Akt/GSK-3β/Snail通路在TGF-β1誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用*

于 丹，王 瑩，高 原，劉春英

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 遼寧 沈陽(yáng) 110032)

近年來(lái)，肺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)，以順鉑為代表的一線化療藥物在臨床上被廣泛應(yīng)用，但化療耐藥和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，使得非小細(xì)胞肺癌的5年生存率很低[1]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是胚胎發(fā)育的重要生理現(xiàn)象，也參與創(chuàng)傷愈合、器官纖維化、腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥等多種病理過(guò)程[2]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，即Akt)、Wnt及核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)等信號(hào)通路被證明在腫瘤細(xì)胞EMT過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Akt/糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)/Snail信號(hào)通路作為多個(gè)通路的匯聚點(diǎn)，是否參與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)誘導(dǎo)的順鉑耐藥細(xì)胞A549/DDP發(fā)生EMT尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)TGF-β1誘導(dǎo)前后Akt/GSK-3β/Snail信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)水平，探討TGF-β1誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞發(fā)生EMT的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

A549/DDP細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)。

TGF-β1購(gòu)自Peprotech；抗Akt和p-Akt 抗體購(gòu)于南京凱基生物技術(shù)有限公司；抗GSK-3β和p-GSK-3βSer9抗體由Abcam公司提供；抗Snail抗體購(gòu)自北京博奧生物技術(shù)有限公司；抗β-actin 抗體購(gòu)自Proteintech；抗上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)和神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)抗體由博士德生物公司提供。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) A549/DDP細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)60%，換RPMI-1640無(wú)血清培養(yǎng)饑餓過(guò)夜，備用。并將細(xì)胞分成3組：TGF-β1(-)組、TGF-β1(+) 組(加入5 μg/L TGF-β1作用48 h)和LY294002組(在加入5 μg/L TGF-β1的同時(shí)，每 1 mL培養(yǎng)液中加入5 μL LY294002[3])。

2.2細(xì)胞形態(tài)觀察 細(xì)胞爬片，常規(guī)培養(yǎng)至融合度達(dá)60%～80%，用鑷子將玻片取出。用預(yù)冷的PBS沖洗3次。4%多聚甲醛固定10 min。PBS沖洗、晾干后，將蓋玻片細(xì)胞面貼于載玻片上，于倒置顯微鏡下觀察。拍照、記錄。

2.3免疫熒光法檢測(cè)E-cadherin和N-cadherin的表達(dá) A549/DDP細(xì)胞經(jīng)PBS沖洗后，4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.5% Txiton X-100 處理20 min，PBS沖洗，山羊血清室溫封閉30 min。I 抗[E-cadherin(1∶200稀釋)和 N-cadherin(1∶200稀釋)]4 ℃過(guò)夜，次日，PBS沖洗后，II 抗避光孵育2 h，DAPI常溫孵育5 min，PBS沖洗，用含抗淬滅劑的封片劑封片。

2.4Western blot法檢測(cè)蛋白水平 采用RIPA∶PMSF(100∶1)裂解液，冰上操作，離心提取蛋白。采用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。按30 μL體積上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。I 抗孵育[GSK-3β和p-GSK-3βSer9(1∶1 000)；Akt、p-Akt、Snail、E-cadherin和N-cadherin(1∶500)；β-actin(1∶1 000)]，4 ℃過(guò)夜。次日，II 抗室溫下孵育2 h后，發(fā)光、拍照，Quantity One凝膠圖像分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TGF-β1誘導(dǎo)前后細(xì)胞形態(tài)的變化

如圖1所示，經(jīng)TGF-β1作用后，細(xì)胞變得更加狹長(zhǎng)，呈紡錘形，細(xì)胞間無(wú)成簇分布的現(xiàn)象，細(xì)胞間連接較為松散，失去上皮細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)。

Figure 1. The morphological changes of the A549/DDP cells treated with TGF-β1observed under microscope (×200; scale bar=5 μm).

圖1各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

2 免疫熒光檢測(cè)TGF-β1對(duì) A549/DDP 細(xì)胞E-cadherin和N-cadherin表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示E-cadherin和N-cadherin主要定位于A549/DDP細(xì)胞的胞漿和胞膜。經(jīng)5 μg/L TGF-β1作用48 h后，標(biāo)記E-cadherin的綠色熒光明顯減少，僅見(jiàn)微弱的熒光；相反，N-cadherin的表達(dá)明顯增強(qiáng)，可見(jiàn)大量綠色熒光，見(jiàn)圖2。

Figure 2. The protein expression of E-cadherin and N-cadherin in all groups (×200; scale bar=5 μm).

圖2免疫熒光檢測(cè)E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達(dá)

3 Western blot檢測(cè)TGF-β1對(duì) A549/DDP 細(xì)胞E-cadherin和N-cadherin表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與TGF-β1(-) 組比較，TGF-β1(+) 組E-cadherin蛋白表達(dá)水平下降，N-cadherin表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

4 TGF-β1對(duì) A549/DDP 細(xì)胞Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3βSer9和Snail蛋白水平的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與TGF-β1(-) 組比較，TGF-β1(+) 組p-Akt、p-GSK-3βSer9和Snail的蛋白水平明顯增強(qiáng)，而用PI3K抑制劑LY294002作用48 h后， p-Akt、p-GSK-3βSer9和Snail的表達(dá)水平較TGF-β1(+) 組明顯下降(P<0.05)，各組間比較Akt和GSK-3β的表達(dá)水平無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖4。

討 論

EMT是上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，該現(xiàn)象由Greeburg等[4]在晶狀體上皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，并于1982年首次提出。發(fā)生EMT腫瘤細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)，細(xì)胞失去極性，細(xì)胞間連接減弱，伸出偽足，細(xì)胞獲得較高的移動(dòng)能力。同時(shí)，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin表達(dá)上調(diào)。發(fā)生EMT的細(xì)胞能夠在基底膜上生長(zhǎng)并穿透基底膜，提示EMT可能是腫瘤細(xì)胞突破基底膜的重要機(jī)制之一[5-6]。EMT與乳腺癌和結(jié)腸癌的細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞間黏附能力下降以及轉(zhuǎn)移灶的形成密切相關(guān)[7-8]。Shintani等[9]研究發(fā)現(xiàn)，EMT可能是非小細(xì)胞肺癌對(duì)紫杉醇和順鉑耐藥的重要原因。

Figure 3. The protein expression of E-cadherin and N-cadherin in all groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsTGF-β (-) group.

圖3Westernblot檢測(cè)E-cadherin和N-cadherin的蛋白表達(dá)

Figure 4. The protein levels of Akt, p-Akt, GSK-3β, p-GSK-3βSer9and Snail in all groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsTGF-β1(-) group;△P<0.05vsTGF-β1(+) group.

圖4Westernblot檢測(cè)Akt、p-Akt和GSK-3β、p-GSK-3βSer9和Snail的蛋白水平

TGF-β是目前EMT研究常用的誘導(dǎo)劑，被認(rèn)為是幾乎所用上皮細(xì)胞發(fā)生EMT必不可少的誘導(dǎo)因子[10-11]。TGF-β通過(guò)Smad和非Smad通路(PI3K/Aat、NF-κB和Wnt等)發(fā)揮效應(yīng)，誘導(dǎo)EMT發(fā)生[12]。大量研究PI3K/Akt 在腫瘤EMT過(guò)程中發(fā)揮舉足輕重的作用，該通路的激活可使GSK-3β第9號(hào)位點(diǎn)的絲氨酸被泛素化降解。人Snail序列中存在2個(gè)GSK-3β保守位點(diǎn)，GSK-3β與Snail結(jié)合使其磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)Snail在細(xì)胞內(nèi)的定位及穩(wěn)定性[13]。當(dāng)GSK-3(Ser9)磷酸化后，可解除對(duì)Snail的抑制作用，使得細(xì)胞內(nèi)Snail表達(dá)水平升高[14-15]。Snail是一類(lèi)含有鋅指結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合蛋白，可以識(shí)別E-cadherin啟動(dòng)子上游的E-box區(qū)域，抑制E-cadherin的基因表達(dá)，促進(jìn)EMT的發(fā)生[16-17]。

本研究結(jié)果顯示，TGF-β1處理后，A549/DDP細(xì)胞發(fā)生間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化，及EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)的變化，提示TGF-β1促進(jìn)A549/DDP細(xì)胞EMT的發(fā)生。各組Akt和GSK-3β蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異，而TGF-β1處理后，p-Akt、p-GSK-3βSer9和Snail的表達(dá)水平上調(diào)，同時(shí)添加PI3K抑制劑LY294002可下調(diào)p-Akt、p-GSK-3βSer9和Snail的表達(dá)，提示TGF-β1并不影響Akt和GSK-3β的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，而是通過(guò)影響磷酸化水平改變其活性，進(jìn)而提高Snail的表達(dá)水平，促使EMT發(fā)生。

綜上所述，TGF-β1可能通過(guò)Akt/GSK-3β/Snail信號(hào)通路誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞EMT發(fā)生，進(jìn)而影響細(xì)胞擴(kuò)散及侵襲能力，該通路可能是導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移及對(duì)順鉑耐藥的重要環(huán)節(jié)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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