過表達(dá)微小RNA-21對(duì)c-Kit+心臟干細(xì)胞增殖、遷移及分化的影響*

王 艷，石 蓓，鄧文文，王冬梅, 盛 瑾, 陳文明

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 貴州 遵義 563000)

近十余年來，多項(xiàng)研究表明在成年哺乳動(dòng)物心臟組織中存在一種c-Kit+心臟干細(xì)胞(cardiac stem cells，CSCs)，在心肌梗死后可遷移至損傷區(qū)域增殖、分化為心肌譜系細(xì)胞，如心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等，改善心肌梗死后心室重構(gòu)和心功能[1-2]。更重要的是，CADUCEUS 和 SCIPIO 這2項(xiàng) I 期臨床試驗(yàn)也表明心臟干細(xì)胞在治療心肌梗死上具有良好的可行性及安全性[3]。然而心臟干細(xì)胞在體外擴(kuò)增周期長，增殖受限，極易分化為心肌譜系細(xì)胞，在移植治療前就已失去干細(xì)胞特性，使得心臟干細(xì)胞移植治療心肌梗死的研究未取得突破性進(jìn)展[4]。因此，如何最大限度地激活干細(xì)胞增殖效應(yīng)、促進(jìn)心臟干細(xì)胞分化為心肌譜系細(xì)胞具有重要研究價(jià)值。

微小RNA-21(microRNA-21, miR-21)是強(qiáng)有力的抗凋亡因子，在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中均呈高表達(dá)狀態(tài)，促使腫瘤細(xì)胞在缺血缺氧環(huán)境中存活、增殖及遷移[5]。研究顯示miR-21在心血管系統(tǒng)細(xì)胞中均高表達(dá)，參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡及分化過程[6]。這些研究提示，miR-21不僅具有抗細(xì)胞凋亡能力，并參與調(diào)控細(xì)胞增殖分化作用。然而，目前鮮有miR-21與c-Kit+CSCs生物學(xué)行為的研究報(bào)道。本研究擬通過在c-Kit+CSCs中過表達(dá)miR-21，觀察瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-21對(duì)c-Kit+CSCs增殖、遷移及分化的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

清潔級(jí)50～60 g SD大鼠(重慶第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)為SCXK(渝)2007-0005。Ham’s/F-12培養(yǎng)液(HyClone)；胎牛血清(Thermo Fisher Scientific)；胰蛋白酶(Gibco)；雙抗(Solarbio)；大鼠堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF；PeproTech)；包被羊抗兔 II 抗的磁珠(Dynabeads?M-280；Dynal Biotech)；兔抗大鼠c-Kit抗體(Biorbyt)；APC標(biāo)記羊抗兔 II 抗(Advansta)；PE標(biāo)記小鼠抗大鼠CD45抗體、PE標(biāo)記小鼠抗大鼠CD34抗體及兔抗大鼠Nkx2.5、CD31和α-SMA多克隆抗體(BioLegend)；miR-21模擬物陰性對(duì)照(mimics negative control,MNC)、miR-21模擬物(mimics)和Edll試劑盒(廣州銳博生物科技公司)；miRNA熒光定量PCR試劑盒和莖環(huán)法miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工生物有限公司)；U6、miR-21、Nkx2.5、CD31和α-SMA引物的設(shè)計(jì)合成由上海生工生物有限公司完成。

2 方法

2.1大鼠c-Kit+CSCs分離、培養(yǎng)及鑒定 大鼠c-Kit+CSCs分離、培養(yǎng)及鑒定參照既往已熟練掌握的方法[7]。用乙醇對(duì)已肝素化的大鼠進(jìn)行消毒，在超凈臺(tái)中迅速取出心耳，并用含雙抗的0.1 mol/L磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS；配制 16 g NaCl、0.4 g KCl 、7.16 g Na2HPO4·12H2O 、0.54 g KH2PO4去離子水定容至2 L，調(diào)pH值至7.2～7.4，分裝于500 mL玻璃瓶中，用前高溫滅菌冷卻后4 ℃保存?zhèn)溆?反復(fù)沖洗心臟，以洗去心耳中的血跡，隨后充分剪碎心耳。將剪碎的心臟組織置于離心管中，1 200 r/min離心5 min，棄上清后加入含0.1% Ⅱ型膠原酶(Sigma)2 mL，置于37 ℃恒溫水浴箱中不斷搖晃。待瓶中的心臟組織塊呈白色纖維狀時(shí)，停止消化(約需40 min)，1 200 r/min離心 5 min后棄上清。向沉淀中加入3 mL含10%胎牛血清、10 μg/L重組人白血病抑制因子、20 μg/L成纖維細(xì)胞生長因子、10 μg/L 表皮細(xì)胞生長因子 和1%青-鏈霉素的F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，2～3 d換液 1 次。待原代細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底后，PBS洗滌2次，用0.05%胰酶5 mL消化細(xì)胞，10%胎牛血清終止消化后1 200 r/min離心5 min，棄上清，加入2.5% BSA混勻，靜止5 min后1 200 r/min離心5 min，棄上清。加入含1%胎牛血清的F12培養(yǎng)基及兔抗大鼠c-Kit抗體(1∶250)，移入5 mL EP管中，并置于垂直混合儀上4 ℃ 下旋轉(zhuǎn)孵育1 h，離心并棄上清，PBS重懸細(xì)胞，隨后用羊抗兔 II 抗包被的2.8 μm 磁珠孵育細(xì)胞懸液，置于垂直混合儀上，放入4 ℃ 冰箱內(nèi)上下旋轉(zhuǎn)孵育30 min。隨后裝有細(xì)胞懸液的離心管置于DYNAL 磁力架中，分選4 min后，用1 mL注射器輕輕快速吸去管中的液體，重懸管壁上的棕褐色顆粒(磁珠為棕褐色)，再將離心管置于磁力架上，重復(fù)上一步驟。磁力分選完成后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用含15%胎牛血清、10 μg/L 重組人白血病抑制因子、20 μg/L bFGF、10 μg/L表皮細(xì)胞生長因子和1%青-鏈霉素的F12培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 3 d后第 1 次換液，之后2 d換液 1 次。培養(yǎng)至6～8 d后細(xì)胞融合至80%～90%便可上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志c-Kit、CD45和CD34的鑒定。

2.2以Lipofectamine? 2000為載體轉(zhuǎn)染c-Kit+CSCs 取磁珠分選后的細(xì)胞，按每孔(5～8)×105個(gè)的細(xì)胞密度接種于6孔板中，37 ℃孵箱過夜，后吸走培養(yǎng)基(如果細(xì)胞生長良好、密度適宜，可不用換液)，再每孔加入無血清無雙抗F12培養(yǎng)基1.5 mL(預(yù)實(shí)驗(yàn)中按30、50和100 nmol/L濃度摸索出最佳轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/L)。配制溶液A：245 μL無血清無雙抗F12培養(yǎng)基加5 μL miR-21 mimics；配制溶液B：245 μL無血清無雙抗F12培養(yǎng)基加5 μL Lipofectamine? 2000；各孵育5 min后，將溶液B加入溶液A中，輕輕混勻，室溫孵育20 min后，加入6孔板內(nèi)。混勻后CO2培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)孵育4～6 h后更換成正常的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

2.3qPCR檢測miR-21表達(dá)水平 以Lipofecta-mine? 2000為載體轉(zhuǎn)染c-Kit+CSCs后48 h收集細(xì)胞，按RNA抽提試劑盒說明書進(jìn)行，提取總RNA，通過莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以U6為內(nèi)參照，按miRNA熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行cDNA的qPCR擴(kuò)增。miR-21的逆轉(zhuǎn)錄引物序列為5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATA-CGACTCAACA-3’，上游引物序列為5’-GCGGCGGTAGCTTATCAGACTG-3’，下游引物序列為5’-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3’；U6的逆轉(zhuǎn)錄引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性30 s;94 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)通過Ct比較法進(jìn)行分析，按2-ΔΔCt法定量。

2.4CCK-8法檢測c-Kit+CSCs增殖效應(yīng) 待各組細(xì)胞生長融合度高于80%后，予以胰酶消化、收集細(xì)胞懸液，離心(1 000 r/min，5 min)、棄上清，Ham’s/F-12完全培養(yǎng)基將沉淀重懸為單細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；向96孔板中加入細(xì)胞懸液(每孔5 000個(gè))，體系為每孔100 μL，孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)(37 ℃，5%CO2)；24 h后取出96孔板觀察CSCs生長狀態(tài)良好后，向96孔板中加入CCK-8溶液每孔20 μL，孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)30 min；酶標(biāo)儀測定波長450 nm處吸光度。

2.5EdU法檢測c-Kit+CSCs的增殖能力 取各組細(xì)胞分別接種于培養(yǎng)皿中，24 h后細(xì)胞生長密度達(dá)60%～80%，每個(gè)皿內(nèi)加入50 μmol/L EdU培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，棄培養(yǎng)基，PBS洗2次，每次5 min，4%多聚甲醛室溫固定30 min，棄固定液，加入0.2%甘氨酸搖床孵育5 min，PBS洗5 min，加入0.5% Triton X-100破膜10 min，PBS洗5 min，每孔加入100 μL的1×Apollo染色反應(yīng)液，避光室溫?fù)u床孵育30 min，棄反應(yīng)液，加入0.5% Triton X-100搖床清洗2次,每次10 min，之后加入100 μL甲醇清洗5 min，PBS洗5 min; DAPI染色20 min，PBS洗3次，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

2.6qPCR及免疫熒光檢測心肌譜系細(xì)胞標(biāo)志物Nkx2.5、CD31及α-SMA的表達(dá) 按RNA抽提試劑盒說明書的步驟提取總RNA，通過轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參照，qPCR檢測c-Kit+CSCs內(nèi) Nkx2.5、CD31和α-SMA的mRNA表達(dá)水平。Nkx2.5的上游引物序列為5’-CTCTCCTGCTTTCCCAACC-3’，下游引物序列為5’-GTCTGTCTCGGCTTTGTCCAG-3’；CD31的上游引物序列為5’-GGCGGTGGTGACAGTATCTT-3’，下游引物序列為5’-CTCGGTGATGTACACGATGC-3’；α-SMA的上游引物序列為5’-CAGCTATGTGGGGGACGAAG-3’，下游引物序列為5’-TCCGTTAGCAAGGTCGGATG-3’；β-actin的上游引物序列為5’-ATAATCGCTGCCTGGTCGTC-3’，下游引物序列為5’-AGGATGGCGTGAGGGAGAGC-3’。反應(yīng)條件同上。

用免疫熒光法檢測不同處理對(duì)于c-Kit+CSCs中心肌譜系標(biāo)志物蛋白表達(dá)的變化。消化收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心8 min，再用F12完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞，以1×108/L接種培養(yǎng)皿中，觀察細(xì)胞長滿蓋玻片的80%左右，棄培養(yǎng)基，37 ℃預(yù)熱的PBS沖洗2～3次，各實(shí)驗(yàn)組按照要求給予不同處理因素分別處理，吸干培養(yǎng)基，PBS沖洗2～3次，4%多聚甲醛室溫固定30 min。PBS沖洗2～3次，0.5% Triton X-100破膜10 min，PBS沖洗2～3次，山羊血清封閉30 min，濾紙吸干封閉液，滴加按1∶400稀釋好的 I 抗(兔抗大鼠多克隆抗體)，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗2～3次，吸干沖洗液，滴加按1∶1 000稀釋好的 II 抗(FITC/PE標(biāo)記的羊抗兔IgG)，PBS沖洗2～3次，吸干沖洗液，DAPI染色5 min，PBS沖洗2～3次，吸干沖洗液，滴加含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

2.7劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 用標(biāo)記筆在培養(yǎng)皿的背面，均勻劃出5條橫線，每孔加入約5×105個(gè)CSCs，待細(xì)胞貼壁后，用滅菌槍頭沿直尺并垂直于背面所畫橫線做劃痕，槍頭需保持垂直；PBS輕輕沖洗3次，洗去劃落的細(xì)胞，加入不含血清的培養(yǎng)基使各組細(xì)胞達(dá)到同步化；隨后置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；分別于劃痕后48 h和72 h時(shí)于顯微鏡下觀察并拍照，并用相應(yīng)軟件計(jì)算遷移率。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。正態(tài)分布資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，方差齊采用LSD法，方差不齊采用Tamhane’s T2法，偏態(tài)分布資料采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

結(jié) 果

1 大鼠c-Kit+ CSCs培養(yǎng)、分選及鑒定

心耳組織塊經(jīng)過酶消化離心后獲得的單細(xì)胞懸液接種到 T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，2 d后換液可見少量細(xì)胞貼壁生長，散在呈橢圓形或短棒狀；培養(yǎng)至4 d左右貼壁較好，細(xì)胞呈三角形、梭形和多角形。貼壁后快速向四周擴(kuò)增生長，大約 6 d可達(dá)到 80%～90%的融合，見圖1A。磁珠分選后3 d左右可見少量細(xì)胞貼壁，細(xì)胞表面仍可見單個(gè)或多個(gè)磁珠，大約6 d可達(dá)到 80%～90%的融合,見圖1B。

Figure 1. c-Kit+CSCs isolation. A: the primarily cultured cells were observed under microscope (×100); B: the cells sorted by immunomagnetic beads were observed under microscope (×400).

圖1原代培養(yǎng)細(xì)胞及磁珠分選后細(xì)胞形態(tài)

流式細(xì)胞術(shù)鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞，結(jié)果顯示經(jīng)磁珠分選后細(xì)胞表達(dá)c-Kit陽性率高達(dá)為90.8%，而CD45陽性率僅為0.6%，CD34陽性率僅為0.8%，符合CSCs的表型特征，見圖2。

Figure 2. The results of flow cytometry showed that the c-Kit+cells were more than 90%.

圖2流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物

2 qPCR檢測各組miRNA-21的表達(dá)量

將control組、MNC組和mimics組按不同條件處理后行qPCR檢測各組細(xì)胞中miR-21相對(duì)表達(dá)量；結(jié)果顯示，與control組相比，mimics組中miR-21表達(dá)量顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而MNC組miR-21表達(dá)量無明顯變化，見表1。

3 CCK-8法和EdU法檢測體外轉(zhuǎn)染miR-21對(duì)c-Kit+CSCs細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染miR-21模擬物及陰性對(duì)照48 h后，以CCK-8法分別檢測各組細(xì)胞活力，結(jié)果顯示mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力較其它2組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，與control組比，mimics組細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)(P<0.05)，MNC組細(xì)胞的增殖能力無明顯改變，見圖3、表1。

表1miR-21對(duì)心臟干細(xì)胞增殖的影響
Table 1. The effect of miR-21 on the proliferation of CSCs (Mean±SD.n=6)

GroupmiR-21A valueEdUControl11.417±1.7160.624±0.02037.126±3.260MNC9.830±1.0050.636±0.02436.455±2.696Mimics89.872±5.076?#0.879±0.017?#69.111±3.394?#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMNC group.

4 qPCR檢測各組細(xì)胞中心臟譜系細(xì)胞標(biāo)志物mRNA的表達(dá)水平

用qPCR檢測各組心臟細(xì)胞系標(biāo)志物Nkx2.5、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31及平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA的mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與control組相比，MNC組及mimics組c-Kit+CSCs的Nkx2.5、CD31和α-SMA mRNA表達(dá)水平無差異，見表2。這表明，體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-21對(duì)c-Kit+CSCs無明顯促分化作用。

表2qPCR檢測各組細(xì)胞中Nkx2.5、CD31和α-SMA的mRNA表達(dá)水平
Table 2. The mRNA expression levels of Nkx2.5, CD31 and α-SMA detected by qPCR (Mean±SD.n=9)

GroupNkx2.5 CD31 α-SMAControl98.469±11.787 73.275±10.89074.730±3.232MNC94.348±10.38569.671±8.90267.540±5.056Mimics106.595±8.719 75.654±13.55063.631±3.107

5 免疫熒光檢測各組細(xì)胞中心臟譜系細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)

進(jìn)一步以免疫熒光檢測各組心肌細(xì)胞標(biāo)志物Nkx2.5、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31及平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與control組相比，MNC組及mimics組c-Kit+CSCs的Nkx2.5、CD31和α-SMA的蛋白表達(dá)水平無差異，進(jìn)一步證明瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-21對(duì)c-Kit+CSCs向心肌譜系細(xì)胞分化無明顯促進(jìn)作用，但也無明顯抑制作用，見圖4～6、表3。

6 體外轉(zhuǎn)染miR-21對(duì)c-Kit+ CSCs遷移能力的影響

采用劃痕實(shí)驗(yàn)的方法來初步評(píng)估m(xù)iR-21對(duì)c-Kit+CSCs遷移作用的影響，結(jié)果顯示，體外轉(zhuǎn)染miR-21陰性對(duì)照或模擬物對(duì)細(xì)胞遷移無明顯的不良影響，但也未顯示出明顯抑制或促進(jìn)c-Kit+CSCs遷移的作用，見圖7、表4。

Figure 3. EdU assay was used to detect the proliferation ability of the CSCs (×200， the scale bar=50 μm).

圖3EdU法檢測各組細(xì)胞的增殖能力

Figure 4. The expression of myocardial cell marker Nkx2.5 in the CSCs detected by immunofluorescence (×200, the scale bar=50 μm).

圖4免疫熒光檢測心肌細(xì)胞標(biāo)志物在各組細(xì)胞中的表達(dá)情況

Figure 5. The expression of endothelial cell marker CD31 in the CSCs detected by immunofluorescence (×200, the scale bar=50 μm).

圖5免疫熒光檢測內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物在各組細(xì)胞中的表達(dá)情況

Figure 6. The expression of smooth muscle cell marker α-SMA in the CSCs detected by immunofluorescence (×200, the scale bar=50 μm).

圖6免疫熒光檢測平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物在各組細(xì)胞中的表達(dá)情況

表3免疫熒光檢測各組細(xì)胞中Nkx2.5、CD31和α-SMA的蛋白表達(dá)水平
Table 3. The protein expression levels of Nkx2.5， CD31 and α-SMA determined by immunofluorescence (Mean±SD.n=6)

GroupNkx2.5CD31 α-SMAControl 366.980±3.324134.190±1.946132.320±7.121MNC365.360±2.634132.280±1.544133.260±1.392Mimics363.720±1.978 132.060±1.513132.380±9.632

Figure 7. The migration ability of the c-Kit+CSCs detected by scratch test (the scale bar=200 μm).

圖7細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞遷移能力的影響

表4miR-21對(duì)心臟干細(xì)胞遷移的影響
Table 4. The effect of miR-21 on the migration of c-Kit+CSCs (×104μm2. Mean±SD.n=3)

GroupArea (24 h)Area (48 h)Control56.375±0.00742.913±1.716MNC56.068±0.74743.031±1.431Mimics56.664±0.72942.322±0.783

討 論

在正常成年人和大鼠心臟內(nèi)含有原始的、未分化的心臟固有的CSCs，這些細(xì)胞具有心臟組織特異性，當(dāng)心臟受到損傷時(shí)(如心肌梗死)，可被激活并參與心臟修復(fù)[1-8]。研究表明，c-Kit+CSCs增殖和分化潛能優(yōu)于其它干細(xì)胞類型[9-10]。在小鼠心肌梗死模型中，經(jīng)冠脈輸注的c-Kit+CSCs可遷移至心肌梗死區(qū)域，可通過增殖、分化或旁分泌作用，再生修復(fù)梗死心肌，減少心肌梗死面積，改善心功能[11-12]。更重要的是，目前c-Kit+CSCs已經(jīng)用于I期臨床研究，具有較高的安全性和療效[3]。本實(shí)驗(yàn)成功獲取純度較高的c-Kit+CSCs。此外，由于磁珠分選后并未進(jìn)行細(xì)胞傳代，故此時(shí)的c-Kit+CSCs大部分處于未分化狀態(tài)，仍具有較強(qiáng)的增殖、分化潛能。

隨著近年來對(duì)干細(xì)胞研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞不但可以直接再生心肌組織，而且還能通過旁分泌效應(yīng)，增加細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)血管再生[13]。然而van Berlo等[4]近期的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，成年及慢性疾病的小鼠心臟受損后，心臟固有干細(xì)胞確實(shí)能分化為心肌細(xì)胞，但在不考慮細(xì)胞融合情況下所占比率僅為3%。此外，由于心肌梗死后局部炎癥及氧化應(yīng)激微環(huán)境使移植細(xì)胞存活率極低，難以發(fā)揮再生修復(fù)梗死心肌的作用[14]。因而目前的研究更傾向于認(rèn)為干細(xì)胞系通過旁分泌效應(yīng)，增加細(xì)胞因子的表達(dá)，改善心梗局部微環(huán)境，如促進(jìn)血管新生、改善微循環(huán)灌注、減輕心肌細(xì)胞凋亡等而發(fā)揮修復(fù)梗死心肌作用[15-16]。由于殘存細(xì)胞增殖受限，其旁分泌功能相應(yīng)受影響，因而促進(jìn)細(xì)胞增殖效應(yīng)有利于細(xì)胞旁分泌作用的發(fā)揮，對(duì)增強(qiáng) c-Kit+CSCs修復(fù)梗死心肌的能力起舉足輕重作用。

微小RNA(microRNA，miRNA)憑借其對(duì)基因網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜調(diào)控作用，成為近年來的研究熱點(diǎn)，在腫瘤細(xì)胞及多種組織細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞及成體干細(xì)胞中均存在miRNAs的表達(dá)，其通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后翻譯過程，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖和分化等生物學(xué)進(jìn)程[17-18]。研究表明，miR-21具有促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞增殖及分化的作用[19-20]。采用病毒攜帶miR-21反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細(xì)胞HCT11株中，可有效降低miR-21的相對(duì)表達(dá)量，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖及遷移能力[21]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在多種心血管疾病中差異表達(dá)，參與心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展過程,并能調(diào)控心血管相關(guān)細(xì)胞的增殖和分化過程[22]。將胚胎源性心臟干細(xì)胞(SSEA1+/MESP1+)移植到小鼠缺血后肢，可顯著促進(jìn)新生血管形成，而在該類型細(xì)胞中miR-21高表達(dá)[23]。

在本實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)miR-21的c-Kit+CSCs在培養(yǎng)過程中，經(jīng)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力較對(duì)照組及模擬物陰性轉(zhuǎn)染組顯著增加。采用EdU分析法進(jìn)一步檢測轉(zhuǎn)染miR-21對(duì)細(xì)胞增殖狀態(tài)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-21模擬物組細(xì)胞增殖能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照組及模擬物陰性轉(zhuǎn)染組。這些研究說明體外轉(zhuǎn)染miR-21可有效促進(jìn)細(xì)胞增。體外培養(yǎng)的細(xì)胞增殖作用增強(qiáng)，可明顯提高其旁分泌效應(yīng)，為干細(xì)胞的非細(xì)胞治療提供基礎(chǔ)。

由于干細(xì)胞在脫離自身微環(huán)境后，極易定向分化為其它細(xì)胞類型。此外，miR-21在既往研究中顯示出可誘導(dǎo)細(xì)胞分化的能力，如Kim 等[24]將攜帶miR-21的慢病毒轉(zhuǎn)染至人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，可顯著促進(jìn)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。為盡量避免體外轉(zhuǎn)染miR-21影響c-Kit+CSCs的干性，本實(shí)驗(yàn)采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法?？紤]到體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-21是否影響c-Kit+CSCs的干性特征，促進(jìn)其向心肌細(xì)胞譜系分化。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR及免疫熒光初步檢測細(xì)胞內(nèi)心肌細(xì)胞譜系標(biāo)志物Nkx2.5、CD31和α-SMA發(fā)現(xiàn)，我們所培養(yǎng)分選的c-Kit+CSCs可部分表達(dá)心肌細(xì)胞標(biāo)志物Nkx2.5、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31，以及平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA，這與絕大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道一致。然而本研究顯示體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-21并不能促進(jìn)細(xì)胞分化，但也沒有抑制細(xì)胞分化效應(yīng)的作用，這提示在后續(xù)研究中，我們所使用的細(xì)胞仍為具有較強(qiáng)增殖分化潛能的純度較高的c-Kit+CSCs。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)初步分析過表達(dá)miR-21對(duì)c-Kit+CSCs遷移作用，發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-21對(duì)c-Kit+CSCs遷移作用無明顯影響。

綜上所述，miR-21可明顯促進(jìn)c-Kit+CSCs增殖效應(yīng)，但對(duì)細(xì)胞分化及遷移作用無明顯影響，這為miRNA修飾增強(qiáng)c-Kit+CSCs體外擴(kuò)增能力，維持其干細(xì)胞特性，從而提高c-Kit+CSCs臨床利用率提供依據(jù)。當(dāng)然，進(jìn)一步的機(jī)制探討及體內(nèi)研究有待進(jìn)一步進(jìn)行。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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