STMN1在宮頸癌中表達(dá)的臨床意義及抑制其表達(dá)對(duì)宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞活力和凋亡的影響*

柴芝紅，應(yīng)靈瀟，潘一紅，蔡仙麗，孔為民

(1臺(tái)州市立醫(yī)院婦科， 2臺(tái)州市中心醫(yī)院婦科， 浙江 臺(tái)州318000； 3首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦瘤科， 北京 100006)

宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤，目前在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化，對(duì)女性的生命及健康造成了嚴(yán)重的威脅[1]。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及表觀遺傳學(xué)改變、免疫改變、抑癌基因失活及癌基因激活等多階段、多基因的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程。因此，從分子水平上研究宮頸癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)于治療具有重要意義。微管解聚蛋白1(stathmin 1，STMN1)是近些年研究較多的一種能夠在細(xì)胞有絲分裂和分裂間期使微管動(dòng)力學(xué)改變的小分子磷蛋白，在大部分正常組織中有表達(dá)，在多種腫瘤中過表達(dá)，主要參與調(diào)控微管的動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)而影響多種生理病理過程[2]。有研究顯示，胃癌中STMN1的過表達(dá)與分化程度呈現(xiàn)正相關(guān)[3]；結(jié)腸癌中STMN1的陽(yáng)性表達(dá)與TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤位置及分化程度無關(guān)[4]；也有研究發(fā)現(xiàn)，抑制STMN1的表達(dá)可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，且增強(qiáng)對(duì)化療藥物的敏感性[5]。但目前關(guān)于STMN1對(duì)宮頸癌的影響尚未清楚。因此，本研究首先檢測(cè)了STMN1在宮頸癌中的表達(dá)，并分析與臨床指標(biāo)的關(guān)系，并通過RNA干擾抑制其表達(dá)后檢測(cè)細(xì)胞的增殖和凋亡情況，為宮頸癌的治療提供理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 組織樣本

選取浙江臺(tái)州市立醫(yī)院醫(yī)院在2014年6月～2015年8月期間手術(shù)切除的宮頸癌標(biāo)本80例，所有標(biāo)本均經(jīng)過病理證實(shí)，且術(shù)前均未行放療、化療或生物治療。其中鱗癌為70例，腺癌為10例，年齡為25～68歲，平均年齡為41.5歲。按照FIGO，2009標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，ⅠB1期、ⅡB2期、ⅢB3期和ⅣB4期分別為24例、16例、24例和16例；低分化和高分化分別為28例和52例；有盆腔淋巴轉(zhuǎn)移及無盆腔淋巴轉(zhuǎn)移分別為24例和56例。另取15例癌旁組織作為對(duì)照。

2 試劑和儀器

宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基和MTT試劑盒均購(gòu)自Sigma； LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Gibco；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；全蛋白提取試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒和膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細(xì)胞凋亡試劑盒均購(gòu)自中國(guó)碧云天試劑公司；抗STMN1、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、p-STAT3和survivin抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology。酶標(biāo)儀購(gòu)自BioTek；流式細(xì)胞儀購(gòu)自Becton Dickinson。

3 方法

3.1宮頸癌組織中STMN1的表達(dá) 按照全蛋白提取試劑盒的說明提取宮頸癌及癌旁組織中的總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，上樣緩沖液與蛋白樣品按照1∶4的比例充分混合均勻，沸水中煮沸5 min進(jìn)行變性，每孔中40 μg蛋白樣品行10% SDS-PAGE，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，10%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，洗膜，加抗STMN1(1∶5 000稀釋)和GAPDH(1∶2 000稀釋) I 抗，4 ℃孵育過夜，洗膜，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔(1∶2 000稀釋)II 抗，室溫孵育1 h，洗膜，增強(qiáng)型化學(xué)法(ECL)檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡，顯影、定影后晾干保存。

3.2細(xì)胞培養(yǎng) SiHa細(xì)胞在37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下，用含10%胎牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.3實(shí)驗(yàn)分組及STMN1-siRNA的轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為3組：(1)正常對(duì)照(control)組：細(xì)胞不經(jīng)特殊處理；(2)陰性對(duì)照(negative control，NC)組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染合成的陰性siNRA；(3)STMN1-siNRA組：細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染合成的STMN1-siNRA。以每孔1×105的密度將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到60%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，siRNA的轉(zhuǎn)染濃度為每孔中100 nmol/L，轉(zhuǎn)染終體積為每孔中加入培養(yǎng)基2 mL。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后，將培養(yǎng)基換為含有10%胎牛血清的PRMI-1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。

3.4STMN1、STAT3、p-ATAT3和survivin蛋白表達(dá)檢測(cè) 參照方法3.1。

3.5MTT法測(cè)定細(xì)胞活力 以1×108/L的密度將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa細(xì)胞接種于96孔板中，每孔中加入100 μL，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后，按照3.3分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，每孔中加入MTT溶液20 μL (5 g/L)，培養(yǎng)4 h后每孔中加入150 μL的DMSO溶液終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀中振蕩10 min，檢測(cè)490 nm各個(gè)孔的吸光度(A)值，每組4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，用0.25 %的胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心，PBS漂洗細(xì)胞1次，棄上清，加入100 μL的PBS重懸細(xì)胞，再分別加入Annexin V-FITC和PI試劑各5 μL，輕輕混勻，置于室溫環(huán)境中避光反應(yīng)30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

3.7細(xì)胞活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的檢測(cè) 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，依照中國(guó)碧云天試劑公司ROS檢測(cè)試劑盒操作說明，上流式細(xì)胞儀前0.5 h，所有孔中加入適量的2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)，孵箱孵育，0.5 h后將沒孔的細(xì)胞消化收集至15 mL的離心管中，離心，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞1次，棄上清，加入200 μL的PBS重懸細(xì)胞，移入流式管中，流式細(xì)胞儀在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)和525 nm發(fā)射波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)的ROS水平呈現(xiàn)正相關(guān)，以此反映細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料用n(%)表示，其統(tǒng)計(jì)推斷采用χ2檢驗(yàn);計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組差異比較采用單因素方差分析，多重比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 宮頸癌組織中STMN1的蛋白表達(dá)

Western blot檢測(cè)宮頸癌組織中STMN1的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，宮頸癌組織中STMN1的蛋白表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.01)，見圖1。

2 STMN1的表達(dá)對(duì)宮頸癌臨床指標(biāo)的影響

由表1可知，STMN1的表達(dá)與宮頸癌患者年齡和組織學(xué)分型無關(guān)，而與臨床分期、組織學(xué)分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。

Figure 1. The protein expression of STMN1 in the cervical can-cer tissues. Mean±SD.n=80.*P<0.05vsadjacent tissue.

圖1STMN1在宮頸癌中的蛋白表達(dá)

表1STMN1的表達(dá)對(duì)宮頸癌臨床指標(biāo)的影響
Table 1. The relationship between protein expression of STMN1 and clinical indicators of cervical cancer (n=80)

Clinical indicatornSTMN1 positive (%) 2PAge (year) ≤402286.4 (19)0.036>0.05 >405887.9 (51)Histological type Squamous-cell car- cinoma7088.6 (62)0.018>0.05 Adenocarcinoma1090.0 (9)Clinical stage Ⅰ2450.0 (12)12.742 <0.05 Ⅱ1668.8 (11) Ⅲ2491.7 (22) Ⅳ1687.5 (14)Differentiation degree Poorly 2892.9 (26)5.826<0.05 Well 5269.2 (36)Lymph node metastasis Yes2475.0 (18)8.571<0.05 No5696.4 (54)

3 STMN1在轉(zhuǎn)染STMN1-siRNA的細(xì)胞中的表達(dá)

NC組STMN1的蛋白表達(dá)與control組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，而STMN1-siRNA組STMN1的蛋白表達(dá)顯著低于control組(P<0.01)，見圖2。

Figure 2. The protein expression of STMN1 in the SiHa cells transfected withSTMN1-siRNA. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2STMN1在轉(zhuǎn)染STMN1-siRNA細(xì)胞中的表達(dá)

4 各組細(xì)胞活力及凋亡的檢測(cè)結(jié)果

MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，與control組比較，STMN1-siRNA組的細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01)，凋亡率顯著升高(P<0.01)，見圖3、表2。

Figure 3. The apoptosis of the cells in each group analyzed by flow cytometry.

圖3各組細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)分析

表2各組細(xì)胞的活力及凋亡率情況
Table 2. The viability and apoptotic rate of the cells in each group (Mean±SD.n=3)

GroupA valueApoptotic rate (%)Control 0.926±0.0872.46±0.25NC0.905±0.0742.37±0.28STMN1-siRNA 0.441±0.036?9.87±0.54?

*P<0.05vscontrol group.

5 各組細(xì)胞ROS含量的檢測(cè)結(jié)果

DCFH-DA熒光探針檢測(cè)結(jié)果表明，STMN1-siRNA組ROS的含量顯著高于control組(P<0.01)，見圖4。

Figure 4. The ROS content in each group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖4各組細(xì)胞的ROS含量

6 各組細(xì)胞STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果

Western blot結(jié)果表明，STMN1-siRNA組p-STAT3和survivin的蛋白水平均顯著低于control組(P<0.01)，見圖5。

討 論

STMN1基因定位于人1p36.1染色體，其蛋白是一種能夠在細(xì)胞有絲分裂及分裂間期使微管的動(dòng)力學(xué)改變的小分子磷蛋白，參與細(xì)胞的增殖、微管動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及周期調(diào)控等過程[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，STMN1與多種腫瘤的臨床病理特征及生物學(xué)行為密切相關(guān)[7]。但關(guān)于STMN1對(duì)宮頸癌臨床病理特征的影響還未清楚，本研究通過Western blot檢測(cè)到宮頸癌中STMN1的蛋白表達(dá)升高，與臨床參數(shù)間的關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，STMN1的表達(dá)與宮頸癌患者年齡和組織學(xué)分型無關(guān)，而與臨床分期、組織學(xué)分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。非小細(xì)胞肺癌中STMN1的表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與性別、年齡、TNM分期、腫瘤大小和組織類型無關(guān)[8]；乳腺癌中STMN1的過表達(dá)與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[9]；肉瘤中STMN1的高表達(dá)與腫瘤的遷移及復(fù)發(fā)也存在一定的關(guān)系[10]。本研究結(jié)果與一些研究者在其它腫瘤中的研究結(jié)果是相似的。

Figure 5. The protein levels of STAT3, p-STAT3 and survivin in each group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖5各組細(xì)胞中STAT3、p-STAT3和survivin的蛋白表達(dá)

有研究表明，腫瘤細(xì)胞中STMN1參與了細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移和分化等過程，是近些年來備受關(guān)注的用于腫瘤檢測(cè)、預(yù)防和治療的標(biāo)志基因[11]。白血病細(xì)胞中抑制STMN1的表達(dá)可降低細(xì)胞在活體中的致瘤特性[12]。STMN1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖凋亡的影響還未清楚。RNA干擾技術(shù)能使內(nèi)源性mRNA降解，引起特定基因在轉(zhuǎn)錄后發(fā)生沉默，具有高度特異性及穩(wěn)定性，目前在基因功能研究及腫瘤治療中得到廣泛應(yīng)用[13]。本研究中通過RNA干擾技術(shù)沉默宮頸癌中STMN1基因的表達(dá)，檢測(cè)細(xì)胞增殖及凋亡情況，發(fā)現(xiàn)STMN1的表達(dá)受到抑制后宮頸癌細(xì)胞的增殖明顯降低，凋亡率增加。這提示STMN1可能是宮頸癌檢測(cè)、預(yù)防和治療的標(biāo)志物。

ROS的累積程度可決定細(xì)胞的生存狀態(tài)，適量的累積可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活，而過度的ROS累積，可導(dǎo)致細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞的損傷乃至死亡，宮頸癌中ROS水平升高可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制STMN1的表達(dá)可提高宮頸癌中ROS水平。STAT3是一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的核轉(zhuǎn)錄因子，可通過調(diào)控影響細(xì)胞增殖、凋亡、分化和生存相關(guān)的基因而促進(jìn)腫瘤的增殖、血管生成，并阻滯細(xì)胞的凋亡，呈現(xiàn)出強(qiáng)的致癌作用[15-16]。目前在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)STAT3蛋白的異常激活[17]。這也提示STAT3可能是腫瘤治療的靶點(diǎn)。有研究指出，下調(diào)STAT3可降低宮頸癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[18]。作為一個(gè)癌基因，STAT3本身并不引起癌變，而是通過激活影響凋亡的survivin、細(xì)胞周期的cyclin D1等靶基因而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生[19]。本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌中STMN1的表達(dá)受到抑制后，磷酸化的STAT3及survivin的表達(dá)降低。這說明STMN1對(duì)宮頸癌細(xì)胞的影響可能通過提高ROS水平及STAT3信號(hào)表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

綜上所示，STMN1在宮頸癌中高表達(dá)，其表達(dá)與宮頸癌患者年齡和組織學(xué)分型無關(guān)，而與臨床分期、組織學(xué)分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，抑制STMN1的表達(dá)后宮頸癌細(xì)胞增殖受到抑制，凋亡增加，ROS水平升高，STAT3信號(hào)通路表達(dá)受到抑制。本研究初步證實(shí)了STMN1對(duì)宮頸癌臨床病理特征及生物學(xué)特性的影響，并進(jìn)一步研究了可能的分子機(jī)制。接下來的實(shí)驗(yàn)將致力于宮頸癌的其它生物學(xué)特性，以期為STMN1在宮頸癌的診治提供理論幫助。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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