活化素受體樣激酶1及其在血管生成中的作用*

林比霖，徐方云，黃永紅△

(南昌大學(xué) 1第二臨床醫(yī)學(xué)院， 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 江西 南昌 330006)

血管生成是指新的血管從已存在的毛細(xì)血管網(wǎng)生成的過程，受血管生成促進(jìn)因子和抑制因子的嚴(yán)格調(diào)控。通常，血管生成發(fā)生于胚胎和出生后早期血管的發(fā)育過程中，除女性生理周期和傷口愈合等過程外，在成年階段血管生成已處于靜息狀態(tài)。但是，在發(fā)生某些疾病如腫瘤、糖尿病視網(wǎng)膜病變、心血管疾病及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[1-2]時，血管生成過程被異常激活?；罨厥荏w樣激酶1(activin receptor-like kinase 1，ALK1)是轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)超家族I型受體，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶受體。研究表明，ALK1基因特異性地高表達(dá)于活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞，是血管發(fā)育及血管生成的重要調(diào)節(jié)因子。近年來隨著對ALK1研究的不斷深入，其在血管發(fā)育和病理性血管生成中的作用引起了科研人員的廣泛關(guān)注，ALK1已成為血管生成相關(guān)性疾病研究的重要靶標(biāo)。

1 ALK1的結(jié)構(gòu)與表達(dá)

1.1ALK1的結(jié)構(gòu)[3]編碼人ALK1的基因ACVRL1定位于12q13.13，其cDNA長度約1 512 bp，由11個外顯子組成。ALK1蛋白是一種存在于細(xì)胞膜上的跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，其前體由5個部分組成，包括氨基端(N端)信號肽、富含半胱氨酸的胞外結(jié)構(gòu)域、近膜區(qū)富含甘氨酸/絲氨酸的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域及跨膜結(jié)構(gòu)域,見圖1。其中，N端信號肽在其加工成熟后被水解；富含半胱氨酸的胞外結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與胞外配體結(jié)合；近膜區(qū)富含甘氨酸/絲氨酸的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域存在特征性的高度保守的TTSGSGSG基序，稱為GS區(qū)域；TGF-β/BMPs超家族I型受體的絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域具有一個重要特點即具有由9個氨基酸形成的激酶域L45環(huán)。ALK1上的L45環(huán)、磷酸化GS序列和受體活性型Smad(receptor activated-drosophila mother against decapentaplegic protein，R-Smad)上的MH2結(jié)構(gòu)域的L3環(huán)決定了ALK1和Smad結(jié)合的特異性。

Figure 1. Structural diagram of activin receptor-like kinase 1 (modified from reference [3]).

圖1活化素受體樣激酶1的結(jié)構(gòu)示意圖

1.2ALK1的表達(dá) 最初ALK1被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于受孕后6.5 d的小鼠胚胎，在受孕后7.5～8.5 d ALK1的表達(dá)達(dá)到峰值，而且ALK1的表達(dá)與血管發(fā)生的部位相重疊[4]，提示ALK1的表達(dá)可能與血管發(fā)生有關(guān)。迄今已發(fā)現(xiàn)ALK1表達(dá)于多個物種的不同組織細(xì)胞。視網(wǎng)膜、骨髓、脾臟、腎臟和腦等多種組織均存在ALK1的表達(dá)。在大鼠，ALK1除在肺臟中表達(dá)豐度較高外，還表達(dá)于腎臟、大腦、心臟、腸道、胸腺、胃、脾臟及大鼠胚胎的尿生殖嵴等多個器官。在成人，ALK1表達(dá)于胎盤、脂肪組織、骨骼肌、肺和眼睛等組織中。除內(nèi)皮細(xì)胞外，在單核細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、肝臟星形細(xì)胞、神經(jīng)嵴干細(xì)胞、硬皮病成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞均有ALK1表達(dá)的報道[3]。

有研究認(rèn)為ALK1的表達(dá)在胚胎發(fā)育時呈活躍狀態(tài)，出生后血管ALK1的表達(dá)則受到抑制,但在某些疾病狀態(tài)下ALK1的表達(dá)重新被激活，呈現(xiàn)異常表達(dá)。在一些纖維化疾病如硬皮病和肝纖維化中均發(fā)現(xiàn)存在ALK1蛋白的活化。Pannu等[5]發(fā)現(xiàn)ALK1下游轉(zhuǎn)錄因子p-Smad1過度表達(dá)于硬皮病病人的皮膚組織;Wiercinska等[6]報道ALK1下游靶分子分化抑制因子(inhibitor of differentiation，Id)1在大鼠肝星形細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。許多腫瘤組織包括淋巴瘤、前列腺癌、皮膚癌、甲狀腺癌、腎癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌和肝癌組織中均存在ALK1的高表達(dá)，且與腫瘤血管生成密切相關(guān)[7]，表明ALK1介導(dǎo)的血管生成在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。

2 ALK1信號通路

2.1BMP9/BMP10-ALK1信號通路 ALK1曾被認(rèn)為是一種孤兒受體，但現(xiàn)已證實ALK1是TGF-β/BMPs 超家族I型受體，其上游至少包括4種配體,即TGF-β1、TGF-β3、BMP9和BMP10，其中BMP9和BMP10被認(rèn)為是ALK1特異性高親和力配體[8]。BMP9主要表達(dá)于肝臟，包括肝細(xì)胞、肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞;BMP10主要局限于心房和心室的肌小梁，可能在胚胎心肌小梁的形成中具有重要作用。成體心臟中BMP10仍有高表達(dá)，但主要局限在右心房。小鼠BMP10的表達(dá)常常早于BMP9的表達(dá)，兩者均存在于循環(huán)血液中。由于血漿BMP9敲除的小鼠不能活化BMP-Smad信號，故BMP9被認(rèn)為是循環(huán)血液中具有生物學(xué)活性的BMP。

目前認(rèn)為，BMP9/BMP10信號可通過靶細(xì)胞膜上特異的BMP I型受體(BMP type I receptor，BMPRI)和BMP II型受體(BMPRII)復(fù)合物激活下游Smad通路和非Smad通路，從而產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)[9],見圖2。大多數(shù)情況下，循環(huán)BMP9/BMP10結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞膜上的BMPRII，招募并磷酸化BMPRI-ALK1，活化的ALK1磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子Smad1/5/8，活化的R-Smads與公共Smad(Smad4)形成二聚體復(fù)合物，轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核調(diào)節(jié)下游靶基因,如Id1、Id3、跨膜蛋白100(transmembrane protein 100，TMEM100)、EphrinB2、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及發(fā)狀分裂相關(guān)增強子(hairy and enhancer of split，HES)和HES相關(guān)YRPW基序(HES-related with YRPW motif，HEY)等的表達(dá)，而抑制性Smads包括Smad6和Smad7則可以阻斷上述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。BMP9/BMP10-ALK1信號也可以通過非Smad通路如有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)和蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)通路來傳遞。此外，內(nèi)皮中BMP9/BMP10-ALK1信號還受輔助性受體endoglin的調(diào)節(jié)。

2.2ALK1信號與ALK5信號之間的關(guān)系 在內(nèi)皮細(xì)胞中，ALK1和ALK5同屬TGF-β家族I型受體，協(xié)同調(diào)節(jié)血管生成。TGF-β結(jié)合并活化ALK5，磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子Smad2/3來調(diào)節(jié)血管生成；而ALK1主要受配體BMP9/BMP10調(diào)節(jié)，磷酸化Smad1/5。有研究認(rèn)為ALK1信號與ALK5信號之間存在相互作用[10]。首先，ALK1的激活往往需要ALK5的作用，同時活化的ALK1也是ALK5表達(dá)所必需；其次，TGF-β1能活化ALK1，進(jìn)而抑制ALK5及其下游Smad2/3的活化。因此，ALK1和ALK5以TGF-β1作為直接的共同配體，可能是一個平衡的整體，彼此相互拮抗，相互補充，從而使得TGF-β1在功能上往往表現(xiàn)出不同的傾向，抑制或促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，這可能也是TGF-β因子功能呈雙向性的原因之一。最近有研究發(fā)現(xiàn)，Smad轉(zhuǎn)錄共抑制因子Ski相關(guān)新穎N蛋白(Ski-related novel protein N，SnoN)是連接ALK1信號與ALK5信號的核心因子[11],一方面，SnoN通過與Smad2/3結(jié)合并抑制其活化而負(fù)向調(diào)控ALK5信號；另一方面，SnoN能直接結(jié)合質(zhì)膜上的ALK1，促進(jìn)Smad1/5活化。然而，有研究小組對ALK1信號依賴于ALK5信號的觀點持有異議[12-13]。Shao等[12]研究證實抑制牛大動脈內(nèi)皮細(xì)胞ALK5并不會妨礙BMP9/ALK1誘導(dǎo)的Smad1/5/8磷酸化。特異性敲除小鼠內(nèi)皮ALK5并不會導(dǎo)致血管畸形，類似現(xiàn)象也存在于斑馬魚模型中。另外，有研究者發(fā)現(xiàn)ALK5在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)水平很低，主要表達(dá)于血管周細(xì)胞，以一種旁分泌的方式來調(diào)節(jié)血管生成。因此，從目前研究來看，雖然ALK5信號與血管的穩(wěn)態(tài)相關(guān)，但ALK1信號是否依賴于ALK5信號，其與ALK5在內(nèi)皮細(xì)胞中確切的關(guān)系仍需進(jìn)一步明確。

Figure 2. BMP9/BMP10-ALK1 signaling pathway.

圖2BMP9/BMP10-ALK1信號通路

2.3ALK1信號與VEGF信號之間的關(guān)系 VEGF是一種特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能生長因子，是重要的促進(jìn)血管生成的信號分子。目前研究認(rèn)為，VEGF信號與ALK1信號分別在血管生成的不同階段發(fā)揮作用。VEGF信號主要在血管生成的初始階段起作用，參與促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移、基底膜的重塑和血管的出芽；ALK1信號主要在血管的成熟與穩(wěn)定期起作用。體外研究發(fā)現(xiàn)，ALK1信號活化能抑制VEGF誘導(dǎo)的血管出芽[14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF信號缺失能減輕因ALK1基因敲除導(dǎo)致的小鼠腦血管異常及II型遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(hereditary hemorrhagic telangiectasia，HHT2)病人的出血[15-16]。VEGF信號與ALK1信號協(xié)同調(diào)節(jié)血管生成的現(xiàn)象亦存在于腫瘤血管生成過程中。在黑色素瘤模型中，靶向ALK1的治療能降低腫瘤微血管密度，延緩腫瘤的生長，提高VEGF受體貝伐單抗的治療效果。同樣，在VEGF受體單抗藥物耐藥的腎細(xì)胞癌小鼠移植瘤模型中，VEGF受體抑制劑聯(lián)用ALK1抑制劑能明顯抑制促血管相關(guān)分子的表達(dá)，延長小鼠的生存期。這些研究提示，在抗血管生成方面，ALK1信號與VEGF信號存在互補關(guān)系，同時靶向ALK1和VEGF兩條通路抑制血管生成可能是治療血管生成異常相關(guān)性疾病的重要策略。

2.4ALK1信號與Notch信號之間的關(guān)系 Notch是一個高度保守的跨膜受體蛋白家族，通過細(xì)胞表面Notch受體與其配體Delta樣配體 (Delta-like ligand，DLL)和Jagged配體介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞之間的直接接觸而傳遞信號，在血管發(fā)育及血管生成中具有重要作用。通常，Notch信號通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮端-柄細(xì)胞表型間的平衡來影響出芽式血管新生。新近研究發(fā)現(xiàn)，ALK1信號與Notch信號之間存在交互作用。體外實驗觀察到BMP9誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)Smad1/5/8磷酸化的同時，還能上調(diào)Notch下游轉(zhuǎn)錄因子HEY1、HEY2、HES1及其配體JAG1的表達(dá)，從而影響血管出芽時端細(xì)胞和柄細(xì)胞分化[17]。而且有研究證實Smad1/5與HEY1、HEY2和Jagged1啟動子有著直接的結(jié)合，且活化的Smads與Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域之間存在直接的相互作用[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)ALK1信號下游靶蛋白Id與Notch信號下游靶蛋白HES之間也存在相互作用。Id與HES1相互作用能解除HES1的自身負(fù)反饋調(diào)節(jié)，促進(jìn)HES1表達(dá)的上調(diào)，而HEY2能競爭性抑制HES1-Id的結(jié)合[19]。近年來Aspalter等[20]研究發(fā)現(xiàn)，neuropilin-1(Nrp1)是連接Notch信號與ALK1信號的軸心，Notch活化能下調(diào)Nrp1表達(dá)，分別通過ALK1和ALK5活化Smad1/5/8 和Smad2/3，調(diào)節(jié)端-柄細(xì)胞的分化，促進(jìn)血管出芽。但也有人在斑馬魚模型研究中發(fā)現(xiàn)，ALK1和Notch對HEY2和DLL4的調(diào)節(jié)起著相反的作用，同時ALK1突變所致的動靜脈血管畸形并不受Notch信號活化或抑制的影響。這些研究表明，ALK1信號與Notch信號之間存在著更為復(fù)雜的關(guān)系，這種關(guān)系可能是環(huán)境依賴性和基因依賴性的。

3 ALK1信號在血管發(fā)育中的研究

可以肯定的是，ALK1在胚胎及出生后早期的血管發(fā)育中起著關(guān)鍵性作用[21]。在小鼠，不僅發(fā)現(xiàn)胎鼠ALK1基因的表達(dá)部位與血管發(fā)生和血管化部位相重疊，而且ALK1基因敲除的小鼠均可出現(xiàn)嚴(yán)重的血管發(fā)育異常，包括動靜脈畸形、血管過度擴(kuò)張和血管平滑肌細(xì)胞分化和募集障礙。在胚胎發(fā)育晚期敲除內(nèi)皮細(xì)胞ALK1基因，新生小鼠出現(xiàn)全身性的動靜脈短路及廣泛的動靜脈分流。ALK1基因突變的人常常發(fā)生HHT2[22]。另外，ALK1影響血管發(fā)育的現(xiàn)象在斑馬魚模型中也觀察到。ALK1基因即斑馬魚violet beauregarde(vbg)基因突變能導(dǎo)致斑馬魚出現(xiàn)血管過度擴(kuò)張及形成異常的血流循環(huán)[23]。這些研究表明ALK1調(diào)節(jié)血管發(fā)育的功能在進(jìn)化上是高度保守的，ALK1是血管發(fā)育所必需的。

盡管體內(nèi)實驗結(jié)果表明ALK1在血管發(fā)育中具有重要作用，但ALK1對血管內(nèi)皮細(xì)胞的確切作用仍存在爭議。有研究認(rèn)為，ALK1信號活化可抑制多種內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和黏附過程，負(fù)向調(diào)節(jié)血管生成，可能主要在血管生成的成熟期起作用[24]。另有相反的研究結(jié)果，認(rèn)為ALK1激活可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成。還有研究者認(rèn)為，ALK1并不影響內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，僅影響VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞出芽。造成ALK1對內(nèi)皮細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的差異可能與ALK1信號激活的方式、藥物的劑量、細(xì)胞類型及細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境等有關(guān)。

4 ALK1在血管生成相關(guān)性疾病中的研究

4.1ALK1在心血管疾病中的研究 遺傳學(xué)證據(jù)顯示，BMP9/BMP10-ALK1信號通路與2種血管發(fā)育異常疾病，即肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)和HHT2直接相關(guān)。PAH是一種以肺動脈狹窄和右心功能障礙為特征的血管性疾病。除BMPRII和Smad8突變與PAH有關(guān)外，ALK1基因突變也是造成PAH的重要原因[25-26]。最近發(fā)現(xiàn)一個5歲的PAH患者存在BMP9純合子無義突變[27]。在大鼠PAH模型中證實體內(nèi)注射BMP9可以預(yù)防或逆轉(zhuǎn)肺動脈高壓，提示BMP9可能成為臨床PAH患者治療的靶標(biāo)。HHT2是一種常染色體顯性遺傳性血管發(fā)育異常疾病，也稱為Osler-Rendu-Weber綜合征，主要表現(xiàn)為全身毛細(xì)血管異常擴(kuò)張，動靜脈畸形。目前認(rèn)為，ALK1雜合子功能缺失突變是導(dǎo)致HHT2的主要原因，而其輔助性受體endoglin突變則是導(dǎo)致HHT1的主要原因。

4.2ALK1在腫瘤血管生成中的研究 盡管ALK1在血管發(fā)育中起著關(guān)鍵性作用，但BMP9/BMP10-ALK1信號在腫瘤血管生成中的作用仍存在爭議，其確切作用可能是環(huán)境依賴性的。有研究報道BMP9在卵巢癌和肝癌細(xì)胞中表達(dá)增強[28]，而BMP9和BMP10在乳腺癌組織中表達(dá)卻下降[29]。盡管如此，抗BMP9/BMP10-ALK1的策略仍廣泛用于抗腫瘤研究領(lǐng)域，并且已取得令人可喜的成果。目前用于抗腫瘤治療的ALK1抑制劑主要有兩類，一類是可溶性重組ALK1融合蛋白dalantercept[30]，另一類是靶向ALK1胞外結(jié)構(gòu)域的抗體PF-03446962[31]。理論上來說，這2類抑制ALK1信號的藥物會產(chǎn)生不同的后果。因為delantercept只阻斷高親和力配體BMP9/BMP10與ALK1的直接結(jié)合，不影響ALK1與其它配體如TGF-β的結(jié)合；而PF-03446962是受體ALK1特異性抗體，能阻斷所有ALK1配體與之結(jié)合，包括BMP9/BMP10和TGF-β。

現(xiàn)有研究顯示，PF-03446962和dalantercept在體外實驗和嚙齒類動物的臨床前試驗中具有良好的抗腫瘤血管生成作用[32]。例如，PF-03446962不僅能抑制血清誘導(dǎo)的Smad1磷酸化，而且還能降低HUVECs的遷移、管型形成和內(nèi)皮出芽[33]，甚至在某些對VEGF抑制劑具有耐藥性的腫瘤，PF-03446962治療后亦顯示出明顯的抑制腫瘤血管生成及減輕腫瘤負(fù)荷的作用[34]。Dalantercept能減輕人腎細(xì)胞癌小鼠移植腫瘤血管的過度擴(kuò)張，增加腫瘤細(xì)胞的缺氧，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的壞死，延緩腫瘤生長[35]。但是，在一項包括黑色素瘤、乳腺癌和頭頸腫瘤的3種不同腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，dalantercept單一治療并不能使腫瘤變小[36]。在臨床試驗中dalantercept顯示出有別于抗VEGF治療的不良反應(yīng)，且其不良反應(yīng)能被病人更好地耐受[37]，表明ALK1與VEGF通過不同的機(jī)制發(fā)揮抗瘤作用。最近，dalantercept或PF-03446962單一治療已用于包括頭頸鱗癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、泌尿上皮癌、肝癌和胸膜間皮瘤等惡性腫瘤的臨床II期試驗中。一些已完成的臨床II期研究結(jié)果顯示，靶向ALK1的這2種抑制劑單一治療對復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性頭頸鱗癌和子宮內(nèi)膜癌有著較好的安全性，但并未達(dá)到預(yù)期的療效[38-39]，提示靶向ALK1的抗腫瘤治療聯(lián)合其它腫瘤靶向藥物仍然是未來靶向ALK1的抗腫瘤治療的方向。

5 展望

ALK1已成為治療血管生成異常性疾病的新靶點，與其相關(guān)的抑制劑正用于不同腫瘤患者的臨床I期和II期研究中。從公開報道的臨床I期和II期研究結(jié)果可以看出：ALK1抑制劑用于腫瘤患者具有較好的安全性，副作用小，但單一治療的有效性在某些患者中并不理想。鑒于ALK1信號與諸多血管生成信號之間存在相互作用，ALK1抑制劑聯(lián)合其它靶向血管生成的藥物應(yīng)用于血管生成異常性疾病如腫瘤、糖尿病視網(wǎng)膜病變和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的治療以及闡明ALK1信號與其它血管生成信號之間的關(guān)系將是未來研究的方向。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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