)果，我們選擇出3個(gè)親緣性差異比較大的菌株來進(jìn)行不同碳源培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)，3個(gè)親緣性差異比較大的菌株分別為：OuC，OuE，OuF。試驗(yàn)采用無菌操作打孔接種技術(shù)，將3個(gè)供試菌株接種于1.5.7制作的相應(yīng)的培養(yǎng)基所倒平板的中央。每個(gè)菌株在每種培養(yǎng)基上做3個(gè)重復(fù)，在25℃下培養(yǎng)5d后開始觀察，此后每2d定時(shí)觀測一次，記錄數(shù)據(jù)，并進(jìn)行分析，分析結(jié)果如表10所示。

從表10的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，在pH6～9，pH不同，對長根菇菌絲生長的影響不大。供試的3個(gè)菌株對供試驗(yàn)的4種pH不同的PDA培養(yǎng)基都能加以利用，且生長勢較好。OuC菌株其菌絲生長速度的順序?yàn)閜H8>pH7>pH6>pH9。其中以PDA培養(yǎng)基pH=8時(shí)菌絲生長速度為最佳，且不同pH之間差異不顯著。

OuE菌株其菌絲生長速度的順序?yàn)閜H6>pH7>pH9>pH8。其中以PDA培養(yǎng)基pH=6時(shí)菌絲生長速度為最佳。pH6、pH7、pH9之間菌絲生長速度差異不顯著，pH6、pH7、pH9與pH8相比較，則有顯著或極顯著差異。

OuF菌株其菌絲生長速度的順序?yàn)閜H6=pH9>pH7>pH8。其中以PDA培養(yǎng)基pH=6，pH=9時(shí)菌絲生長速度為最佳，且不同pH之間差異不顯著。

3 討論

在這個(gè)試驗(yàn)中，通過分子鑒定試驗(yàn)，可以看出供試的6個(gè)長根菇菌株在DNA遺傳上，相似度較大。通過拮抗試驗(yàn)，可以看出6個(gè)長根菇菌株有兩兩拮抗反應(yīng)，但拮抗反應(yīng)（拮抗線）不明顯。由此，可以看出分子鑒定試驗(yàn)與拮抗試驗(yàn)相互映證，所做的試驗(yàn)結(jié)果是正確的。

在測定菌絲生長速度試驗(yàn)中，6個(gè)供試菌株菌絲生長速度差異不太明顯，相對而言，菌株OuF菌絲生長速度最快，而OuA菌絲生長速度最慢。這幾個(gè)菌株菌絲生長速度的順序?yàn)镺uF>OuB>OuC>OuD>OuE>OuA，在生產(chǎn)實(shí)踐中，生產(chǎn)者應(yīng)優(yōu)先考慮選擇OuF應(yīng)用于生產(chǎn)。此試驗(yàn)因?yàn)闃悠窋?shù)量少，得出的結(jié)論不具有代表性，接下來，應(yīng)繼續(xù)擴(kuò)大樣品數(shù)量，進(jìn)行試驗(yàn)。

在不同碳、氮源培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)中，不同菌株在不同碳源培養(yǎng)基生長情況稍有不同。OuC菌株利用的最佳碳源是麥芽糖，OuE菌株利用的最佳碳源是果糖，OuF菌株利用的最佳碳源是麥芽糖。這與譚偉等[18]的試驗(yàn)結(jié)果是相一致的。而不同菌株對不同氮源的利用情況有不同。它們不能利用尿素，對其他的氮源的利用情況稍有不同，OuC與OuE利用的最佳氮源是牛肉膏，OuF利用的最佳氮源是酵母浸膏。

在不同pH培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)中，供試的4個(gè)pH對試驗(yàn)菌株的影響不大。相對而言，OuC在PDA培養(yǎng)基pH=8，pH=6時(shí)菌絲生長速度為最佳，OuE在PDA培養(yǎng)基pH=7時(shí)菌絲生長速度為最佳，OuF在PDA培養(yǎng)基pH=9時(shí)菌絲生長速度為最佳。在以后的試驗(yàn)中，應(yīng)該擴(kuò)大試驗(yàn)培養(yǎng)基pH的范圍，繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)。

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